本申请是申请日为2002年12月2日，申请号为02154843.9，名 称为“用以制造樟芝培养物的方法以及由所述方法获得的产物”的专 利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及建立一种适于从一樟芝(Antrodia camphorata)培养物 中大规模地制造出具药理活性之滤出物的培养条件，具体地，该培养 条件是藉由令培养期间的振荡速率及/或pH值最佳化来建立。本发明 亦涉及一种经由一系列部分分离过程而从一樟芝培养物中获得具药理 活性之组合物的方法。本发明亦涉及利用前述组合物来制备药学组合 物。
背景技术
樟芝(Antrodia camphorata)[(Zang & Su)S.-H.Wu，Ryvarden & T.T.Chang]，在台湾亦被称为「牛樟芝」或「牛樟菇」，近来已被 报导为一个新的真菌菌种，其特征在于出现在子实体(fruit bodies)上的 圆柱状担孢子(basidiospores)、微类淀粉质之骨骼菌丝、具苦味、淡肉 桂色扁平状至伞状之担子果(basidiocarps)，以及在纯质培养基中之厚 膜孢子(chlamydospores)与节孢子(arthroconidia)。此种真菌之生长极为 缓慢，且限于台湾地方所特有的树种-牛樟(Cinnamomum kanehirai Hay (Lauraceae))-作为唯一的宿主。樟芝之详细特性与分类地位被叙述于 Chang，T.T.et al.，Antrodia cinnamomea sp.nov.on Cinnamomum kanehirai in Taiwan，Mycol.Res.99(6)：756-758(1995)and Wu，S.-H.，et al.，Antrodia camphorata(″niu-chang-chih″)，new combination of a medicinal fungus in Taiwan，Bot.Bull.Acad.Sin.38：273-275(1997)，该 等文献之全部揭露内容是被纳入于此作为参考资料。
在台湾民俗医学上，樟芝的子实体被认为对于中毒、腹泻、腹痛、 高血压、皮肤搔痒及肝癌所引起的症状具有某种医药功效。然而，由 于严苛的宿主专一性(host specificity)与在自然界中的稀有性，以及在 人工栽培上的失败，所以「牛樟芝」在市面上极为昂贵。无疑地，发 展出大规模人工培养此种真菌的低成本制法是极具产业价值的。
目前，本案发明人已发现樟芝于浸没式发酵培养时可展现出所希 望的药理活性，特别是抗肿瘤活性。如美国专利申请案第09/566,834 号所揭露者，樟芝已被成功地小规模培养于诸如马铃薯右旋糖培养液 (PDB)以及含有果糖作为主要碳源的合成培养基内。利用杭特氏座标 系(Hunter′s coordinate system)进行测量，所得培养物显现出红色度指 标为a≥3的暗红色外观，而此色泽与对于某些肿瘤细胞品是之生长 的显着抑制效应相关。更重要的是，作用于肿瘤细胞的活性成份虽然 仍未被鉴定出，但已被发现能从真菌菌丝体分泌至培养物之液相中， 使得从培养物中能轻易地获取具药理活性之组合物，以供产业利用。
因此，若此一有利之方法能被最佳化以供用于大量制造真菌培养 物，当是极为希望的。更优选为针对一希望药理活性来部分分离粗制 滤出物，以获得富含所希望活性的有用组合物。
发明内容
为符合前述产业需求，本案发明人已进行延伸性的研发工作。现 已令人意想不到地发现，可藉由审慎地将某些参数设定于特定范围内 而获致一种供用于在工业规模上培养樟芝的最佳条件。本发明发现， pH值与振荡速率为培养期间的关键因素。
因此，本发明之第一实施方案是提供一种用以制造具有药理活性 之樟芝培养物的方法，其包含：
(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长 的培养基中，以获得第一培养物；
(b)令从步骤(a)培养而得之第一培养物接受被设定在第一预定速 率下的第一振荡阶段，历时一段可令被接种之分离株进一步生长的时 间，以获得一增殖有菌丝体的第二培养物；以及
(c)令得自于步骤(b)之第二培养物接受被设定在不同于第一预定 速率之第二预定速率下的第二振荡阶段，令该分离株处于生理压力 下。
依据本发明之第二实施方案，其是提供一种用以制造具有药理活 性之樟芝培养物的方法，其包含：
(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长 的培养基中；以及
(b)将得自于步骤(a)之培养物予以培养，藉由在整个步骤(b)期间 将培养物之pH值调整至pH4.5至5.4的范围内。
优选地，樟芝培养物的pH值在整个步骤(b)期间被调整至pH4.6 至5.3之范围内，且更优选为pH4.7至5.2之范围内。
本发明亦提供一种用以获得一系列液态分离部分的方法，该等分 离部分是针对一诸如抗肿瘤活性的希望药理活性而从樟芝培养物中分 离出。因此，本发明之第三实施方案是提供一种用以从樟芝培养物获 得一具有药理活性之组合物的方法，其包含：
(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长 的培养基中；
(b)将步骤(a)所得之培养物予以培养；以及
(c)从该培养物中移除大部分的不溶性物质，从而获取一具有药 理活性的溶液；以及
(d)将步骤(c)所得之溶液予以处理，以获得含有分子量不超过约 10kDa之真菌分子的药理活性组合物。
优选地，所获得之组合物含有具分子量不超过约3kDa且更优选 为不超过约1kDa之真菌分子。
本发明之第四实施方案是提供一种用以从樟芝培养物获得具有药 理活性之组合物的方法，其包含：
(a)将一樟芝分离株的菌丝体接种源接种在一适于该分离株生长 的培养基中；
(b)将步骤(a)所得之培养物予以培养；
(c)从该培养物中移除大部分的不溶性物质，从而获取一具有药 理活性的溶液；
(d)将步骤(c)所得之溶液予以处理，以获得含有分子量不超过约1 kDa之真菌分子的分离部分；以及
(e)令步骤(d)所得之分离部分通过一水不混溶相，并从该水不混 溶相获得该具药理活性的组合物。
前述步骤(e)中之水不混溶相是优选为一含有有效量之吸附剂的 固定相，该吸附剂能选择性地吸附疏水性真菌分子。将该固定相予以 洗脱，以获得具有药理活性的分离部分。
在本发明一个优选实施方案中，令步骤(e)所得之洗脱物进一步 接受逆相分配层析，如在LichrosorbR RP-18柱(Merck)中进行，以获 得数个具有药理活性的分离部分。
本发明更提供数种药学组合物，以供治疗癌症或肿瘤疾病，该等 药学组合物含有依据本发明之任一方法所得的产物。
本发明更提供一种用以在需治疗之病人体内治疗癌症或肿瘤疾病 的方法，该方法是藉由将一个含有依据本发明之任一方法所得之产物 的组合物处方给该病人。
附图说明
经由下列优选实施例的叙述并参照附图，本发明之前述与其他目 的以及技术特征将变得显明，其中：
图1显示出源自于樟芝培养物之滤出物的抗肿瘤活性，其中樟芝 被培养在两种不同的振荡条件下；
图2显示出三个樟芝培养物在培养期间内的pH值变动；
图3显示出源自于图2所示樟芝培养物之滤出物的抗肿瘤活性， 其中樟芝是培养在被控制于三个不同区段内的pH值下；
图4显示出源自于放大规模樟芝培养物之滤出物的抗肿瘤活性；
图5为一流程图，其显示出一樟芝滤出物针对分子量进行纯化的 流程；
图6为一柱状图，其显示依据图5所分离出之培养物滤出物的抗 肿瘤活性，其中受测细胞株包括有MRC-5、HeLa、AGS、Hep G2以 及MCF-7；
图7为一柱状图，其将以AmberliteR XAD-4从一滤出物分离部 分所分离出之分离部分的抗肿瘤活性予以比较，该滤出物分离部分含 有分子量不超过约1kDa之真菌分子，其中受测细胞株包括有MRC- 5、HeLa、AGS、Hep G2以及MCF-7；
图8为图7之乙酸乙酯洗脱物在一个LichrosorbR RP-18柱中进 行部分分离的光谱曲线；以及
图9-11显示图8中所分离出数个分离部分的抗肿瘤活性。
具体实施方案
本发明是大致关于建立一种适于从一樟芝培养物中大规模地制造 出具药理活性之分离部分的培养条件。依据本发明，樟芝此种真菌被 培养在一适合之液态培养基内，以维持其在菌丝体状态下进行营养生 殖，并促进其药理活性。
在本说明书中，「适合之培养基」此用语意指任何可以提供适于 樟芝生长之人工环境并维持其药理活性的培养基。优选地，本发明所 使用之培养基适于促使菌丝体中生成具药理活性之物质，并促使该(等) 物质分泌至胞外。
适用于本发明之培养基包括被称为「马铃薯右旋糖培养液(potato dextrose broth)」的天然培养基，以及任何含有果糖作为主要碳源的 合成培养基。马铃薯右旋糖培养液可藉由诸如将一由300.0克切成丁 状之马铃薯、20.0克右旋糖与1.0升蒸馏水所构成的混合物予以湿热 灭菌，而在实验室中制备，抑或是购自于诸如DIFCO等商业来源。
最佳之培养基为任何含有果糖作为主要碳源的合成培养基。若有 需要，葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖、玉米淀粉及麦芽萃出物等其他 碳源以及此等之组合亦可被囊括于合成培养基中，以作为助剂。优选 地，以该合成培养基之总体积为基准，该碳源优选在1.5至2.5重量 ％之范围内，且更优选为呈1.5至2重量％之含量。
除了碳源以外，合成培养基可包含有氮源、微量元素(诸如无机 盐)，以及任选之维生素或其他生长因子。氮源包括但不限于硫酸铵、 硝酸铵、硝酸钠、酪蛋白氨基酸(casamino acid)、酵母膏、蛋白胨(peptone) 及胰胨(tryptone)以及此等之组合。优选地，依据本发明，该合成培 养基是含有酵母膏作为氮源。以该合成培养基之总体积为基准，该氮 源优选在0.2至2.0重量％之范围内，且更优选为呈0.5重量％之含量。
依据本发明，任何可得之樟芝分离株均可供用于培养方法中，只 要所使用之微生物具有生成可检测量之具药理活性代谢物的能力。可 供使用之樟芝分离株包括有但不限于CCRC 35396(1994年12月1日 被寄存于食品工业发展研究所(台湾新竹市)之菌种保存及研究中心 (CCRC)、35398(1994年12月1日)、35716(2000年5月3日)、36401(2000 年1月27日)、36795(2000年1月27日)以及930032(2000年1月27 日)。依据本发明之一优选实施方案，樟芝CCRC 930032被用以制备 培养物滤出物，该分离株亦以寄存编号PTA-1233被寄存在美国典型 培养物保藏中心(ATCC)，以作为专利程序之用。
为评估对于肿瘤细胞生长的抑制能力，令樟芝之粗制滤出物及其 分离部分接受MTT比色分析。
使用于本说明书之用语「MTT比色分析(MTT colorimetric assay)」 或「MTT-四氮唑分析(MTT-tetrazolium assay)」是指在1980年代， 由美国国家癌症研究所癌症治疗部门之发展性治疗计划所构建的一个 抗癌药剂筛选流程(请参见诸如Alley，M.C.，et al.，Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.Cancer Res.48：589-601，1988；Scudiero，D.A.，et al.， Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines.Cancer Res.48：4827-4833，1988；Vistica，D.T.，et al.，tetrazolium-based assays for cellular viability：a critical examination of selected parameters affecting formazan.Cancer Res.51：2515-2520，1991；Monks，A.，et al.， Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines.J.Nat.Cancer Inst.83：757-766，1991)。
在此分析中，具潜力之抗癌药剂抑或源自于植物或微生物的天然 产物(在此例中，即为源自于该五个樟芝分离株)被测试其对抗数组细 胞株的能力，各组细胞株是代表人类恶性肿瘤的一种主要临床分类。 每个孔的活细胞数目是与甲(formazan)的生成量成正比，甲经 由溶解化而被光谱仪所测量。原则上，生物活性物质或含有此等物质 的天然产物可以抑制或甚至停止细胞生长，因而仅形成少量的甲 利用MTT比色分析，可检视诸如振荡速率及pH值等在真菌培养上 之重要参数，以评估此等参数在培养期间对于樟芝之药理活性的效 应。
在第一组实验中，将一樟芝培养物分成两份，并令之分别经历二 个不同的振荡流程，其中一流程是被实行来将一恒定且剧烈的振荡施 加至真菌，而另一流程则为从温和至剧烈的两阶段振荡。经比较后， 依据本发明之两阶段振荡可致使药理活性的早期产生。提供第一阶段 的温和振荡是为获致被接种之真菌的营养生殖，以获得培养生殖之菌 丝体。培养结束时所获取之菌丝体沉淀(mycelial pellets)的增大尺寸可 用以指出温和振荡阶段的成功与否。将振荡速率从温和转换为剧烈的 适当时机会依据选定之真菌分离株而定，而在广泛之范围变化。一般 而言，当依据培养物之最终体积为基准而以10％ v/v之量来接种一真 菌分离株时，温和振荡可持续进行约3天(或约72小时)，随后再升 高振荡速率。提供后续阶段的剧烈振荡是令真菌处于生理压力下。在 此一压力下，会迫使樟芝加以因应而进行数个生理变化，包括促进不 以恒定方式表现之二次代谢物的生成。据信，某些具有生理活性之真 菌分子可藉由此种方法被「压迫而产出」。可将生理压力施加至樟芝 的其他培养参数，诸如通气速率、营养调整及热压力等，亦可单独地 运用或与本发明之振荡速率此参数合并运用。适当的振荡速率可参照 前述内容进行实验而测得，抑或是基于后述数据而依据诸如1995年 由Pauline M.Doran所编纂并由Academic Press Ltd.出版之Bioprocess Engineering Principles此书第150至151页中所述方程式来进行估计。 在某些情形下，当妥适地施加两阶段振荡时，真菌培养物会在第6天 时转变为红色。
在本发明之一优选实施方案中，两阶段振荡是在一具预置有3升 培养基的5升发酵槽(B.Braun)中进行，其中振荡于开始时是被设定 在一为不超过约300rpm且优选为约200rpm之速率下，随后升高至 一为不超过约400rpm且优选为约500rpm之速率下。在本发明之另 一优选实施方案，两阶段振荡是在一具预置有160升培养基之250升 发酵槽(Bio-Top)中进行，其中该振荡速率于开始时被设定在约40rpm 下，随后升高至约150rpm。
在第二组实验中，将一樟芝培养物分成三份，并于整个培养期间 分别培养在被控制于三个不同区段内的pH值下。经比较后，发现于 pH4.5至5.4下所进行之培养可致使药理活性的早期产生。优选地， 樟芝培养物的pH值是在整个培养期间内被调整为pH4.6至5.3且优 选为pH4.7至5.2之范围内。
藉由前述关于振荡及pH值等有用参数，依据本发明之樟芝培养 法可成功地被扩大规模至160升之体积，并同时维持由该真菌所衍生 出之希望药理活性。
依据本发明之方法，一可供各种产业用途之具药理活性滤出物能 以一经济、有效率且省时之方式从樟芝获得。
本发明亦涉及建立一种可操作的纯化方法，藉此，可获得数种被 增富有具药理活性物质的新组合物，以供各种医药用途。依据本发明， 该纯化方法是藉由将一樟芝之粗制滤出物选择性地加以分离来进行， 以获得一含有分子量不超过约10kDa、优选为不超过约3kDa且更 优选为不超过约1kDa之真菌分子的分离部分。该分离方法可藉由以 分子量为基础来分离分子(即分子筛)的任何常规方法来进行，该种方 法的例子包括凝胶过滤法、密度梯度纯化法、超过滤法、超高速离心 法以及其他类似的常规方法。
依据本发明，含有分子量不超过约1kDa之分子的分离部分是以 极性为基础而被进一步部分分离，以获得一水不混溶相，并从之获得 具药理活性之分离部分。该水不混溶相可为一不溶性固相或一不与水 混溶之有机相。在本发明之一优选实施方案中，令该≤1kDa分离部 分通过一含有有效量之吸附剂的固定相，该吸附剂能选择性地吸附疏 水性真菌分子。随后，将该固定相予以洗脱，以获得一具有希望药理 活性之分离部分。简言之，该固定相从该≤1kDa分离部分中选择性 地获取并浓缩据信含有希望之具药理活性物质的疏水性溶质，以使得 位于流经液(flow through)内的不具活性物质能被移除。适于含纳于固 定相中之吸附剂可为带有适于从一流动相中捕集疏水性物质之官能团 的任何吸附剂。该种吸附剂之例子为AmberliteR XAD-4(Sigma)与其 等效物。该部分分离可藉由任何习用方式来运作，诸如将该≤1kDa 分离部分与一批料之吸附剂共同培育，抑或是令该≤1kDa分离部分 流经一填充有吸附剂的层析柱，只要具药理活性物质被留置于吸附剂 表面之含量是令人满意的。用以从固定相中洗脱出被结合物质的适当 洗脱剂(eluent)是为本领域所熟悉的，因而可被本领域技术人员所容 易地选定。优选地，该洗脱剂为一具有低于水之极性的有机溶剂，且 更优选为具有一低于甲醇之极性的有机溶剂。最佳之洗脱剂包括乙酸 乙酯及乙醇。
可令展现出希望药理活性之洗脱物(eluate)接受以其他物理、化学 或生物特性为基础的额外纯化程序。在本发明之一优选实施方案中， 洗脱物以疏水性程度为基础被进一步分离，更优选为该分离是实施于 一诸如LichrosorbR RP-18柱(Merck)及其等效物中。所得之数个分离 部分被发现具有药理活性。
前述发现强烈地暗示着，樟芝之药理活性主要源自于具有分子量 不超过1kDa之疏水性化合物。此发现恰与先前的一个假说相反，在 该假说中，具有一为500至2,000kDa之平均分子量的多糖被认定为 蕈类所拥有之抗肿瘤活性的主要来源(Mizuno，et.al.，Antitumor-active substances from mushrooms.Food Rev.Intl.11(1)：23-61)。虽然樟芝经 报导为富含有诸如三萜、类黄酮(flavinoids)、类固醇、倍半萜内酯 (sesquiterpene lactones)以及苯基与二苯基化合物等低分子量物质 (Chang，supra；Chemg，et al.，Triterpenoids from Antrodia cinnamomea. Pytochem.41(1)：263-267(1996)；Chiang，et al.，A sesquiterpene lactone， phenyl and biphenyl compounds from Antrodia cinnamomea.Pytochem. 39(1)：613-616(1995)；以及Yang，et.al.，Steroids and Triterpenoids of Antrodia cinnamomea a fungus parasitic on Cinnamomum Micranthum. Pytochem.41(5)：1389-1392(1996))，但是，没有任何经报导之教示内 容资以将此等物质与该真菌之药理活性相联系。
依据本发明之纯化方法提供数种组合物，其中活性物质被浓缩且 不具活性之物质被进一步移除。该等组合物显然对于人类或动物个体 具有增进之药理有效性，因而适供用于诸如制造药学组合物或营养补 充品等各种产业用途。是以，本发明亦涉及利用所述新组合物作为在 需要接受治疗之人类或动物个体中治疗疾病(特别是癌症或肿瘤疾病) 的药物，抑或是作为一种被配制成诸如食品、饮料及/或动物饲料等 形式之营养补充品。
下列实例仅供用于例示本发明，而非意欲限制本发明之范围。
实施例1：樟芝液体培养物之制备
樟芝分离株CCRC 930032之原始培养物是被维持在-80℃下，从 该原始培养物移出少量真菌，置入马铃薯右旋糖琼脂平盘培养基 (PDA，购自于Difco)上。待真菌恢复活力后，将培养物移至马铃薯 右旋糖琼脂斜面培养基。将斜面培养基培育在25℃下，并每二个月 进行继代培养一次。该等斜面培养基是供用作为操作用培养物 (working cultures)。为制备菌丝体接种源，将源自于PDA斜面培养基 之培养物接种于PDA平板上，并在28℃下培育15至20天。
菌丝体接种源之制备
将真菌予以培养，直至观察到菌丝群落具有一为15至30毫米之 直径为止。在一光学显微镜下检验樟芝的菌丝体特征，以确保其未被 污染。将整个菌丝体切成小块，随后在无菌状态下，于均质机(Osterizer) 中，利用50ml之无菌水将菌丝体予以均质化，历时30秒。菌丝体 悬浮液之分量可供用作为浸没式摇瓶培养的接种源。在500ml之厄 氏锥瓶(Erlenmeyer flasks)内中预先置入一合成培养基(2％果糖、0.5％ (w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v) 之MgSO4·7H2O(Merck))，再将该接种源以1∶9之体积比加入该合 成培基内。在30℃下，将该浸没培养物予以培育5天，并施以恒定 振荡(在一得自于Hotech之旋转式振荡机上以50rpm之速率进行振 荡)。所得之培养物用作为后续大规模培养的接种源。
实施例2：振荡速率对于真菌滤出物之药理活性的影响
在5升发酵槽(B.Braun)内中预先置入2.7升合成培养基(2％果 糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及 0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再将实施例1中所制得之樟 芝CCRC 930032接种源以1∶9之体积比加入该合成培养基中。在30 ℃以及0.6升/分钟通气速率下培育该培养物。培养物振荡速率于开 始时被设定在约200rpm下，经培育74小时后，再升高至约500rpm。 在接种菌丝体后的第48、113、170、217及259小时，从培养物取样 获得数个样品，随后令该等样品通过一由过滤漏斗、锥瓶与抽气装置 所构成的简易过滤器装置，以移除大部分之不溶性物质。以氨水 (NH4OH)将所获得之滤出物的pH值调整至7，并进行湿热灭菌。将 所得样品保存于4℃下，以供后续MTT比色分析之用。
利用未经接种之培养基来作为MTT分析之负对照组。
选定Hep G2肿瘤细胞来进行MTT比色分析。进行分析之前， 将细胞维持在补充有10％小牛血清(Hyclone)之α-MEM培养基 (GIBCO BRL)，以作为原始培养物。该肿瘤细胞株是利用胰蛋白酶- EDTA(GIBCO BRL)使细胞由细胞培养锥瓶上脱离，而每周被继代一 或二次。获取肿瘤细胞，经计数后，再以3,000个细胞/孔之浓度接 种在一个96-孔微滴定板中。将各孔中之细胞培养基总体积补充至180 μl，并于37℃下，在一充有5％ CO2之培育箱中予以培育至隔日。
将三组各20μl分量之样品加入培养孔内，并在前述培育条件下 将培养物予以培育72小时。随后，将20μl以5mg/ml之浓度预先制 备在PBS溶液(GIBCO BRL)中之MTT(Merck)原液添加至各孔内。
在37℃下，于CO2培育箱中另行培育4小时后，移除各孔中之 上清液，并添加100μl之100％ DMSO(二甲亚砜，可得自于Sigma)， 以溶解MTT-甲产物。以一机械式平板混合器充分混合后，利用 ELISA阅读器(MRX，Dynex)来测量540nm下之吸光值。因此，受测 滤出物的肿瘤细胞相对存活率可藉由将各个实验组样品之吸光值除以 对应未经接种对照组之吸光值而得出。
比较例1：
重复实施例2，除了该真菌培养物是于整个培养期间被培育在一 为约500rpm之恒定速率下以外。
经实施例2与比较例1所得之滤出物处理后的肿瘤细胞相对存活 率，在表1及图1中加以比较。
表1 取样时间 (小时) Hep G2细胞之相对存活率(％) 比较例1 实施例2 48 63 79 113 62 48 170 35 16 217 24 18 259 19 19
在表1中，针对在指定时间点取样的滤出物对于Hep G2肿瘤细 胞的抑制效应进行比较。对于在菌丝体接种后的第170小时所取得的 滤出物而言，可见历经200rpm至500rpm之两阶段振荡的樟芝CCRC 930032能于MTT分析中获得16％之相对存活率，此数值远较在500 rpm之恒定速率下所培养的培养物更为有效，因为后者仅观察到35％ 之较高相对存活率。在后续的时间点(即第217与259小时)，实施例 2与比较例1的抗肿瘤活性会渐趋靠近，此暗示着由初始低速振荡与 后续阶段的高速振荡所构成之组合，将可致使培养物中之具药理活性 物质的早期生成。
利用AGS、HeLa及MCF-7等肿瘤细胞株进行相应实验，可在 MTT分析中观察到一致性的结果(结果未示出)。
实施例3：pH值对于真菌滤出物之药理活性的效应
制备三个具有分别为约4.5(试验A)、5.0(试验B)及5.5(试验C) 之初始pH值的合成培养基批料(1.5％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏 (DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v)之 MgSO4·7H2O(Merck))，并将实施例1所制得之接种源以1∶9之体积 比加入该等合成培养基中。将所得培养物依实施例2所述方法进行培 养，但是在预定时间点监控各个培养物之pH值，并藉由添加NaOH溶液谨慎地将之调整至初始pH值附近(表2)。培养程序持续336小 时。添加NaOH溶液的时机是依选定之pH值而定。例如，试验B与 试验C是分别从第192与168小时起添加NaOH溶液，以将pH值维 持于约4.9至5.1与约5.4至5.6，而试验A则迟至第240小时才加入 NaOH溶液。
表2 取样时间 (小时) pH 试验A 试验B 试验C 0 4.67 5.02 5.58 24 4.71 5.05 5.65 40 4.74 5.09 5.7 72 4.81 5.15 5.71 96 4.84 5.16 5.68 120 4.84 5.09 5.61 144 4.84 5.01 5.52 168 4.84 4.9 5.37 192 4.85 4.81 5.4 209 4.86 4.9 5.4 240 4.86 4.9 5.4 264 4.8 4.9 5.4 288 4.66 4.9 5.4 312 4.52 4.9 5.4 336 4.37 4.9 5.39
在接种菌丝体后的第96、144、192、240、288及336小时，从 培养物取样获得数个样品，随后令该等样品通过一由过滤漏斗、锥瓶 与抽气装置所构成的简易过滤器装置，以移除大部分之不溶性物质。 以氨水(NH4OH)将所获得之滤出物的pH值调整至7，并进行湿热灭 菌。将所得样品保存于4℃下，以供后续MTT比色分析之用。依实 施例2所示，令所得样品接受MTT比色分析。利用未经接种之培养 基来作为MTT分析之阴性对照组。
表3 取样时间 (小时) Hep G2细胞之相对存活率(％) 试验A 试验B 试验C 96 96 112 123 144 103 102 107 192 67 85 112 240 8 19 91 288 9 10 18 336 11 12 8
如表3所示，在指定时间点所取样之樟芝滤出物针对其对于Hep G2肿瘤细胞之抑制效应来进行比较。对于在接种菌丝体后的第192 小时所取得之滤出物而言，可见试验A与试验B中培养的樟芝CCRC 930032会获得较试验C所观察到的更低的相对存活率。此种在抗肿 瘤效应上之差异会在第240小时达到最高，而于后续的时间点逐渐降 低，此暗示着在pH4.5至5.4下、优选为pH4.6至5.3下且更优选为 在pH4.7至5.2下在所进行之培养，将可致使培养物中之具药理活性 物质的早期生成。
利用AGS、HeLa及MCF-7等肿瘤细胞株进行相应实验，可在 MTT分析中观察到一致的结果(结果未示出)。
实施例4：樟芝在250升发酵槽中之扩大规模培养
在一具250升发酵槽(Bio-Top)内中预先置入160升之合成培养基 (1.5％果糖、0.5％(w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck) 以及0.05％(w/v)之MgSO4·7H2O(Merck))，再将实施例1中所制得 之樟芝CCRC 930032接种源以1∶9之体积比加入该合成培养基中。 在30℃以及0.6升/分钟之通气速率下培育该培养物。培养物之振荡 速率于开始时被设定在约40rpm下，培育70小时后，再升高至约150 rpm。培养物之pH值于整个培养期间均被调整在pH4.9至5.1的范 围内。
在接种菌丝体后的第96、144、168、186.5、244及284小时， 从培养物取样获得数个样品，随后藉由一常规方法进行过滤，以移除 大部分之不溶性物质。以氨水将所获得之滤出物的pH值调整至7， 并进行湿热灭菌。令所得样品接受MTT比色分析，其中HeLa、AGS、 Hep G2及MCF-7细胞是在1,000、3,000、3,000及3,000个细胞/孔 之初始浓度下进行测试。利用未经接种之培养基来作为MTT分析之 负对照组。结果示于表4与图4中。
表4 取样时间 (小时) Hep G2细胞之相对存活率(％) HeLa AGS Hep G2 MCF-7 96 89 83 91 61 144 70 67 49 38 168 65 32 36 31 186.5 30 26 33 22 244 23 34 42 26 284 25 37 43 26
表4与图4显示出，经由将振荡速率及pH值设定于实施例2及 3中所述之优选范围内，可将依据本发明之樟芝培养法成功地扩大规 模至160升之体积。
实施例5：在合成培养基中制备樟芝培养物之滤出物
将被培养在PDA平板培养基上之樟芝CCRC 930032的整个菌丝 体切成小块，随后在无菌状态下，于一均质机(Osterizer)中，利用50ml 之无菌水将菌丝体予以均质化，历时30秒，以便获得一菌丝悬浮液。 在1升厄氏锥瓶内中预先置入200ml之合成培养基(2％果糖、0.5％ (w/v)之酵母膏(DIFCO)、0.1％(w/v)之KH2PO4(Merck)以及0.05％(w/v) 之MgSO4·7H2O(Merck))，再添加20ml之菌丝悬浮液。在30℃下， 将该沈浸培养物予以培育14天，并施以恒定振荡(在一具可得自于 Hotech之旋转式振荡机上以75rpm之速率进行振荡)。培育结束后， 令真菌培养物通过一由过滤漏斗、锥瓶与抽气装置所构成的简易过滤 器装置。所得粗制滤出物供后续分析之用。
实施例6：源自于樟芝滤出物之活性分离部分的制备与分析
依据制造商所提供的指南，藉由低速离心，令实施例5所得之粗 制滤出物(F0)通过一个CertriprepR Concentrator 10(一种购自于 Amicon的商用微型柱，其具有10kDa的分子量截留值)。初次流经 液被称作为分离部分F1。随后以去离子再次充填柱并再次离心，以 收集二次流经液F2。获取仍留置于柱内之真菌分子，并命名为F3。
藉由一具有3kDa之分子量截留值的CertriprepR Concentrator 3 微型柱(Amicon)，依前述方法将F1进行部分分离，以便获得初次流 经液(F4)、二次流经液(F5)以及仍留置于该柱内的分离部分(F6)。此 纯化流程示出于图5中。
将所得之分离部分进行MTT比色分析，以评估抑制肿瘤细胞生 长的能力。在此例中，HeLa细胞以1500个细胞/孔之初始浓度进行 测试，而MRC-5、AGS、Hep G2及MCF-7细胞则具有3,000个细胞 /孔的初始载入量。图6中清楚地显示出，F1与F4此二者所展现出 之抗肿瘤活性相当于粗制滤出物(F0)所展现出的活性。此结果暗示 着，滤出物中所存有的大部分(若非为全部)药理活性物质具有低分子 量，特别是具有不超过约3kDa的分子量。
另外，经由一系列膜组，将实施例5所得之粗制滤出物(F0)予以 部分分离，以获得一含有分子量不超过1kDa之真菌分子的分离部分 (F7)。抗肿瘤活性与F7共存于相同分离部分(图7中之最左图)此一事 实指出，具药理活性物质的表观分子量可能降至不超过约1kDa。
前述MTT分析中，于经滤出物处理之MRC-5细胞(正常肺纤维 细胞)中会观察到降低的存活率，此指出真菌滤出物以及其活性分离 部分可能会对于正常细胞展现出抑制效应。然而，当接种诸如高达 10,000个细胞/孔的MRC-5细胞时，该抑制效应会大幅降低。经比较， 真菌滤出物以及其活性分离部分的有效性极不易被增量之肿瘤细胞所 影响(数据未示出)。经此一活体外之观察可推测，当投药至活体内时， 依据本发明之组合物对于正常细胞较为无害，但会给予肿瘤严厉的打 击。
实施例7：樟芝滤出物在AmberliteR XAD-4树脂上的分离
将实施例6所得之滤出物F7与一批次之AmberliteR XAD-4 (Sigma)共同培育，并施予温和振荡。培育结束后，藉由离心来沉淀 树脂粒。分别获取含有未结合物质之上清液以及树脂粒。随后，依序 以相同体积之去离子水、甲醇及乙酸乙酯来洗脱树脂粒，并分别收集 源自于三个洗脱流程的洗脱物。于低压下，将甲醇洗脱物与乙酸乙酯 洗脱物蒸发至干燥，再溶入少量乙醇中。将适量无菌水加入所得乙醇 溶液中，以使得后续MTT比色分析中之乙醇最终浓度被调整至不超 过0.5％。MTT比色分析是依实施例6所述方法来进行，并利用未经 接种之培养基或0.5％乙醇水溶液作为阴性对照组。结果示于图7。
图7显示出，乙酸乙酯洗脱物对于所有五种细胞均具有优越的抗 肿瘤活性，而水及甲醇洗脱物则不会对该等细胞展现出显着的效应。 上清液中可观察到残余的抗肿瘤活性，推测此是导因于疏水性物质未 被树脂所完全吸附。此等结果暗示着，滤出物中所存有的药理活性主 要源自于分子量不超过约1kDa的疏水性物质。
实施例8：樟芝滤出物在Lichrosorb RP 18柱中的分离
在一个LichrosorbR RP-18管柱(Hibar预充填柱RT 250-25；7μm； 购自于Merck)中进一步分离实施例7所得之乙酸乙酯洗脱物。利用 乙腈/水所构成之洗脱剂，以200分钟期间从40％至100％的乙腈百分 率以及5.7毫升/分钟的流速下进行梯度洗脱。测量254nm处之吸光 值，并将之绘示于图8中。将体积各为12-ml之分离部分予以收集， 并如表5所示组合成数个分离部分。
表5 分离部分 收集管号 分离部分 收集管号 分离部分 收集管号 A 1、2 G 23、24、25、 26 N 57、58、59、 60 B 3、4、5 H 28、29、30、 31 P 69、70、 71、72、73 C 6 I 33、34、35 Q 74、75、 76、77 C′ 7、8、9、10 J 36、37、38 R 80、81 D 11、12、13、 14 K 39、40、41、 42 S 82、83、84 E 15、16、17 L 43、44、45、 46 T 85、86、 87、88 F 18、19、20、 21 M 50、51、52、 53
依实施例7所述，于低压下，将该等分离部分蒸发至干燥并制备 成操作溶液。MTT比色分析是依实施例6所述方法来进行。结果示 于图9至11。
如图9至11所显示，分离部分G、K及L对于AGS细胞展现出 显着的抑制效应，而相邻分离部分G与H则将Hep G2细胞的存活 率压抑至一低于50％的位准。MCF-7细胞广泛地被分离部分B、E、 F、G、H、K、L及R所抑制。
然而，乙酸乙酯洗脱物中对于HeLa细胞的抑制活性，几乎在利 用逆相分配层析进行纯化期间消失殆尽，此指出樟芝滤出物中之某些 药理活性可能来自于许多分子的协同作用，而此一协同作用相当容易 受到剧烈纯化程序的影响。
虽然本发明已被描述于前述之特定实施例中，惟应明了，对于本 领域熟熟练技术人员而言，许多的修改与变化是至为显明，而可在不 偏离本发明之精神与权利要求书范围下完成。