一种野葛藤提取物HPLC指纹图谱的构建方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101518565 B (45)授权公告日 2011.02.09 CN 101518565 B *CN101518565B* (21)申请号 200910020213.X (22)申请日 2009.03.26 A61K 36/488(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (73)专利权人 山东省中医药研究院 地址 250014 山东省济南市历下区燕子山西 路 7 号 (72)发明人 李贵海 刘逢芹 于希昌 刘田云 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 李桂存 周红英等 .RP2HPLC 分离测定甘葛藤茎叶中 葛根素、 大。

2、豆苷和大豆苷元的含量 .中国中药杂 志 .2007, 第 32 卷 ( 第 10 期 ),937-939. (54) 发明名称 一种野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种野葛藤提取物 HPLC 指纹图 谱的构建方法， 主要包括以下步骤 ： 取野葛藤药 材， 用乙醇回流提取得醇提物粉末， 用 95的乙 醇溶解， 定容， 滤过， 得供试品溶液 ； 然后进行高 效液相色谱分析， DiamonsilTM C18色谱柱， 检测波 长 250nm， 流动相为乙腈 -0.5乙酸水溶液 ； 得到 野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱。本发明的方法精 确， 稳定， 重现性好， 。

3、操作简便， 容易掌握， 所得指 纹图谱中各共有特征峰分离良好， 易于辨认， 能较 严格地评价和控制野葛藤提取物的内在质量。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孟晋东 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 101518565 B1/1 页 2 1. 一种野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： (1) 供试品溶液的制备 ： 称取野葛藤药材， 每 50g 加入 65 75 V/V 的乙醇 300 350mL， 回流提取 3 次， 每 次12h， 合并提取液， 回收乙醇， 。

4、浓缩至比重1.12后离心， 取上清液上大孔树脂柱， 依次用 2倍柱体积的纯化水、 5倍柱体积的70V/V乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液， 回收乙醇， 浓缩， 喷 雾干燥， 干燥成细粉 ； 取上述细粉约 5mg， 精密称定， 置 25ml 容量瓶中， 加 95 V/V 的乙醇 10ml 溶解， 加重蒸 水定容至刻度， 用微孔滤膜滤过， 所得续滤液即为供试品溶液 ； (2) 高效液相色谱分析 ： 色谱条件 ： DiamonsilTM C18色谱柱， 250mm4.6mm， 5m ； 检测波长 250nm， 流动相流速 1.0ml/min， 柱温为室温， 进样量为 10l ； 流动相 A 为乙 腈， 流。

5、动相 B 为 0.5 V/V 的乙酸水溶液， 采用梯度洗脱， 洗脱程序如下 ： 其中下述比例为体 积比 ： 0min 时， 流动相 A 流动相 B 15 85 ； 40min 时， 流动相 A 流动相 B 40 60 ； 60min 时， 流动相 A 流动相 B 50 50 ； (3) 精确吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪， 按上述条件操作， 得到野葛藤提取物的 HPLC 指纹图谱。 2. 根据权利要求 1 所述的野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法， 其特征在于 ： 得到 的野葛藤提取物的HPLC指纹图谱所具有的共有特征峰为葛根素(4)、 大豆苷(7)、 染料木苷 (12)、 大豆苷元。

6、 (16) 四个峰， 其保留时间分别为 7.9min、 12.8min、 19.7min、 31.2min。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法， 其特征在 于 ： 得到的野葛藤提取物的 HPLC 指纹图谱中的共有特征峰还包括 (1)、 (2)、 (3)、 (5)、 (6)、 (8)、 (9)、 (10)、 (11)、 (13)、 (14)、 (15)、 (17) 十三个峰， 其保留时间分别为 5.2min、 6.1min、 6.9min、 8.9min、 10.7min、 14.1min、 14.9min、 16.7min、 18.1min、 2。

7、0.9min、 24.3min、 27.7min、 32.5min。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法， 其特征在于 ： 在步骤 (1) 中， 每 50g 野葛藤样品加入 70的乙醇 300mL， 进行回流提取， 每次提取 1.5h。 5. 根据权利要求 1 所述的野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法， 其特征在于 ： 所述 的大孔树脂柱为 HPD100 或 HPD600 型。 权 利 要 求 书 CN 101518565 B1/4 页 3 一种野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法 技术领域 0001 本发明涉及一种野葛藤提取物 HP。

8、LC 指纹图谱的构建方法， 属于中药材的鉴别方 法技术领域。 背景技术 0002 葛根作为临床常用中药， 用量很大， 但每年大量采挖， 造成水土流失、 植被破坏等 严重的环保问题， 有必要寻找新的药用资源作为替代品。野葛藤为豆科植物野葛 Pueraria lobata(Willdenow)ohwi的地上干燥藤茎， 与常用中药葛根同源。 在对野葛藤药用资源的开 发研究中发现， 野葛藤中也含有大量与葛根相同的异黄酮成分， 有可以替代葛根入药的可 能性。但野葛藤药材因品种、 产地的不同， 其有效成分的含量存在一定的差异， 因此用于临 床的质量稳定性也难以保证。目前， 还没有建立一种能较好的控制其质量。

9、的方法。 0003 中药指纹图谱是指采用一定的分析手段得到的某种中药材或中药制剂中所共有 的、 具有特征性的某类或数类成分的色谱图或光谱图。以指纹图谱作为中药 ( 天然药物 ) 提取物及其制剂的质量控制方法， 已成为目前国际共识， 美国食品药品管理局 (FDA) 允许 草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱 ； 世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原 则中也规定， 如果草药的活性成分不明确， 可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致 ； 欧共体在草药质量指南中亦称， 单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的， 因为 草药及其制剂是以整体为活性物质。因此， 建立中药指纹图谱将能较为全。

10、面地反映中药及 其制剂中所含化学成分的种类与数量， 是现阶段控制中药内在质量的有效手段。 发明内容 0004 本发明旨在提供一种野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法， 为确保野葛藤提 取物的质量， 控制和评价其质量稳定性提供依据。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 0006 所述的野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的构建方法， 包括以下步骤 ： 0007 (1) 供试品溶液的制备 ： 0008 称取野葛藤药材， 每 50g 加入 65 75 (V/V) 的乙醇 300 350mL， 回流提取 3 次， 每次 1 2h， 合并提取液， 回收乙醇， 浓缩至比重 1.12 后离心， 。

11、取上清液上大孔树脂柱， 依次用 2 倍柱体积的纯化水、 5 倍柱体积的 70 (V/V) 乙醇洗脱， 收集乙醇洗脱液， 回收乙 醇， 浓缩， 喷雾干燥， 干燥成细粉 ； 0009 取上述细粉约 5mg， 精密称定， 置 25ml 容量瓶中， 加 95 (V/V) 的乙醇 10ml 溶解， 加重蒸水定容至刻度， 用微孔滤膜滤过， 所得续滤液即为供试品溶液 ； 0010 (2) 高效液相色谱分析 ： 0011 色谱条件 ： 色谱柱 ： DiamonsilTM C18色谱柱， 250mm4.6mm， 5m ； 0012 检测波长 250nm， 流动相流速 1.0ml/min， 柱温为室温， 进样量为。

12、 10l ； 流动相 A 为乙腈， 流动相 B 0.5 (V/V) 的乙酸水溶液， 采用梯度洗脱， 洗脱程序如下 ： 其中下述比例 说 明 书 CN 101518565 B2/4 页 4 为体积比 ： 0013 0min 时， 流动相 A 流动相 B 15 85 ； 0014 40min 时， 流动相 A 流动相 B 40 60 ； 0015 60min 时， 流动相 A 流动相 B 50 50 ； 0016 (3) 精确吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪， 按上述条件操作， 得到野葛藤提取 物的 HPLC 指纹图谱。 0017 该指纹图谱所具有的共有特征峰为 (4)、 (7)、 (12)、 (。

13、16) 四个峰， 其保留时间分别 为 7.9min、 12.8min、 19.7min、 31.2min， 经分析确定这四个峰依次为葛根素、 大豆苷、 染料木 苷和大豆苷元的特征峰。 0018 进一步的， 本发明方法中得到的指纹图谱的共有特征峰还包括 (1)、 (2)、 (3)、 (5)、 (6)、 (8)、 (9)、 (10)、 (11)、 (13)、 (14)、 (15)、 (17) 十三个峰， 其保留时间分别为 5.2min、 6.1min、 6.9min、 8.9min、 10.7min、 14.1min、 14.9min、 16.7min、 18.1min、 20.9min、 24.。

14、3min、 27.7min、 32.5min。 0019 按照本发明所述的方法， 在供试品溶液的制备时， 优选每 50g 野葛藤样品加入 70的乙醇 300mL， 进行回流提取， 每次提取 1.5h。 0020 所述的大孔树脂柱优选为 HPD100 或 HPD600 型。 0021 为保证野葛藤药材的质量稳定性， 确定野葛藤药材的定期采集时间为每年 1-4 和 9-12 月。 0022 本发明选取不同产地、 不同采集时间的药材 20 多批， 按本发明的方法进行高效液 相分析， 通过对不同批次图谱的比较， 确定了其共有的特征峰。 0023 本发明的有益效果是 ： 通过大量的实验研究， 明确了野葛。

15、藤药材的采集时间、 提取 方法， 并对野葛藤醇提物的纯化工艺和 HPLC 色谱条件进行了优化选择， 最终通过高效液相 色谱法确定了野葛藤提取物指纹图谱的总体特征 ； 该方法精确， 稳定， 重现性好， 操作简便， 容易掌握， 所得指纹图谱中各共有特征峰分离良好， 易于辨认， 能较严格地评价和控制野葛 藤提取物的内在质量。 附图说明 0024 图 1 为按本发明方法获得的野葛藤提取物的 HPLC 指纹图谱。 0025 图 2 为按实施例 1 方法获得的混合对照品和野葛藤提取物的指纹图谱。 0026 其中， 1 17 为野葛藤提取物的 HPLC 指纹图谱中的共有特征峰。 0027 A F 为不同批次。

16、的野葛藤提取物的 HPLC 指纹图谱。 0028 G 为混合对照品的图谱， 峰 1 ： 葛根素 ； 峰 2 ： 大豆苷 ； 峰 3 ： 染料木苷 ； 峰 4 ： 大豆苷 元。 具体实施方式 0029 实施例 1 0030 1 仪器 0031 Waters 高效液相色谱仪 Empower 色谱工作站， Waters600 泵， Waters2996 检测 器 ； AE-241 型分析天平上海梅特勒 - 托利多仪器有限公司。试剂 95乙醇 ( 分析纯 ) 天 说 明 书 CN 101518565 B3/4 页 5 津市北方天医化学试剂厂 20050314 ； 甲醇 ( 色谱纯 ) 天津市科密欧化学。

17、试剂开发中心 20060427 ； 冰醋酸 ( 优级醇 ) 天津市科密欧化学试剂开发中心 20051015。对照品葛根素 ( 中国药品生物制品检定所， 编号 110752-200209) ； 大豆苷 ( 中国药品生物制品检定所， 编 号111738-200501)， 染料木苷(中国药品生物制品检定所， 编号111709-200501)， 大豆苷元 ( 中国药品生物制品检定所， 编号 1502-200101)， 染料木素 ( 中国药品生物制品检定所， 编 号 111704-200501)。 0032 2 试药野葛藤药材共 6 批， 编号 1 6 号。 0033 1 号山东新泰， 采集时间 200。

18、4.02 ； 2 号河南西峡， 采集时间 2004.11 ； 0034 3 号济南柳埠， 采集时间 2006.11 ； 4 号济南西营采集时间 2006.11 ； 0035 5 号山东烟台， 采集时间 2006.11 ； 6 号济南彩石， 采集时间 2006.11。 0036 将上述采集到的药材切成薄片晒干。 取野葛藤切片， 每50g加入70(V/V)的乙醇 加热回流提取， 提取 3 次， 每次 1.5h， 合并提取液， 回收乙醇浓缩至适量， 离心， 取上清液加 于已处理好的 HPD100 型大孔吸附树脂柱上， 然后依次用 2BV 的纯化水和 5BV 的 70 (V/V) 的乙醇洗脱， 收集相。

19、应的洗脱液， 回收乙醇后， 喷雾干燥， 进口温度 120， 出口温度 65， 即得野葛藤醇提物粉末。 0037 3 方法与结果 0038 3.1 供试溶液制备 0039 3.1.1 对照品溶液制备 ： 精密称取对照品葛根素 1.20mg， 大豆苷 1.30mg， 染料木苷 0.57mg， 大豆苷元 0.97mg， 染料木素 0.5mg， 置同一容量瓶中， 加 95乙醇溶解至 10ml， 摇 匀， 用微孔滤膜 ( 孔径微 0.45m) 滤过， 滤液作为对照品混合溶液。 0040 3.1.2供试品溶液的制备 ： 取1-6号野葛藤提取物粉末各约5mg， 分别精密称定， 置 25ml 容量瓶中， 加 。

20、95 (V/V) 乙醇溶解至刻度， 用微孔滤膜 ( 孔径微 0.45m) 滤过， 滤液 作为供试品溶液。 0041 3.2HPLC 色谱条件 0042 色谱柱 ： DiamonsilTM C18色谱柱(250mm4.6mm， 5m) ； 检测波长250nm ； 流动相 流速 1.0ml/min ； 柱温为室温 ； 进样量为 10l ； 流动相为乙腈 -0.5乙酸水溶液按不同体 积进行混合的二元梯度洗脱， 梯度洗脱程序见表 1。 0043 精确吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪， 按上述条件操作， 得到对照品和各批 次野葛藤提取物的 HPLC 指纹图谱， 见图 1、 图 2。与对照品的指纹图谱比较。

21、可见， 在此色谱 条件下， 供试品中已知成分的各色谱峰能得以较好地分离 ； 对比 6 批次的图谱， 其共有峰的 相对保留时间符合程度较好， 经专用统计软件分析统计表明 RSD 5、 p 0.05， 不仅提 示葛藤提取物作为药用新资源具有十分好的前景， 也从另一角度提示临床应用药材应在固 定产地的前提下才能确保疗效的一致性。 0044 表 1 野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱的流动相组成 0045 说 明 书 CN 101518565 B4/4 页 6 0046 表 2 各批次野葛藤提取物 HPLC 指纹图谱中共有峰的保留时间一览表 0047 0048 实施例 2 0049 除供试品溶液的制备中， 每 50g 野葛藤药材加入 65 (V/V) 的乙醇 350mL， 回流提 取 3 次， 每次 1h 外， 其余操作同实施例 1。 0050 实施例 3 0051 除供试品溶液的制备中， 每 50g 野葛藤药材加入 75 (V/V) 的乙醇 300mL， 回流提 取 3 次， 每次 2h 外， 其余操作同实施例 1。 说 明 书 CN 101518565 B1/2 页 7 说 明 书 附 图 CN 101518565 B2/2 页 8 说 明 书 附 图 。