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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610742488.4 (22)申请日 2016.08.28 (71)申请人 成都宝科生物科技有限公司 地址 610000 四川省成都市高新区紫荆北 路45号 (72)发明人 钟雪萍 (51)Int.Cl. A61K 36/234(2006.01) A61P 31/16(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种抗流感病毒的蛇床子提取物 (57)摘要 本发明公开了一种抗流感病毒的蛇床子提 取物， 。
2、提取物制备方法包括：（a） 将干燥的蛇床子 用70%乙醇溶液热回流提取， 合并提取液， 浓缩至 无醇味得到乙醇提取浓缩液；（b） 将步骤 （a） 所得 乙醇提取浓缩液用水稀释， 依次用石油醚、 乙酸 乙酯和水饱和的正丁醇萃取， 减压浓缩， 分别得 到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物；（c） 正丁醇萃取物用水溶解， 过滤， 用大孔树 脂富集活性成分， 先用15%乙醇冲洗8个柱体积除 去大极性成分， 再用70%乙醇洗脱10个柱体积， 收 集70%洗脱液， 减压浓缩， 即得蛇床子提取物。 该 提取物具有抗流感病毒作用， 可以开发成抗流感 病毒的药物。 权利要求书1页 说明书6页 附图1。
3、页 CN 107773578 A 2018.03.09 CN 107773578 A 1.一种蛇床子提取物， 其特征在于所述提取物由以下方法制备： (a)将干燥的蛇床子用70乙醇溶液热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味得到乙醇 提取浓缩液； (b)将步骤(a)所得乙醇提取浓缩液用水稀释， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和水饱 和的正丁醇萃取， 减压浓缩， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (c) 正丁醇萃取物用水溶解， 过滤， 用大孔树脂富集活性成分， 先用15乙醇冲洗8个柱体积除 去大极性成分， 再用70乙醇洗脱10个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩， 即得蛇床子提 。
4、取物。 2.根据权利要求1所述的提取物， 其特征在于： 步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔 树脂。 3.根据权利要求1所述的提取物， 其特征在于： 所述提取物的液相分析方法为： 色谱柱： Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm250mm， 5 m)； 流动相： A为乙腈， B为0.4磷酸溶液； 梯度洗脱程序： 0.0110min， A 1015； 1030min， A 1548； 3055min， A 4878； 5565min， A 7810； 流动相流速： 1.0mLmin-1； 检测波长： 260nm； 柱温： 30； 进样量： 10 L。 4.药物制剂， 其特征。
5、在于： 含有治疗有效量的权利要求1所述的提取物和药学上可接受 的载体。 5.权利要求1所述的提取物在制备抗流感病毒的药物中的应用。 6.权利要求4所述的药物制剂在制备抗流感病毒的药物中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107773578 A 2 一种抗流感病毒的蛇床子提取物 技术领域 0001 本发明涉及中药提取物领域， 具体涉及一种蛇床子提取物及含有该提取物的药物 制剂， 该提取物可以应用于抗流感病毒领域， 治疗和预防流行性感冒。 背景技术 0002 植物蛇床子为一年生草本植物， 高3080cm。 茎直立， 有分枝， 表面有纵沟纹， 疏生 细柔毛。 叶互生， 23回羽头细裂。
6、， 最终裂片线状披针形， 先端尖锐； 基生叶有长柄， 柄基部 扩大成鞘状。 复伞形花序顶生或腋生； 总苞片810， 线形； 花白色， 花柱基短圆锥形， 花柱细 长， 反折。 双悬果宽椭圆形， 果棱具翅。 花期47月， 果期68月。 生于原野、 田间、 路旁、 溪沟 边等潮湿处。 0003 中药蛇床子为伞形科(Umbelliferae)蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri(L.) Cuss.的干燥成熟果实。 蛇床子性温， 味辛苦， 有小毒。 外用燥湿杀虫止痒， 内服温肾壮阳， 祛 风燥湿。 用于治疗阳痿， 宫冷， 寒痹腰痛， 外治滴虫性阴道炎， 手、 足癣感染等。 国内外关于蛇 床子药。
7、理效应的报道很多， 涉及免疫、 神经、 内分泌、 心血管、 呼吸及生殖等系统， 主要表现 为抗炎、 抗过敏、 中枢抑制、 抗心律失常及抗肿瘤等作用。 0004 蛇床子主要含香豆素类化合物， 此外还有色原酮类和苯并呋喃类化合物。 蛇床子 挥发油中， 相对含量较高的组分主要有倍半萜类， 此外还有酯类和萜醇类化合物。 大量研究 证明蛇床子的有效成分为香豆素类化合物， 其中含量最高的两种香豆素类化合物为蛇床子 素(Osthole， Ost)、 欧前胡素(Imperatorin， Imp)。 因此Ost及Imp经常作为评价不同来源地 的蛇床子药材的质量及含蛇床子中成药的质控指标。 由于Ost具有许多重要。
8、的药理活性包 括抗癌、 抗增殖等活性， 以及Imp具有抑制癫痫发作、 扩张血管、 抑制心肌肥大、 抑制肿瘤细 胞增殖、 抗微生物、 影响药物代谢酶活性等多种药理作用， 而受到越来越多的关注。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种蛇床子提取物， 其制备方法和液相分析方法， 含有该 提取物的药物制剂及利用该提取物制备抗流感病毒药物的用途。 0006 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 0007 一种蛇床子提取物， 该提取物由以下方法制备： 0008 (a)将干燥的蛇床子用70乙醇溶液热回流提取， 合并提取液， 浓缩至无醇味得到 乙醇提取浓缩液； (b)将步骤(a)所得乙醇提取。
9、浓缩液用水稀释， 依次用石油醚、 乙酸乙酯和 水饱和的正丁醇萃取， 减压浓缩， 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取 物； (c)正丁醇萃取物用水溶解， 过滤， 用大孔树脂富集活性成分， 先用15乙醇冲洗8个柱 体积除去大极性成分， 再用70乙醇洗脱10个柱体积， 收集70洗脱液， 减压浓缩， 即得蛇 床子提取物。 0009 进一步地， 步骤(c)中所述大孔树脂为AB-8型大孔树脂。 0010 为了能够通过建立HPLC指纹图谱的方法控制不同批次制备的提取物的批间差异， 说 明 书 1/6 页 3 CN 107773578 A 3 所述提取物的液相分析方法为： 0011 色谱柱： 。
10、Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm250mm， 5 m)； 0012 流动相： A为乙腈， B为0.4磷酸溶液； 0013 梯度洗脱程序： 0.0110min， A 1015； 1030min， A 1548； 30 55min， A 4878； 5565min， A 7810； 0014 流动相流速： 1.0mLmin-1； 0015 检测波长： 260nm； 0016 柱温： 30； 0017 进样量： 10 L。 0018 药物制剂， 含有治疗有效量的所述提取物和药学上可接受的载体。 0019 所述的提取物在制备抗流感病毒的药物中的应用。 0020 所述的药物制剂在。
11、制备抗流感病毒的药物中的应用。 0021 本发明提取物用作药物时， 可以直接使用， 或者以药物制剂的形式使用。 0022 所述药物制剂含有治疗有效量的本发明蛇床子提取物， 其余为药物学上可接受 的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。 0023 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、 半固体和液体稀释剂、 填料 以及药物制品辅剂。 将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。 本发明提取物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。 用于口服时， 可将其制成片剂、 缓释片、 控 释片、 胶囊、 滴丸、 微丸、 混悬剂、 乳剂、 散剂或颗粒剂、 口服液等； 用于注射时， 。
12、可制成灭菌的 水性或油性溶液、 无菌粉针、 脂质体或乳剂等。 0024 本发明的优点： 本发明通过对蛇床子进行提取、 除杂、 富集处理， 能得到具有抗流 感病毒作用的提取物； 本发明提供的液相分析方法可以用于建立该提取物的指纹图谱， 用 于控制不同批次制备的提取物的批间差异。 附图说明 0025 图1为蛇床子提取物HPLC液相图谱。 具体实施方式 0026 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明保护范 围。 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 。
13、0027 实施例1： 提取物制备 0028 药材来源： 蛇床子购自安徽亳州中药材市场， 产地河北。 0029 主要试剂： 食品级乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司； 医药级AB-8大孔树脂购 自天津波鸿树脂有限公司； 乙腈为HPLC级， 购于TEDIA； 85磷酸为HPLC级， 购于TEDIA； 色谱 用纯净水为哇哈哈纯净水。 0030 制备方法： 将10kg干燥的蛇床子用70乙醇溶液热回流提取(25L3次)， 合并提 取液， 浓缩至无醇味得到乙醇提取浓缩液(2.5L)； 将所得乙醇提取浓缩液用水稀释至4L， 依 次用石油醚(4L3次)、 乙酸乙酯(4L3次)和水饱和的正丁醇(4L3次)萃取， 。
14、减压浓缩， 说 明 书 2/6 页 4 CN 107773578 A 4 分别得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物258g； (c)正丁醇萃取物用1.5L水 溶解， 医用脱脂棉过滤， 用AB-8大孔树脂(2kg， 柱体积1.5L)富集活性成分， 先用15乙醇冲 洗8个柱体积(12L)除去大极性成分， 再用70乙醇洗脱10个柱体积(15L)， 收集70洗脱 液， 减压浓缩， 即得蛇床子提取物123g。 0031 实施例2： 液相色谱分析 0032 供试品溶液配制： 取实施例1方法制得的提取物5mg至50mL棕色容量瓶中， 加30mL 10乙腈水溶液超声溶解， 冷却至室温后， 继续加1。
15、0乙腈水溶液定容。 0033 分析方法： 0034 高效液相色谱仪： Agilent 1260， 二元泵； 0035 色谱柱： Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm250mm， 5 m)； 0036 流动相： A为乙腈， B为0.4磷酸溶液； 0037 梯度洗脱程序： 0.0110min， A 1015； 1030min， A 1548； 30 55min， A 4878； 5565min， A 7810； 0038 流动相流速： 1.0mLmin-1； 0039 检测波长： 260nm； 0040 柱温： 30； 0041 进样量： 10 L。 0042 用制备的10批次。
16、的蛇床子提取物进行分析， 进行色谱峰匹配， 结果17号峰在10 批样品色谱图中均出现。 因此标定7个峰为共有色谱峰， 据此建立该提取物的HPLC质量控制 图谱， 结果见图1。 该10批次的蛇床子提取物药理活性相似。 0043 实施例3： 提取物药理试验 0044 一、 材料与方法 0045 1、 药物及试剂： 0046 蛇床子提取物按实施例1方法制备； 病毒唑： 浙江亚太药业股份有限公司生产， 批 号： 130901。 0047 2、 动物： 昆明种小鼠， 雌雄各半， 体重2024g， SPF级， 由广东省医学实验动物中心 提供， 动物合格证号： 粤监证字2013A018。 0048 3、 病。
17、毒株及细胞： 甲型流感病毒、 流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)， 购自中国预 防医学科学院病毒学研究所； MDCK细胞株， 购自中山大学实验动物中心细胞室。 0049 4、 细胞培养液和维持液： 细胞培养液为含100U/mL的青霉素、 100 g/mL的链霉素和 10胎牛血清的DMEM培养液； 细胞维持液除含2胎牛血清外， 其他成分同培养液。 0050 5、 方法 0051 (1)蛇床子提取物在体外对MDCK培养细胞的毒性试验 0052 将蛇床子提取物母液用细胞培养液做等比稀释后， 加到已长成单层MDCK细胞培养 板中， 100 L/孔， 每个稀释度药液做4个复孔， 同时设正常细胞对照、 病。
18、毒对照和病毒唑对 照。 将培养板置375CO2培养箱中培养4d， 每日于倒置显微镜下观察细胞病变情况。 按 Reed-Muench法计算半数细胞毒性浓度(TC50)。 0053 (2)蛇床子在体外对流感病毒所致细胞病变的影响(CPE法) 0054 取已长成单层细胞的培养板， 倒掉培养液， 加入相应稀释度的药液， 100 L/孔， 每 说 明 书 3/6 页 5 CN 107773578 A 5 个稀释度平行做4个复孔。 置375CO2培养箱中作用1h后倒掉药液， 接种100倍TCID50(半 数感染量)的病毒液， 50 L/孔， 置375CO2培养箱中吸附1h后倒掉病毒液， 用细胞维持液 冲洗。
19、细胞2次， 再加入相应稀释度的药液， 同时设病毒对照、 病毒唑对照及正常细胞对照， 置 375CO2培养箱中培养， 每日于倒置显微镜下观察细胞病变情况。 细胞病变程度 (Cytopathic effect， CPE)按以下6级标准判断：“-” 为细胞生长正常， 无病变出现；“” 为 细胞病变占整个单层细胞的010；“+” 为细胞病变约占整个单层细胞的1025； “+” 为细胞病变约占整个单层细胞的2550；“+” 为细胞病变约占整个单层细胞的 5075；“+” 为细胞病变约占整个单层细胞的75以上。 当病毒对照组细胞病变为 “+” 时记录实验结果， 经秩和检验与病毒对照组比较P0.05(CPE。
20、为 “+” 以下)判断为有 效。 并按Reed-Muench计算半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)。 TITC50/IC50。 0055 (3)蛇床子提取物体内对小鼠流感病毒性肺炎的影响 0056 取昆明种小鼠60只， 随机分成正常对照组、 病毒感染对照组、 病毒唑组、 蛇床子提 取物低、 中、 高3个剂量组， 共6组， 每组10只。 除正常对照组外， 其余各组小鼠用乙醚轻度麻 醉， 选用流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1的15个LD50病毒浓度， 滴鼻感染小鼠， 每只0.05mL。 从感染前1d开始按0.1mL/10g的剂量灌胃给药每天2次， 连续5d， 病毒感染对照组以等体积 蒸馏水灌。
21、胃。 第6d称取小鼠体重后解剖， 肉眼观察肺部病变， 记录肺部肝样实变的程度， 摘 取全肺称重， 与体重计算肺指数值， 并求出肺指数抑制率。 计算公式如下： 0057 肺指数肺重(g)/体重(g)100 0058 肺指数抑制率(病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数均值)/病毒对照组肺指 数均值100 0059 (4)蛇床子提取物对流感病毒致小鼠死亡的影响 0060 取昆明种小鼠90只， 随机分成病毒感染对照组、 病毒唑组、 蛇床子提取物低、 中、 高 3个剂量组， 共5组， 每组18只。 各组小鼠用乙醚轻度麻醉后， 以2个LD50病毒浓度的流感病毒 亚甲型鼠肺适应株FM1病毒液滴鼻感染， 每只0。
22、.05mL。 从感染前1d开始按0.1mL/10g的剂量 灌胃给药， 每天2次， 连续5d， 病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。 观察并记录感染后小鼠 的死亡数， 计算死亡率、 保护率、 平均存活天数及生命延长率。 计算公式如下： 0061 死亡保护率(病毒感染对照组死亡率-试验组死亡率)/病毒感染对照组死亡率 生命延长率(试验组平均存活天数-病毒感染对照组平均存活天数/病毒感染对照组平均 存活天数)100 0062 (5)统计学方法 0063 采用SPSS10.0软件包进行统计分析， 肺指数值、 存活天数的比较采用组间t检验； 保护率的比较用 2检验。 0064 二、 结果分析 0065 1。
23、、 蛇床子提取物体外抗流感病毒作用 0066 实验结果表明， 较大浓度的蛇床子提取物对MDCK细胞具一定毒性， 主要表现为细 胞增殖缓慢、 颗粒增多、 形态改变、 折光性增强等， 其TC50生药为24.91mg/ml； 蛇床子提取物 在体外能抑制流感病毒所致的细胞病变， 其IC50生药为3.33mg/ml。 提示蛇床子提取物在体 外对流感病毒具有抑制作用， 其TI为7.48。 0067 2、 蛇床子提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响 说 明 书 4/6 页 6 CN 107773578 A 6 0068 由表1可见， 蛇床子提取物低、 中、 高剂量组小鼠的肺指数值明显低于病毒感染对 照组， 与病。
24、毒感染对照组比较有显著性差异(P0.01或0.05)， 提示蛇床子提取物对流感病 毒引起的小鼠肺部炎症有明显抑制作用。 注： 与正常对照组比较， #P0.01； 与病毒感染对照 组比较， *P0.05，*P0.01。 0069 表1蛇床子提取物对小鼠流感病毒性肺炎的影响 0070 0071 3、 蛇床子提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用 0072 由表2可见， 在小鼠感染流感病毒后， 病毒感染对照组94.4动物出现死亡， 平均 存活8.1d。 而低、 中、 高剂量蛇床子提取物能明显抑制流感病毒感染所致的小鼠死亡(蛇床 子提取物低、 中、 高剂量组死亡率与病毒感染对照组比较， P0.01或0.。
25、05)， 且能明显延长小 鼠的平均存活天数(蛇床子提取物低、 中、 高剂量组存活天数与病毒组比较， P0.01或 0.05)， 提示中药蛇床子提取物对流感病毒致小鼠死亡有明显保护作用。 注： 与病毒感染对 照组比较， *P0.05，*P0.01。 0073 表2蛇床子提取物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用 说 明 书 5/6 页 7 CN 107773578 A 7 0074 0075 实施例4： 片剂的制备 0076 按实施例1方法先制得提取物， 按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂， 制 粒压片。 0077 实施例5： 口服液的制备 0078 按实施例1方法先制得提取物， 按常规口服。
26、液制法制成口服液。 0079 实施例6： 胶囊剂或颗粒剂的制备 0080 按实施例1方法先制得提取物， 按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂， 制 成胶囊或颗粒剂。 0081 实施例7： 注射液的制备 0082 按实施例1方法制得提取物， 加注射用水， 精滤， 灌封灭菌制成注射液。 0083 实施例8： 无菌粉针的制备 0084 按实施例1方法先制得提取物， 溶于无菌注射用水中， 搅拌使溶， 用无菌抽滤漏斗 过滤， 再无菌精滤， 分装于安瓿， 低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。 说 明 书 6/6 页 8 CN 107773578 A 8 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 9 CN 107773578 A 9 。