相关申请的交叉引用
本申请要求2009年12月18日提交的第61/288,127号美国临时申请的优先权。
发明背景
现在，均试图递送“医药差别化产品”的制药公司之间发生各种类型的军备竞赛。现有药物模板不灵活，因为它们通常提供单一活性。例如，通常设计重组单克隆抗体并优化以结合并抑制单一靶向蛋白质。例如，通常设计小分子药物并优化以结合并激活(或抑制)单一靶向。在某些情况下，药物为非选择性的并有多种活性(例如，设计小分子激酶抑制剂以结合单一激酶的ATP结合位点，但其表现出对邻近激酶家族成员的一定程度的亲合力和生物活性)。但通常，药物开发者优化使用今天单一活性和非选择性的药物模板被认为是远离药物开发过程而设计的。
然后，在今天的药物开发中，单一靶向的选择是关键变量。因此，从模板-中心观点出发开发药物。但开发药物来治疗疾病。并且疾病通常包括多于一种连续或平行发生的病理生理机制。机制为在整个生物体的局部细胞或组织或器官或全身存在的通路或一组交叉通路。通路为彼此相互作用的一组部分。从事药物开发的更理想的途径是能够使用疾病-中心或生物-中心途径。例如，基于迄今的学术和公司以及历史研究和经验的总和，疾病x包括通路a、b和c。在通路a内，已知靶向蛋白质z为上调的(并能受抗体片段限制和抑制)。在通路b内，已知细胞类型y为不适当增殖的(并能受小分子抗增殖剂影响)。并且通路a和b的病理生理学存在于组织亚型x内(并且其能通过包括在小的组织靶向肽的药物若干复制品上而被药物靶向或富集)。理想地，使提供这些多种功能和不同类型的生物活性部分(蛋白质、寡核苷酸、小 分子、脂质等)的药物技术或模板被结合至单一、可适用、多功能药物，所述药物在其设计、实现、制造和给药方面为实际的最佳组合并且简单。此外，技术应允许某些生物活性部分不稳定连接使得能在期望条件(时间、水性pH环境、其它)下释放它们。这些药物应表现较高的功效和安全性同时提供早期药物开发过程中技术、管理和商业成功的更高的总体可能性。
多数疾病是复杂和起源多因素的。因此，在应用该生物学-中心或疾病-中心方法中，能够设想未来十至十五年后，其中诸如类风湿关节炎的重大疾病实际上通过诊断(分子、成像、生物标记、基因)或其它方法被分为例如十种主要亚型，其各自受特殊的一组病理生理学驱动并且能使用一种多功能药物靶向它使得开发十种多功能药物以治疗十种不同的疾病类型。
本发明描述了能为下一代多功能药物开发骨架的这种药物技术模板。所述技术递送了聚合物骨架，其(i)通过选择亲水单体和结构自身向药物递送固有生物相容性，并且(ii)还形成用于结合于和/或吸附于多种不同类型试剂(氨基酸、小分子、寡核苷酸、脂质、其它、诊断剂、成像剂、治疗监测剂)的核心骨架或支架，其具有预先确定的化学计量和功能(生物相容性、间隔子、生物活性、靶向、诊断、成像、其它)，以及(iii)能使用任何稳定或灵活的(在预先确定的条件下)结合连接子和化学过程。
已经充分描述用于药物结合的亲水聚合物并且所述药物共轭物产生每年超过$50亿的收入。对于这些聚合物重要的是它们结合水分子的程度以及那些水结合相互作用的物理性质。该性质组合推动聚合物的固有生物相容性。PEG是亲水聚合物的一个实例，但有亲水聚合物的其它实例，其不同程度地结合水并具有不同的物理性质，因此具有不同的固有生物相容性。一种这样的实例是基于磷酰胆碱的聚合物，特别是衍生自2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱的聚合物，该聚合物在诸如冠状动脉药物洗脱支架和隐形眼镜的医疗器械中以多种形式商品化。近年来，已经开发受控的自由基聚合的新方法，其具有能实现低成本和高质量的制备大、复杂结构聚合物的前景。
本发明并入了药物技术和模板，所述模板结合药物开发新模式，起始于一组生物学推动的疾病病理生理学；结合均在实际组合中的生物相容性部分、不同种类的药物部分、延伸结构、灵活的化学。简单来讲，本发明提供了允许使用者建立纳米级生物机器的药物模板，目的是建立防治疾病以有益于患者的灵丹妙药。
配制递送用生物活性剂的努力必须应对多种变量，包括给药途径、活性剂的生物稳定性和活性剂在生理学相容介质中的溶解度。配制生物活性剂进行的选择以及所选择的给药途径能影响活性剂的生物利用度。例如，选择肠胃外给予全身循环的生物活性蛋白质和多肽避免了胃肠道中发现的蛋白水解环境。然而，即使在直接给药的情况下，例如通过注射给予生物活性剂是可能的，制剂可能由于多种原因而不令人满意，所述原因包括对给予的试剂产生免疫反应并对任意赋形剂产生反应，包括灼热感和灼痛。即使活性剂为非免疫原的并且能使用令人满意的赋形剂，但生物活性剂能具有有限的溶解度和短的生物半衰期，其可能需要痛苦和/或不方便的重复给药或连续输注。
对于一些生物活性剂，在通过将试剂与水可溶的聚合物结合开发合适的功能剂配方方面已经获得一定程度的成功。通常认为生物活性剂与水可溶的聚合物结合提供了用于递送生物活性剂并且特别是蛋白质和肽的多种益处。在所使用的水可溶的聚合物之中，聚乙二醇(PEG)最广泛结合包括生物活性肽的多种生物活性剂。降低的免疫原性或抗原性、增加的半衰期、增加的溶解度、减少的肾清除和减少的酶降解有助于结合多种水可溶的聚合物和功能剂，包括PEG共轭物。由于这些特性，生物活性剂的聚合物共轭物需要低频率给药并可能允许使用较少的活性剂以达到治疗终点。低频率给药减少了注射总数，注射可能为痛苦的并且其需要不方便的医疗保健专家探视。结合PEG或其它聚合物还能修饰药物本身的核心活性-利用聚合物结合给予药物“另外的生物活性”的想法(例如，大的水动力半径扩大了来自药物(抗体片段)的抑制范围)抑制了结合受体A，但聚合物-药物共轭物因为任意数量的不同机制但肯定是立体阻碍的作用而抑制结合受体A加受体B。
尽管伴随PEG结合获得一些成功，但生物活性剂的“PEG化”仍然 是个挑战。由于药物开发者的进步晚于诸如促红细胞生成素和各种干扰素的非常有效的竞争性蛋白质，因此PEG亲水聚合物益处不足以推进溶解度、稳定性的提高和粘度以及皮下给予的商业成功产品所必需的免疫原性的降低。PEG结合还可能导致生物活性损失。已经提出多种理论以解释结合PEG后的生物活性的损失。这些包括阻塞试剂的必需位点以通过结合连接基团或通过将试剂包埋在PEG共轭物内来与其它生物组分相互作用，特别是在聚合物是长的并且可能将本身“包装”在一些活性剂周围的情况下，由此阻塞活性所需的潜在配体的通道。
引入用于共轭物制备的PEG的支链形式以减少使用长的直链PEG聚合物链遇到的一些困难。尽管支链聚合物可能克服与使用长链PEG聚合物形成的共轭物有关的一些问题，但支链或直链PEG聚合物共轭物都不能完全解决与使用共轭的功能剂有关的问题。直链和支链PEG共轭物均能例如遭受太长或太短的降解速率。快速的降解速率能导致共轭物具有太短的体内半衰期而太慢的降解速率能导致不可接受长时间的体内共轭物半衰期。
根据功能剂与水可溶的聚合物结合的公认优点，以及诸如PEG的水可溶的聚合物在形成适用于治疗目的的共轭物中的局限性，用于形成具有功能剂的共轭物的另外的水可溶的聚合物是期望的。期望将水可溶的聚合物，特别是具有用于共轭物形成的PEG的许多优点的那些用于形成治疗剂和诊断剂，并且其不遭受伴随作为结合剂的PEG观察到的缺点。为此，阐述用于制备生物活性剂的共轭物的包含两性离子单体的聚合物，特别是2-甲基丙烯酰基氧基乙基-磷酰胆碱。
发明概述
在一个实施方案中，本发明的无规共聚物具有通式I：
通式I的各个单体M1和M2能独立地为丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、 丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基-吡啶和乙烯基-吡咯烷酮。此外，通式I的R1能独立地为H、L1-A1、连接基团LG1或L1-LG1，并且通式I的各个R2独立地为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-8环烃基、C3-8杂环烃基、芳基、杂芳基、A2、L2-A2、LG2、L2-LG2、I2和L2-I2。通式I的基团ZW为两性离子部分。基团I为引发剂片段并且I’为自由基清除剂使得I-I’的组合为用于聚合通式I的无规共聚物的引发剂I1。或者，I’能为H或C1-6烷基。基团I2为引发剂。此外，基团L1和L2各自为连接子，基团A1和A2各自为功能剂，并且基团LG1和LG2各自为连接基团。在上述通式I中，下标x和y1各自独立地为1至1000的整数，下标z为1至10的整数，下标s为1至100的整数，并且下标n为1至20的整数，其中R1为L1-A1或R2中的一个为L2-A2。
在其它实施方案中，本发明提供了用于制备本发明的无规共聚物的方法，所述方法包括下列步骤：在足以通过自由基聚合制备无规共聚物的条件下，使第一单体和第二单体的混合物与引发剂I1接触，其中所述第一单体包含磷酰胆碱，并且所述第二单体和引发剂各自独立地包含功能剂或用于与所述功能剂连接的连接基团中的至少一种。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有功能剂或连接基团的第二单体以及具有功能剂或连接基团的引发剂部分，其中所述功能剂通过连接子与所述第二单体或引发剂部分连接。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有功能剂或连接基团的第二单体，所述第二单体具有与第一单体不同的反应比以使最终的聚合物为交替共聚物、周期共聚物、梯度共聚物、嵌段共聚物或统计共聚物。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有功能剂和可调节连接基团的第二单体，所述第二单体具有与第一单体相同的反应比以使最终的聚合物为交替共聚物、周期共聚物、梯度共聚物、嵌段共聚物或统计共聚物。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有功能剂或连接基团以及其它单体的第二单体，所述其他单体具有不同的环境亲合力使得通过非共价结合形成新的拓扑结构。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有功能剂和可调节连接基团以及其它单体的第二单体，所述其他单体具有不同的环境亲合力使得通过非共价结合形成新的拓扑结构。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有功能剂或连接基团以及相似环境亲合力的其它单体的第二单体使得通过非共价结合形成新的拓扑结构(例如，水性环境中羧基之间的螯合或pH敏感基团)。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有功能剂和可调节连接基团的第二单体使得通过非共价结合形成新的拓扑结构(例如，水性环境中羧基之间的螯合或pH敏感基团)。
在另一实施方案中，本发明的无规共聚物具有包含诸如磷酰胆碱的两性离子的第一单体，至少一个具有可调节连接基团的第二单体使得响应于诸如水性环境或低pH环境的预先确定的触发子而释放功能剂。
附图简述
图1示出用于制备本发明的无规共聚物的示意图。引发剂I-I’断裂为引发剂片段I和自由基清除剂I’。然后，引发剂片段I与共聚用单体M1和M2反应以启动聚合过程并产生物质A。然后，自由基清除剂I’能与物质A可逆反应以形成物质B。或者，物质A能与另外的单体反应以继续生长聚合物(物质C)。与此同时，物质C的生长聚合物链与自由基清除剂I’可逆反应以形成无规共聚物，物质D。
发明详述
I.综述
本发明提供了具有诸如磷酰胆碱的两性离子和至少一个功能剂的无规共聚物(如本文所定义的)。作为高度生物相容性分子的诸如磷酰胆碱的两性离子推动基本生物相容性。对于在温度和其它压力下保护蛋白质，其还具有伴侣型功能。其还能允许诸如可逆细胞摄取的其它功能。功能剂能为诸如药物、治疗性蛋白质或靶向剂以及检测剂、成像剂、标记剂或诊断剂的生物活性剂。无规共聚物通过选择一种或多种合适的功能剂用于多种疾病状态和疾病态的治疗。能将多种生物活性剂与无规共聚物连接，从而不仅能够治疗单一疾病症状或机制，而且能够治疗全部疾病。此外，能以稳定方式通过不可断裂连接子或通过多种可断裂连接子连接生物活性剂使得不同的预先确定的触发子通过使用前药或双前药连接子和连接基团策略释放各个生物活性剂。此外，无规共聚物通过连接合适的靶向剂和成像剂用于诊断和显影目的。无规共聚物能在单一聚合物中包括治疗剂和诊断剂二者，提供治疗疾病以及检测和诊断的治疗诊断剂。
能使用包含诸如磷酰胆碱的两性离子的单体和包含一种或多种相同或不同的生物活性剂的单体或能够与生物活性剂连接的连接基团，通过诸如原子转移自由基聚合(ATRP)的常规游离-自由基聚合或控制/活泼自由基聚合制备无规聚合物。用于制备无规共聚物的引发剂能具有多种引发位点使得能制备诸如星形的多臂聚合物。引发剂还能包含生物活性剂或连接基团或能与生物活性剂连接的灵活化学。
II.定义
为了本发明的目的，根据下文阐述的定义使用下列术语。
“无规共聚物”是指具有至少两个无规分布在整个聚合物骨架中的不同单体基团的聚合物。无规共聚物的单体是结合在一起以形成聚合物的化学部分。各个区别化学部分称为单体。从单体制备的无规共聚物包括但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基-吡啶和乙烯基-吡咯烷酮。另外的单体用于本发明的无规共聚物。当例如在本发明的无规共聚物中使用两种不同的单体时， 两种单体称为“共聚用单体”，意思是将不同的单体共聚以形成单一聚合物。
“两性离子部分”是指具有正电荷和负电荷二者的化合物。用于无规共聚物的两性离子部分能包括季氮和带负电荷的磷酸盐，例如磷酰胆碱：RO-P(＝O)(O-)-O-CH2CH2-N+(Me)3。其它两性离子部分用于本发明的无规共聚物，并且专利WO 1994/016748和WO 1994/016749以其整体并入本文。
“引发剂”是指能够使用本发明的共聚用单体引发聚合的化合物。聚合能为常规自由基聚合或控制/活性自由基聚合，例如原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂-终止(RAFT)聚合或硝基氧介导的聚合(NMP)。聚合能为“伪”控制的聚合，例如衰减链转移。当引发剂适用于ATRP时，其包含能均匀断裂以形成引发剂片段I和自由基清除剂I’的不稳定键，所述引发剂片段I为能够引发自由基聚合的自由基，所述自由基清除剂I’能与生长聚合物链的自由基反应以可逆终止聚合。自由基清除剂I’通常为卤素，但还能为有机部分，例如腈。
“连接子”是指将两个基团连接在一起的化学部分。连接子能为可断裂或不可断裂的。可断裂连接子能为可水解的，酶可断裂的、pH敏感的、光不稳定的或二硫化物连接子等。其它连接子包括同源双功能和异源双功能连接子。“连接基团”为能够形成由生物活性剂的一个或多个键组成的共价连接的官能团。非限制性实例包括表1例示的那些。
“可水解连接子”是指诸如共价键的化学连接基团或键，其在生理学条件下经历水解。键水解的倾向可不仅依赖于连接在其之间断裂键的两个中心原子的连接基团的一般类型，而且依赖于与这些中心原子连接的取代基。易水解的连接基团的非限制性实例包括羧酸酯、磷酸酯、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯和一些酰胺连接基团。
“酶可断裂连接子”是指可通过一种或多种酶降解的连接基团。一些易水解的连接基团还可为酶可降解的。例如酯酶可在羧酸酯或磷酸酯上起作用，并且蛋白酶可在肽键和一些酰胺连接基团上起作用。
“pH敏感连接子”是指在一种pH下稳定并在另一pH下降解的连接基团。例如，pH敏感连接子能在中性或碱性条件下稳定，但在弱酸 性条件下不稳定。
“光不稳定连接子”是指诸如共价键的暴露于光时断裂的连接基团。光不稳定连接子包括芳香族部分以吸收入射光，然后其触发键的重排以断裂通过光不稳定连接子连接的两个基团。
“自分解或双前药连接子”是指其中连接子的主要功能是仅在选择性触发子激活(例如，降低pH或存在组织特异性酶)之后释放功能剂随后自发化学断裂以释放功能剂的连接基团。
将“功能剂”定义为包括生物活性剂或诊断剂。将“生物活性剂”定义为包括靶向特殊生物位置(靶向剂)和/或提供能在体内或体外被证明的某些局部或全身生理学或药理学作用的任何试剂、药物、化合物或其混合物。非限制性实例包括药物、疫苗、抗体、抗体片段、维生素和辅因子、多糖、碳水化合物、类固醇、脂质、脂肪、蛋白质、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如，mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、DNA、cDNA、反义结构、核酶等)。将“诊断剂”定义为包括能够检测或成像组织或疾病的任何试剂。诊断剂的实例包括但不限于放射性同位素标记、荧光团和染剂。
“治疗性蛋白质”是指包括整体或部分组成药物并能用于人或动物药物应用的氨基酸序列的肽或蛋白质。本领域有经验的实践者已知的许多治疗性蛋白质包括但不限于本文公开的那些。
还表示为“PC”的“磷酰胆碱”是指下列：
其中*表示连接点。磷酰胆碱为两性离子基团并包括盐(例如内盐)及其质子化和去质子化形式。
“含磷酰胆碱的聚合物”为包含磷酰胆碱的聚合物。其具体包括其中本申请规定的包含磷酰胆碱的聚合物用于特定用途的各个实例，单一磷酰胆碱也能应用于这类用途。“含两性离子的聚合物”是指包含两性离子的聚合物。
“包含聚(丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)的聚合物”是指包含至少一个诸如2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(即，2-甲基丙烯酰基-2’-三甲基铵乙基磷酸盐)的丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱单体的丙烯酸聚合物。
“接触”是指使至少两种不同物种接触使它们能反应的方法。然而，应理解，能从添加的试剂之间的反应或从能在反应混合物中制备的来自一种或多种添加的试剂的中间体直接制备所得反应产物。
“水可溶的聚合物”是指溶于水的聚合物。水可溶的聚合物的溶液可传播至少约75％，更优选至少约95％的通过过滤后的相同溶液传播的光。基于质量，水可溶的聚合物或其片段的至少约35％，至少约50％，约70％，约85％，约95％或100％(以干燥聚合物的重量计)可溶于水。
聚合物上下文中的“分子量”能被表示为数均分子量或重均分子量或峰值分子量。除非另外规定，对本文分子量的所有引用是指峰值分子量。能使用凝胶渗透色谱或其它液相色谱技术检测这些分子量测定、数均、重均和峰值。还能使用检测分子量值的其它方法，例如使用端基分析或检测依数性质(例如，冰点降低、沸点升高或渗透压)以测定数均分子量，或使用光散射技术、超速离心法或黏度测定法来测定重均分子量。如由凝胶渗透色谱判断的，本发明的聚合试剂通常为多分散的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，优选具有小于约1.5的低多分散性值。在其它实施方案中，多分散性可为约1.4至约1.2，更优选小于约1.15，仍更优选小于约1.10，仍更优选小于约1.05，并且最优选小于约1.03。
本文使用的短语“a(一个)”或“an(一个)”实体是指一个或多个所述实体；例如，化合物是指一个或多个化合物或至少一个化合物。因此，在本文可交换使用术语“a(一个)”(或“an(一个)”)，“一个或多个”和“至少一个”。
本文使用的“约”是指在不同仪器、样品和样品制备之间进行的测量中观察到的变化。
“保护的”、“保护形式”、“保护基”和“保护性基团”是指存在防止或阻碍分子中的特殊化学反应官能团在某些反应条件下的反应的基团(即，保护基)。保护基依赖受保护的化学反应基团的类型和被使用的反应条件以及分子中若存在的另外的反应基团或保护基团的变化而变化。技术人员识别本领域已知的保护基，例如在Greene等人，“Protective Groups In organic Synthesis(有机合成中的保护基)”，第3版，John Wiley 和Sons，Inc.，New York，1999论述中获悉的那些。
本文交换使用的“间隔子”和“间隔基团”是指任选用于连接诸如水可溶的聚合物的末端和功能剂的反应基团以及反应基团的互相连接的部分的原子或一些原子。间隔子可为水解稳定性的或可包含易水解或酶可降解的连接基团。
“烷基”是指具有规定数量的碳原子的直链或支链、饱和、脂肪族基团。例如，C1-C6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基包括但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基能包含任意数量的碳，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。烷基通常为单价的但能为二价的，例如当烷基将两部分连接在一起时。
上文和下文提及的关于有机基团或化合物的术语“低级”分别定义了能为具有多达并包括7，优选多达并包括4以及(当非支链时)一个或两个碳原子的支链或非支链的化合物或基团。
“亚烷基”是指连接至少两个其它基团的上述定义的烷基，即，二价烃基团。连接亚烷基的两个部分能与亚烷基的相同原子或不同原子连接。例如，直链亚烷基能为-(CH2)n的二价基团，其中n为1、2、3、4、5或6。亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、异亚丁基、仲亚丁基、亚戊基和亚己基。
烷基和杂烷基的取代基(包括常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烃基、杂环烃基、环烯基和杂环烯基的那些基团)能为选自：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NH-C(NH 2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-CN和-NO2的数量为0至(2m’+1)的多种基团，其中m’为这类基团中碳原子的总数。R’、R”和R”’各自独立地是指氢、未取代的(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基、被1-3个卤素取代的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基-(C1-C4)烷基。当R’和R” 与相同的氮原子连接时，它们能与氮原子结合以形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”是指包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基的讨论中，本领域技术人员理解术语“烷基”是指包括诸如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)的基团。优选地，取代的烷基和杂烷基具有1至4个取代基，更优选为1、2或3个取代基。例外是那些全卤代烷基(例如，五氟乙基等)，其还是优选的并包含在本发明中。
烷基和杂烷基的取代基(包括常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烃基、杂环烃基、环烯基和杂环烯基的那些基团)能为选自但不限于：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2的数量为0至(2m’+1)的多种基团中的一种或多种，其中m’为这类基团中碳原子的总数。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地是指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，例如，被1-3个卤素取代的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。当本发明的化合物包含多于一个R基团时，例如，当存在多于一个这些基团时，独立地选择各个R基团作为各个R’、R”、R”’和R””基团。当R’和R”与相同的氮原子连接时，它们能与氮原子结合以形成5-、6-或7-元环。例如，-NR’R”是指包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基的讨论中，本领域技术人员理解术语“烷基”是指包括包含与除氢之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
“烷氧基”是指具有将烷氧基与连接点连接或与烷氧基的两个碳连接的氧原子的烷基。烷氧基包括例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。能使用本文描述的多种取代基进一步取代烷氧基。例如，能使用卤素取代烷氧基以形成“卤代-烷氧基”基团。
“羧基烷基”是指被羧基取代的烷基(如本文定义的)。术语“羧基环烃基”是指被羧基取代的环烃基(如本文定义的)。术语烷氧基烷基是被烷氧基取代的烷基(如本文定义的)。本文使用的术语“羧基”是指羧酸及其酯。
“卤代烷基”是指上述定义的烷基，其中一些或所有氢原子被卤素原子取代。卤素(卤代)优选表示氯或氟，但还可为溴或碘。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1，2，3，4，5-五氟-苯基等。术语“全氟”定义为所有可利用的氢均被氟取代的化合物或基团。例如，全氟苯基是指1，2，3，4，5-五氟苯基、全氟甲基是指1，1，1-三氟甲基，且全氟甲氧基是指1，1，1-三氟甲氧基。
“氟-取代的烷基”是指其中一个、一些或所有氢原子均被氟取代的烷基。
本发明的上下文中的“细胞因子”为可参与免疫和炎性反应中细胞-细胞通信的一组蛋白质信号分子的成员。细胞因子通常为质量为约8-35kDa的小的、水可溶的糖蛋白。
“环烃基”是指包含约3至12、3至10或3至7个内环碳原子的环状烃基。环烃基包括稠合的、桥和螺环结构。
“内环”是指包含一部分环结构的原子或一组原子。
“外环”是指被连接但不限定环结构的原子或一组原子。
“环烃基醚”是指具有3或4个内环碳原子和1个内环氧或硫原子的4或5元环烃基(例如，氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、四氢呋喃、四氢噻吩)；或具有1或2个内环氧或硫原子的6至7元环烃基(例如，四氢吡喃、1，3-二噁烷、1，4-二噁烷、四氢噻喃、1，3-二噻烷、1，4-二噻烷、1，4-氧硫杂环己烷)。
“烯基”是指具有至少一个双键的2至6个碳原子的直链或支链烃。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1，3-戊二烯基、1，4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，5-己二烯基、2，4-己二烯基或1，3，5-己三烯基。烯基还能具有2至3、2至4、2至5、3至4、3至5、3至6、4至5、4 至6和5至6个碳。烯基通常为单价的，但能为二价的，例如当烯基将两部分连接在一起时。
“亚烯基”是指连接至少两个其它基团的上述定义的烯基，即，二价烃基。与亚烯基连接的两部分能与亚烯基的相同原子或不同原子连接。亚烯基包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、异亚丙烯基、亚丁烯基、异亚丁烯基、仲亚丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。
“炔基”是指具有至少一个三键的2至6个碳原子的直链或支链烃。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1，3-戊二炔基、1，4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1，3-己二炔基、1，4-己二炔基、1，5-己二炔基、2，4-己二炔基或1，3，5-己三炔基。炔基还能具有2至3、2至4、2至5、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6和5至6个碳。炔基通常为单价的，但能为二价的，例如当炔基将两部分连接在一起时。
“亚炔基”是指连接至少两个其它基团的上述定义的炔基，即，二价烃基。与亚炔基连接的两部分能与亚炔基的相同原子或不同原子连接。亚炔基包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、仲亚丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。
“环烃基”是指包含3至12个环原子或规定数量的原子的饱和或部分不饱和的、单环、稠合的双环或桥多环环组合。单环包括例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。双环和多环包括例如，降莰烷、癸烷和金刚烷。例如，C3-8环烃基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环辛基和降莰烷。
“环亚烃基”是指连接至少两个其它基团的上述定义的环烃基，即，二价烃基。与环亚烃基连接的两部分能为与环亚烃基的相同原子或不同原子连接。环亚烃基包括但不限于环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基和环亚辛基。
“杂环烃基”是指具有3个环成员至约20个环成员和1至约5个诸如N、O和S的杂原子的环体系。还能使用另外的杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子还能为氧化的，例如但不限 于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂环包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、二氢吲哚基、奎宁环基和1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基。
“杂环亚烃基”是指连接至少两个其它基团的上述定义的杂环烃基。与杂环亚烃基连接的两部分能与杂环亚烃基的相同原子或不同原子连接。
“芳基”是指包含6至16个环碳原子的单环或稠合的双环、三环或更大的芳香族环组合。例如，芳基可为苯基、苄基或萘基，优选为苯基。“亚芳基”是指衍生自芳基的二价基团。芳基能被一个、两个或三个选自烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基-烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基和氧基-C2-C3-亚烷基的基团单-、双-或三取代；例如上述定义的，其所有均任选被进一步取代；或1-或2-萘基；或1-或2-菲基。亚烷基二氧基为与苯基的两个邻近碳原子连接的二价取代基，例如亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。氧基-C2-C3-亚烷基还为与苯基的两个邻近碳原子连接的二价取代基，例如氧基亚乙基或氧基亚丙基。氧基-C2-C3-亚烷基-苯基的实例为2，3-二氢苯并呋喃-5-基。
优选作为芳基的是萘基、苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单-或二取代的苯基，特别是苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单-或二取代的苯基-，并且特别是苯基。
作为R的取代的苯基的实例为例如杂环中任选取代的4-氯苯-1-基、3，4-二氯苯-1-基、4-甲氧基苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨基甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羟基乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基、3-氨基甲基苯-1-基、4-N-乙酰基氨基甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3-氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基-苯-1-基、4-(咪唑-1-基)-苯-基、4-(咪唑-1-基甲基)-苯-1-基、4-(吗啉-1-基)-苯-1-基、4-(吗啉-1-基甲基)-苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)-苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)-苯-1-基、4-(噻吩基)-苯-1-基、4-(3-噻吩基)-苯-1-基、4-(4-甲基哌嗪-1-基)-苯-1-基和4-(哌啶基)-苯基和4-(吡啶基)-苯基。
“亚芳基”是指连接至少两个其它基团的上述定义的芳基。与亚芳基连接的两部分与亚芳基的不同原子连接。亚芳基包括但不限于亚苯基。
“亚芳基-氧基”是指上述定义的亚芳基，其中与亚芳基连接的部分中的一个通过氧原子进行连接。亚芳基-氧基包括但不限于亚苯基-氧基。
类似地，芳基和杂芳基的取代基为可变的并选自：-卤素、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO2、-CO2R’、-CONR’R”、-C(O)R’、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR”C(O)2R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-N3、-CH(Ph)2、全氟(C1-C4)烷氧基和全氟(C1-C4)烷基，数量为零至芳香族环体系上开放化合价的总数；并且其中R’、R”和R”’独立地选自氢、(C1-C8)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。
芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可任选被通式-T-C(O)-(CH2)q-U-的取代基替换，其中T和U独立地为-NH-、-O-、-CH2-或单键，并且q为0至2的整数。或者，芳基或杂芳基环邻近原子上的两个取代基可任选被通式-A-(CH2)r-B-的取代基替换，其中A和B独立地为-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，并且r为1至3的整数。如此形成的新环的单键中的一个可任选被双键替换。或者，芳基或杂芳基环的邻近原子上的两个取代基可任选被通式-(CH2)s-X-(CH2)t-的取代基替换，其中s和t独立地为0至3的整数，并且X为-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。-NR’-和-S(O)2NR’-中的取代基R’选自氢或未取代的(C1-C6)烷基。
“杂芳基”是指包含5至16个环原子的单环或稠合的双环或三环芳香族环组合，其中1至4个环原子各自为N、O或S的杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、 苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基或任何其它取代的基团，特别是被例如烷基、硝基或卤素单-或双-取代的基团。吡啶基代表2-、3-或4-吡啶基，有利地为2-或3-吡啶基。噻吩基代表2-或3-噻吩基。优选地，喹啉基代表2-、3-或4-喹啉基。优选地，异喹啉基代表1-、3-或4-异喹啉基。优选地，苯并吡喃基、苯并硫代吡喃基分别代表3-苯并吡喃基或3-苯并硫代吡喃基。优选地，噻唑基代表2-或4-噻唑基，并且最优选为4-噻唑基。三唑基优选为1-、2-或5-(1，2，4-三唑基)。四唑基优选为5-四唑基。
优选地，杂芳基为吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、异噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻吩基、噁唑基、吲唑基或任何其它取代的基团，特别是单-或双取代的基团。
如本文使用的，术语“杂烷基”是指具有1至3个诸如N、O和S的杂原子的烷基。还能使用另外的杂原子，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子还能为氧化的，例如但不限于-S(O)-和-S(O)2-。例如，杂烷基能包括醚、硫醚、烷基-胺和烷基-硫醇。
如本文使用的，术语“杂亚烷基”是指连接至少两个其它基团的上述定义的杂烷基。与杂亚烷基连接的两部分能与杂亚烷基的相同原子或不同原子连接。
“亲电子试剂”是指离子或原子或原子的集合，其可为离子的，具有能够与亲核试剂反应的亲电子中心，即，电子寻找中心。亲电子试剂(electrophile)(或亲电子试剂(electrophilic reagent))为通过接受来自其反应伙伴的两个结合电子而形成与其反应伙伴(亲核试剂)的键的试剂。
“亲核试剂”是指离子或原子或原子的集合，其可为离子的，具有亲核中心，即，寻找亲电子中心或能够与亲电子试剂反应。亲核试剂(或亲核试剂(nucleophile)(nucleophilic reagent))为通过贡献两个连接电子而形成与其反应伙伴(亲电子试剂)的键的试剂。“亲核基团”是指在其与反应基团反应后的亲核试剂。非限制性实例包括氨基、羟基、烷氧基、 卤代烷氧基等。
“马来酰亚胺基”是指吡咯-2，5-二酮-1-基，其具有结构：
其经与巯基(例如，硫代烷基)反应形成具有下列结构的-S-马来酰亚胺基：
其中“·”表示马来酰亚胺基的连接点并且 表示硫醇的硫原子与含原始巯基的基团的剩余部分的连接点。
为了本公开的目的，在蛋白质和多肽中发现的“天然存在的氨基酸”为L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和或L-缬氨酸。蛋白质中发现的“非天然存在的氨基酸”为除天然存在的氨基酸引用的那些之外的任何氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于，天然存在的氨基酸的D异构体，以及天然存在的氨基酸的D和L异构体的混合物。尽管在天然存在的蛋白质中发现诸如4-羟基脯氨酸、锁链素、异锁链素、5-羟基赖氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、3-甲基组氨酸的其它氨基酸，但为了本公开的目的而认为其为在蛋白质中发现的非天然存在的氨基酸，因为通常通过除了mRNA的核糖体转译之外的方法引入它们。
“直链”涉及聚合物的几何学、架构或整体结构时是指具有单一单体衍生的骨架的聚合物。
“支链”涉及聚合物的几何学、架构或整体结构时是指具有2或多个从单一基团延伸的聚合物“臂”的聚合物，例如可为衍生自原子转移自由基聚合反应中使用的引发剂的L基团。支链聚合物可具有2个聚合物臂、3个聚合物臂、4个聚合物臂、5个聚合物臂、6个聚合物臂、7个聚合物臂、8个聚合物臂或更多。为了本公开的目的，具有三个或多个从单一直链基团延伸的聚合物臂的化合物表示为具有“梳状”结构 或“梳状”架构。还能通过”统计”结构实现支链以建立较广泛的树枝状架构。
“药物可接受的”组合物或“药物组合物”是指包含本发明的化合物和一种或多种药物可接受的赋形剂的组合物。
“药物可接受的赋形剂”和“药物可接受的载体”是指能包含在本发明的组合物中并对患者不产生显著不利毒性作用的赋形剂。药物可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、标准盐溶液、乳酸林格氏液、标准蔗糖、标准葡萄糖等。
“患者”或“有需要的个体”是指患有或倾向于患有能通过本文提供的药物组合物的给予来预防或治疗的疾病状态的生物体。非限制性实例包括人、其它哺乳动物或其它非哺乳动物。
“治疗有效量”是指用于治疗、减轻或预防鉴定的疾病或疾病状态，或用于显示可检测的治疗或抑制效果的药物组合物的共轭功能剂的量。能通过本领域已知的任何检验方法检测所述效果。
物质的“生物半衰期”为规定在将物质引入至有机体后将一半的物质从有机体中去除所需的时间的药代动力学参数。
III.含两性离子的无规共聚物
本发明提供了具有诸如磷酰胆碱的两性离子基团和至少一个功能剂的无规共聚物。在一些实施方案中，本发明的无规共聚物具有含磷酰胆碱的第一单体，至少一个具有功能剂或连接基团的第二单体以及具有功能剂或连接基团的引发剂部分，其中所述功能剂能通过连接子与第二单体或引发剂部分连接。
在其它实施方案中，本发明的无规共聚物具有通式I：
在通式I中，单体单元M1和M2为适用于通过诸如原子转移自由基聚合(ATRP)的受控游离自由基方法聚合的任何单体。如分别由x和y1定义的，在无规共聚物中各个单体M1和M2能具有任何合适数量的共聚用单体。M1单体通过亚烷基链与诸如磷酰胆碱的两性离子基团 ZW连接(如由n定义的)。无规共聚物能包含单一共聚用单体M2(z为1)，或能包含若干共聚用单体M2(z大于1)，其中所述不同共聚用单体M2为相同或不同的。共聚用单体M2各自与能为惰性的但改变无规共聚物的性质的R2基团(例如烷基、芳基等)连接，或例如当R2基团包含功能剂A、连接基团LG或引发剂I时R2基团能为功能性的。当R2基团包含这些官能团中的一个时，能任选通过连接子L将官能团与共聚用单体M2连接。R2基团能包含多种官能团和惰性基团以调整无规共聚物的性质和功能。例如，能包含若干不同的靶向剂以及若干不同的药物或治疗性蛋白质作为功能剂A。能通过引发剂I-I’聚合单体M1和M2，所述引发剂I-I’能被断裂为引发剂片段I和自由基清除剂I’。引发剂片段I能为引发聚合的任何基团。自由基清除剂I’能为可逆终止生长聚合物链的任何基团。自由基清除剂I’能为诸如溴的卤素，使得聚合物的末端在聚合后被功能化。此外，能使用R1基团功能化引发剂片段I(但不必须)，所述R1基团能包含多种官能团以调整无规共聚物的功能性。例如，R1基因能包含功能剂A或连接基团LG，其各自通过连接子L任选与引发剂片段I连接。此外，引发剂片段I能具有多种引发位点使得产物聚合物具有若干聚合物臂(s大于1)。
在一些实施方案中，通式I的各个单体M1和M2能独立地为丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基-吡啶或乙烯基-吡咯烷酮。此外，通式I的R1能独立地为H、L1-A1、连接基团LG1或L1-LG1，并且通式I的各个R2独立地为H、C1-20烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-8环烃基、C3-8杂环烃基、芳基、杂芳基、A2、L2-A2、LG2、L2-LG2、I2和L2-I2。通式I的基团ZW为两性离子部分。通式I的基因I和I’能各自独立地为引发剂片段使得I-I’的组合为用于聚合通式I的无规共聚物的引发剂I1。或者，I’能为H或C1-6烷基。基团I2为引发剂。此外，各个基团L1和L2为连接子，各个基团A1和A2为功能剂，并且各个基团LG1和LG2为连接基团。在上述通式I中，下标x和y1各自独立地为1至1000的整数，下标z为1至10的整数，下标s为1至100的整数，并且下标n为1至20的整数，其中R1为L1-A1或R2中的一个为L2-A2。
本发明的无规共聚物能具有用于各个单体M1和M2的任何合适数量的重复单元。用于各个共聚用单体的重复单元的示例性范围包括但不限于约1至约10,000、约10至约5,000、约10至约2,000、约10至约1,500、约10至约1,000、约100至约1,000、约100至约900、约100至约800、约100至约700、约100至约600以及约100至约500。当存在多个M2单体时，各个M2单体能具有不同数量的重复单元。
本发明的无规共聚物能具有任何合适的分子量。本发明无规共聚物的示例性分子量能为约1000至约1,500,000道尔顿(Da)。在一些实施方案中，本发明的无规共聚物的分子量能为约5,000道尔顿、约10,000道尔顿、约25,000道尔顿、约50,000道尔顿、约75,000道尔顿、约100,000道尔顿、约150,000道尔顿、约200,000道尔顿、约250,000道尔顿、约300,000道尔顿、约350,000道尔顿、约400,000道尔顿、约450,000道尔顿、约500,000道尔顿、约550,000道尔顿、约600,000道尔顿、约650,000道尔顿、约700,000道尔顿、约750,000道尔顿、约800,000道尔顿、约850,000道尔顿、约900,000道尔顿、约950,000道尔顿、约1,000,000道尔顿和约1,250,000道尔顿。
本发明的无规共聚物还能具有任何合适数量的共聚用单体M2。例如，共聚用单体的数量，下标z能为1至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。共聚用单体的数量，下标z也能为1至5、1至4、1至3或1至2。在一些实施方案中，本发明的无规共聚物能具有两个不同的单体，其中下标z为1，例如在通式II中：
在其它实施方案中，无规共聚物能具有3个不同的单体，其中下标z为2，例如在通式III中：
在本发明的无规共聚物中能存在另外的共聚用单体M2，例如M2c、M2d、M2e、M2f、M2g、M2h等，其中各个共聚用单体以相同或不同的y1值而存在，并且各个共聚用单体分别具有连接的相应R2基团，R2c、R2d、R2e、R2f、R2g、R2h等。诸如M2a、M2b、M2c等的各个M2基团能为如上述对M2定义的。诸如R2a、R2b、R2c等的各个R2基团能为如上述对R2定义的。类似地，诸如y1a、y1b、y1c等的各个y1基团能为如上述对y1定义的。
在一些实施方案中，无规共聚物能为通式III，其中R2a和R2b各自独立地为H、C1-20烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-8环烃基、C3-8杂环烃基、芳基、杂芳基、A2、L2-A2、LG2或L2-LG2；M2a和M2b各自独立地为丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基-吡啶或乙烯基-吡咯烷酮；并且下标y1a和y1b各自独立地为1至1000的整数。
无规共聚物的不同单体还能以任何合适的比例存在。例如，相对于M1单体，M2单体能以100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶100的比例共同地或单独地存在。此外，相对于M1或任何其它M2单体，各个M2单体能以任何合适的比例存在，例如100∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶100。
本发明的无规共聚物能具有任何合适的结构。例如，无规共聚物能为直链或支链的。当无规共聚物为支链时，它们能具有任何合适数量的共聚物臂，如由通式I的下标s定义的，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90和多达100个臂。在一些实施方案中，下标s能为1至20、1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2。本发明的无规共聚物能采取任何合适的结构。例如，无规共聚物能为直链、支链、星形、树枝状、树状、梳形等。
无规共聚物的功能剂能与共聚用单体M2中的一个或与引发剂片 段I或二者连接。当存在多种功能剂时，功能剂能与共聚用单体M2和引发剂片段I二者连接。在一些实施方案中，无规共聚物具有通式IIa：
在通式IIa中，功能剂A1能为药物或治疗性蛋白质并且功能剂A2能为靶向剂。或者，功能剂A1能为靶向剂并且功能剂A2能为药物或治疗性蛋白质。此外，功能剂A1和A2能均为治疗剂。能选择功能剂以抑制(或激活)相同分子通路中的不同靶向，提供主要通路和补充通路二者的抑制(或激活)，或在不同的结合部位下抑制(或激活)相同靶向以减少抵抗力或允许使用较低剂量以最小化毒性。此外，连接子L1和L2能为相同或不同的。例如，例如当与药物或治疗性蛋白质连接时，连接子L1能为可断裂连接子以促进药物或治疗性蛋白质的释放，同时例如当与靶向剂连接时连接子L2能为不可断裂连接子。此外，连接子L1能为不可断裂连接子，同时连接子L2能为可断裂连接子。或者，连接子L1和L2二者均能为可断裂连接子或不可断裂连接子。此外，与靶向剂连接的连接子还能为可断裂连接子。或者，L1和L2中的一个或二者能为自分解或双前药连接子。
当存在多种共聚用单体M2时，各个共聚用单体M2能具有连接的不同功能剂。例如，无规共聚物能具有通式IIIa：
当存在多种共聚用单体M2时，各个共聚用单体M2能具有连接的不同功能剂。例如，无规共聚物能具有通式IIIa：
在通式IIIa中，M2a和M2b能为如上述对M2定义的；A2a和A2b能为如上述对A2定义的；L2a和L2b能为如上述对L2定义的；并且y1a和y1b能为如上述对y1定义的。在一些实施方案中，各个L2a和L2b为连接子；并且各个A2a和A2b为功能剂。
通式IIIa中的功能剂A2a和A2b能为相同或不同的。功能剂A2a能为药物或治疗性蛋白质并且功能剂A2b能为靶向剂。或者，功能剂A2a和A2b均能为靶向剂，并且功能剂A1能为药物或治疗剂。功能剂A2a和A2b二者还能为药物或治疗剂，同时功能剂A1为靶向剂。当功能剂A2a和A2b均为药物或治疗剂时，各个功能剂A2a和A2b能为不同的药物或治疗剂。此外，功能剂A2a和A2b中的一个能为药物或治疗剂并且其它能为靶向剂，其中功能剂A1能为任何功能剂。
如上述对通式IIa描述的，通式IIIa的连接子L1、L2a和L2b能为相同或不同的。例如，当与药物或治疗剂连接时，连接子L1能为可断裂连接子以促进药物或治疗剂的释放，同时当与靶向剂连接时，连接子L2a和L2b能为不可断裂连接子。或者，连接子L1还能为不可断裂连接子并且连接子L2a和L2b能为可断裂连接子。此外，连接子L2a和L2b能为相同或不同的，例如在一个为可断裂连接子且另一个为不可断裂连接子的情况下。连接子L2a和L2b还能为不同的可断裂连接子，例如当各自与药物连接以提供不同药物的不同释放速率时。
在一些实施方案中，没有与引发剂片段I连接的功能剂，例如在通式IIIb中：
在通式IIIb中，M2a和M2b能为如上述对M2定义的；A2a和A2b能为如上述对A2定义的；L2a和L2b能为如上述对L2定义的；并且y1a和y1b能为如上述对y1定义的。在一些实施方案中，各个L2a和L2b为连接子；并且各个A2a和A2b为功能剂。
在通式IIIb中，如上述描述的，功能剂A2a和A2b能为相同或不同的，并且连接子L2a和L2b能为相同或不同的。在其它实施方案中，共 聚用单体M2中的一个不具有功能剂或连接基团，例如在通式IIIc中：
在通式IIIc中，M2a和M2b能为如上述对M2定义的；A2a能为如上述对A2定义的；L2a能为如上述对L2定义的。类似地，y1a和y1b能为如上述对y1定义的。
当本发明的无规共聚物中存在另外的共聚用单体M2时，相应的连接子L2能与如上述描述的连接子L1、L2a和L2b相同或不同。此外，相应的功能剂A2能与如上述描述的功能剂A1、A2a和A2b相同或不同。
在一些实施方案中，无规共聚物具有与引发剂片段I和共聚用单体M2中的一个或二者连接的连接基团LG，例如在下列结构中示出的：
连接基团LG2促进聚合后功能剂和引发剂基团的“点击”或共价化学连接。
当时存在多个共聚用单体M2时，共聚用单体能与功能剂或连接基团连接，例如下列通式示出的：
其中M2a和M2b能为如上述对M2定义的；LG2a能为如上述对LG2 定义的；L2b能为如上述对L2定义的；A2b能为如上述对A2定义的；并且y1a和y1b能为如上述对y1定义的。此外，连接基团能在引发剂片段I上存在，同时功能剂A2与共聚用单体M2连接。或者，当连接基团LG与引发剂片段I连接时，第二连接基团LG能与共聚用单体M2中的一个连接：
此外，功能剂A1能与引发剂片段I连接，同时连接基团LG与共聚用单体M2连接，其中连接基团能为相同或不同的：
其中M2a和M2b能为如上述对M2定义的；L2a和L2b能为如上述对L2定义的；LG2a和LG2b能为如上述对LG2定义的；并且y1a和y1b能为如上述对y1定义的。
在一些实施方案中，当有多种共聚用单体M2时，共聚用单体M2中的一个能与除连接基团LG、功能剂A或引发剂I之外的基团连接。在其它实施方案中，至少一个R2基团为H、C1-20烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-8环烃基、C3-8杂环烃基、芳基或杂芳基。例如，这类结构包括下列：
其中R2a能为H、C1-20烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-8环烃基、C3-8杂环烃基、芳基或杂芳基。在其它实施方案中，R2a能为具有一个或多个正电荷或负电荷的物质，例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、胆碱或透明质酸。其它基团M2a、M2b、y1a、y1b、R2a和LG2b能为上述定义的。
当一些共聚用单体M2的R2为引发剂I2时，能制备更复杂的结构的无规共聚物。例如，能制备梳状聚合物、超支化聚合物、树枝状和树形。当共聚用单体M2上存在引发剂I2时，通常在使用引发剂I-I’聚合后发生使用引发剂I2的聚合。在一些实施方案中，通过I-I’和I2的聚合能为同时的。此外，引发剂I2能通过可断裂或不可断裂连接子L2与共聚用单体M2连接。
在一些实施方案中，能通过随后与一种或多种另外的单体聚合修饰本发明的无规共聚物。例如，在上述通式III中，能在第一聚合中共聚单体M1和M2a，并且能在第二聚合中聚合单体M2b。形成具有两个嵌段的嵌段共聚物，第一嵌段为M1和M2a的无规共聚物，并且第二嵌段为M2b的均聚物。或者，聚合单体M1和M2a后，能使用单体M2c共聚单体M2b，从而形成嵌段共聚物，其中第一嵌段为M1和M2a的无规共聚物，并且第二嵌段为M2b和M2c的无规共聚物。能通过在第一聚中共聚单体M1、M2a和M2b制备另外的聚合物结构，随后在第二共聚中共聚单体M2c、M2d和其它。能通过使用另外的单体的第三聚合制备另外的嵌段。这类聚合物提供了能具有不同性质、药物和功能剂的共聚物的嵌段。
在其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中L-CTP具有通式：
在一些其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中PC为磷酰胆碱；HEMA为甲基丙烯酸羟乙酯；GMA为甲基丙烯酸缩水甘油酯；并且Glu为谷氨酸。
在其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中所述嵌段共聚物具有通式：
A.引发剂
使用任何合适的引发剂聚合本发明的无规共聚物。用于本发明的引发剂能由通式：I-(I’)m描述，其中下标m为1至20的整数。引发剂片段I能为引发聚合的任何基团。自由基清除剂I’能为可逆终止生长聚合物链的任何基团。自由基清除剂I’能为诸如溴的卤素，使得聚合物的末端在聚合后被功能化。此外，能任选使用R1基团功能化引发剂片段I，所述R1基团能包含多种官能团以调整无规共聚物的功能。
用于本发明的引发剂能具有单一的自由基清除剂I’，或任何合适数量的支链使得存在多种各自能够可逆终止生长聚合物链的自由基清除剂I’。当引发剂片段I为支链并能够引发多种聚合物链时，下标m大于1使得存在与生长聚合物链同样多的自由基清除剂I’。
引发剂片段I和自由基清除剂I’之间的键是不稳定的使得聚合过程中单体M1和共聚用单体M2被插入在引发剂片段I和自由基清除剂I’之间。例如，在诸如ATRP的游离自由基聚合过程中，如图1所示，引发剂片段I和自由基清除剂I’分离以形成I和I’基团。然后，引发剂 片段I的自由基与溶液中的单体反应以生长聚合物并形成增长的聚合物自由基(图1的物质A和物质C)。聚合过程中，自由基清除剂I’的自由基与增长的聚合物自由基可逆反应以暂时中止聚合物生长。单体和自由基清除剂I’之间的键也不稳定使得键能断裂并使得增长的聚合物自由基与另外的单体反应以生长聚合物。聚合过程中的最终结果是引发剂片段I在聚合物链的一端并且自由基清除剂I’在聚合物链的另一端。
引发剂片段I的自由基通常在仲碳或叔碳上，并能通过邻近的羰基碳而稳定。自由基清除剂I’通常为诸如溴、氯或碘的卤素。引发剂片段I和自由基清除剂I’一起形成用于制备本发明的无规共聚物的引发剂I1和I2。
多种引发剂能用于制备本发明的无规共聚物，包括US6,852,816(通过引用并入本文)中阐述的大量引发剂。在一些实施方案中，制备本发明的无规共聚物的ATRP反应使用的引发剂选自烷烃、环烷烃、烷基羧酸或其酯、环烃基羧酸或其酯、醚和环烃基醚、烷基芳基、烷基酰胺、烷基-芳基羧酸及其酯，并在制备非支链无规共聚物的情况下还具有一个自由基清除剂I’，并在制备支链分子的情况下具有多于一个自由基清除剂I’。
用于本发明的自由基清除剂I’包括但不限于诸如Br、Cl和I的卤素，硫氰酸酯(-SCN)和异硫氰酸酯(-N＝C＝S)。其它基团用于本发明的自由基清除剂I’。在一些实施方案中，自由基清除剂I’为溴。
ATRP反应使用的引发剂能为羟基化的。在一些实施方案中，制备本发明的无规共聚物的ATRP反应使用的引发剂选自烷烃、环烷烃、烷基羧酸或其酯、环烃基羧酸或其酯、醚、环烃基醚、烷基芳基、烷基酰胺、烷基-芳基羧酸及其酯，其具有羟基，并在制备非支链无规共聚物的情况下还具有一个自由基清除剂I’，或者，在制备支链分子的情况下具有多于一个自由基清除剂I’。
ATRP反应使用的引发剂能具有一个或多个胺基。在一些实施方案中，制备本发明的无规共聚物的ATRP反应使用的引发剂为烷烃、环烷烃、烷基羧酸或其酯、环烃基羧酸或其酯、醚、环烃基醚、烷基 芳基、烷基酰胺、烷基-芳基羧酸及其酯，其具有胺基并在制备非支链无规共聚物的情况下还具有一个自由基清除剂I’，或者，在制备支链分子的情况下具有多于一个自由基清除剂I’。
具有至少一个自由基清除剂I’并被氨基或羟基取代的包括烷基二羧酸在内的烷基羧酸也能用作引发剂。在本发明的一些实施方案中，在使用ATRP制备本发明的无规共聚物的情况下，引发剂能为具有一个或多个选自氯和溴的卤素的烷基羧酸。
在使用ATRP制备本发明的无规共聚物的情况下，被两个或多个选自-COOH、-OH和-NH2的基团以及至少一个自由基清除剂I’取代的烷烃也能用作用于制备无规共聚物的引发剂。
引发剂还能包含一种或多种包括但不限于-OH、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、-O-烷基、-COOH、-COO-烷基或磷酸酯基团(或其受保护形式)的基团。
多种引发剂可商业获得，例如购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)的溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。根据需要能使用本领域的标准方法制备那些引发剂的合适的受保护形式。
其它引发剂包括热、氧化还原或光引发剂，包括例如，烷基过氧化物、取代的烷基过氧化物、芳基过氧化物、取代的芳基过氧化物、酰基过氧化物、烷基氢过氧化物、取代的芳基氢过氧化物、芳基氢过氧化物、取代的芳基氢过氧化物、杂烷基过氧化物、取代的杂烷基过氧化物、杂烷基氢过氧化物、取代的杂烷基氢过氧化物、杂芳基过氧化物、取代的杂芳基过氧化物、杂芳基氢过氧化物、取代的杂芳基氢过氧化物、烷基过酸酯、取代的烷基过酸酯、芳基过酸酯、取代的芳基过酸酯、偶氮化合物和卤化物。特殊的引发剂包括氢过氧化枯烯(CHP)、叔丁基氢过氧化物(TBHP)、过氧化苯甲酸叔丁酯(TBPB)、过氧碳酸钠、过氧化苯甲酰(BPO)、过氧化月桂酰(LPO)、甲基乙基酮45％、过硫酸钾、过硫酸铵、2，2-偶氮双(2，4--二甲基-戊腈)、1，1-偶氮双(环-己烷甲腈)、2，2-偶氮双(N，N-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐和2，2-偶氮双(2-酰胺基-丙烷)二盐酸盐。诸如过硫酸盐/亚硫酸盐和Fe(2+)过氧化物或过硫酸铵以及N，N，N’N’-四甲基亚乙基二胺(TEMED)的氧 化还原对。
用于制备本发明的无规共聚物的其它引发剂为支链的。具有单一分枝点的合适引发剂包括下列：
其中基团R能为下列中的任一种：
在一些实施方案中，引发剂能为：
其为能在聚合后进行脱保护以形成用于与另外的官能团反应的马来酰亚胺的被保护的马来酰亚胺。
另外的支链引发剂包括但不限于下列，其中基团R如上述定义的：
在一些实施方案中，支链引发剂包括但不限于下列：
用于制备本发明的无规共聚物的其它支链引发剂包括下列：
其中基团R如上述定义的，并且基团X能为CHO、SO2Cl、SO2CH＝CH2、NHCOCH2I、N＝C＝O和N＝C＝S等。另外的X基团能包括下列：
其它引发剂包括但不限于下列：
在其它实施方案中，引发剂能具有若干分枝点以提供多个聚合物臂，例如：
其中基团R如上述定义的。在一些其它实施方案中，引发剂能具有下列结构：
在一些其它实施方案中，引发剂能具有下列结构：
如上所述，能单独将引发剂加入至聚合混合物，或能将所述引发剂与其它分子结合，例如单体(超支化结构)或聚合物片段(例如接枝共聚物)。能通过加热、UV光或本领域技术人员已知的其它方法完成聚合的引发。
在一些实施方案中，本发明的引发剂I-I’具有通式：
(F)r-Sp1-C-Sp2-I’
其中引发剂片段I相应于F-Sp1-C-Sp2。各个基团F为用于与本发明的功能剂或连接基团反应的官能团。r为1至10。基团Sp1和sp2为间隔子并能为用于形成共价键的任何合适基团，例如C1-6烷基、芳基 或杂芳基。基团C能为任何核，其提供一个或多个用于与一个或多个间隔子Sp2(其能为相同或不同的)和一个或多个自由基清除剂I’连接的点，并提供一个或多个用于与一个或多个间隔子Sp1(其能为相同或不同的)和一个或多个官能团F(其能为相同或不同的)连接的点。核C能为任何合适的结构，例如支链结构、包含诸如倍半硅氧烷的杂原子的交联结构和具有多个侧链官能团的直链、短聚合物。此外，能通过用于形成共价键的任何合适的基团将核C与一个或多个Sp1和Sp2间隔子连接，所述基团包括但不限于酯、酰胺、醚和酮。自由基清除剂I’为自由基可转移原子或基团，例如但不限于卤素、Cl、Br、I、OR10、SR11、SeR11、OC(＝O)R11、OP(＝O)R11、OP(＝O)(OR11)2、O-(R11)2、S-C(＝S)N(R11)2、CN、NC、SCN、CNS、OCN、CNO、N3、OH、O、C1-C6-烷氧基、(SO4)、PO4、HPO4、H2PO4、三氟甲磺酸酯、六氟磷酸酯、甲烷磺酸酯、芳基磺酸酯、羧酸卤化物。R10为1至20个碳原子的烷基或其中各个氢原子可被卤化物取代的1至20个碳原子的烷基、2至20个碳原子的烯基、2至10个碳原子的炔基、苯基、被1至5个卤素原子取代的苯基或具有1至4个碳原子的烷基、芳烷基、芳基、芳基取代的烷基，其中所述芳基为苯基或取代的苯基并且烷基具有1至6个碳原子，并且R11为芳基或直链或支链C1-C20烷基或在存在N(R11)2基团的情况下，可将两个R11基团结合以形成5-、6-或7-元杂环。间隔子Sp1共价连接官能团F和核C而间隔子Sp2共价连接核C和自由基清除剂I’。
在其它实施方案中，本发明的引发剂具有通式：
其中各个I’独立地选自卤素、-SCN或-NCS。L4和L5各自独立地为键或连接子使得L4和L5中的一个为连接子。C为键或核基团。LG2为连接基团。并且下标p为1至32，其中当下标p为1时，C为键，并且当下标p为2至32时，C为核基团。在一些其它实施方案中，引发剂具有通式：
其中各个R3和R4独立地选自H、CN或C1-6烷基。
B.单体
用于制备本发明的无规共聚物的单体包括能够自由基聚合的任何单体。通常，这类单体具有乙烯基。合适的单体包括但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基-吡啶和乙烯基-吡咯烷酮单体。包含两性离子部分ZW的单体M1包括但不限于下列：
包含连接基团或功能剂的单体M2包括但不限于下列结构：
其它单体是本领域技术人员已知的，并且包括乙酸乙烯酯及其衍生物。
在一些实施方案中，单体为丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体。在其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中各个R3和R4独立地为H或C1-6烷基；并且PC为卵磷脂。
在一些其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
在其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中A2为喜树碱。
在其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中R4a和R4b能为如上述对R4定义的；R2a和R2b能为如上述对A2定义的；并且y1a和y1b能为如上述对y1定义的。在一些实施方案中，R2a和R2b各自独立地为H、C1-20烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-8环烃基、C3-8杂环烃基、芳基、杂芳基、A2、L2-A2、LG2或L2-LG2；各个R3、R4a和R4b独立地为H或C1-6烷基；下标y1a和y1b各自独立地为1至1000的整数；并且PC为卵磷脂。
在其它实施方案中，无规共聚物能具有下列通式中的任一种：
其中R4a和R4b能为如上述对R4定义的；L2a和L2b能为如上述对L2定义的；A2a和A2b能为如上述对A2定义的；并且y1a和y1b能为如上述对y1定义的。在一些实施方案中，各个L2a和L2b为连接子；并且各个A2a和A2b为功能剂。
C.两性离子
本发明的两性离子包括具有负电荷和正电荷二者的任何化合物。具有负电荷并适用于本发明的两性离子的基团包括但不限于磷酸盐、硫酸盐、其它含氧阴离子等。具有正电荷并适用于本发明的两性离子的基团包括但不限于铵离子。在一些实施方案中，两性离子能为磷酰胆碱。
D.连接子
本发明的无规共聚物还能结合任何合适的连接子L。连接子提供功能剂与引发剂片段I和共聚用单体M2的连接。连接子能为可断裂或不可断裂的，同源双功能或异源双功能的。其它连接子能为既异源双功能又为可断裂的，或既同源双功能又可断裂的。
可断裂连接子包括作为可水解连接子、酶可断裂连接子、pH敏感连接子、二硫化物连接子和光不稳定连接子等的那些。可水解连接子包括在连接子中具有酯、碳酸酯或氨基甲酸酯官能团的那些使得与水反应断裂所述连接子。酶可断裂连接子包括被酶断裂的那些并能包括连接子中的酯、酰胺或氨基甲酸酯官能团。pH敏感连接子包括在一种pH下稳定但在其它pH下不稳定的那些。对于pH敏感连接子，pH能从酸性条件变化至碱性条件、从碱性条件变化至酸性条件、从弱酸性条件变化至强酸性条件、或从弱碱性条件变化至强碱性条件。合适的pH敏感连接子是本领域技术人员已知的并且包括但不限于缩酮、缩醛、亚胺或亚胺鎓、硅氧烷、硅氮烷、硅烷、马来酰胺酸-酰胺键、原酸酯、腙、活化的羧酸衍生物和乙烯基醚。二硫化物连接子特征在于在连接子中具有二硫化物键并在还原条件下断裂。光不稳定连接子包括暴露于光时断裂的那些，例如可见光、红外光、紫外光或其它波长下的电磁辐射。
用于本发明的其它连接子包括在第2008/0241102号(属于Ascendis/Complex Biosystems)和第2008/0152661号(属于Mirus)美国专利申请，以及第WO 2004/010957号和第WO 2009/117531号(属于 Seattle Genetics)以及第WO 01/24763号、第WO 2009/134977号和第WO 2010/126552号(属于Immunogen)国际专利申请(以其整体并入本文)中描述的那些。用于本发明的Miru8连接子包括但不限于下列：
其它连接子包括在Bioconjugate Technique(生物共轭技术)，Greg T.Hermanson，Academic Press，2d Ed.，2008(以其整体并入本文)中描述的那些，以及在Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，6974-6998(Bertozzi，C.R.和Sletten，E.M)(以其整体并入本文)中描述的那些。
在一些实施方案中，连接子L1和L2能具有多达30个原子的长度，各个原子独立地为C、N、O、S和P。在其它实施方案中，连接子L1和L2能为下列中的任一种：-C1-12烷基-、-C3-12环烃基-、-(C1-8烷基)-(C3-12环烃基)-(C0-8烷基)-、-(CH2)1-12O-、(-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-、(-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-、(-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-、(-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4-)1-12O-(CH2)1-12-、-(CH2)1-12-(C＝O)-O-、-(CH2)1-12-O-(C＝O)-、-(苯基)-(CH2)1-3-(C＝O)-O-、-(苯基)-(CH2)1-3-(C＝O)-NH-、-(C1-6烷基)-(C＝O)-O-(C0-6烷基)-、-(CH2)1-12-(C＝O)-O-(CH2)1-12-、-CH(OH)-CH(OH)-(C＝O)-O-CH(OH)-CH(OH)-(C＝O)-NH-、-S-马来酰亚胺基-(CH2)1-6-、-S-马来酰亚胺基-(C1-3烷基)-(C＝O)-NH-、-S-马来酰亚胺基-(C1-3烷基)-(C5-6环烃基)-(C0-3烷基)-、-(C1-3烷基)-(C5-6环烃基)-(C0-3烷基)-(C＝O)-O-、-(C1-3烷基)-(C5-6环烃基)-(C0-3烷基)-(C＝O)-NH-、-S-马来酰亚胺基-(C0-3烷基)-苯基-(C0-3烷基)-、-(C0-3烷基)-苯基-(C＝O)-NH-、-(CH2)1-12-NH-(C＝O)-、-(CH2)1-12-(C＝O)-NH-、-(苯基)-(CH2)1-3(C＝O)-NH-、-S-(CH2)-(C＝O)-NH-(苯基)-、-(CH2)1-12-(C＝O)-NH-(CH2)1-12-、-(CH2)2-(C＝O)-O-(CH2)2-O-(C＝O)-(CH2)2-(C＝O)-NH-、-(C1-6烷 基)-(C＝O)-N-(C1-6烷基)-、乙缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、-N＝CH-、-(C1-6烷基)-S-S-(C0-6烷基)-、-(C1-6烷基)-S-S-(C1-6烷基)-(C＝O)-O-、-(C1-6烷基)-S-S-(C1-6烷基)-(C＝O)-NH-、-S-S-(CH2)1-3-(C＝O)-NH-(CH2)1-4-NH-(C＝O)-(CH2)1-3-、-S-S-(C0-3烷基)-(苯基)-、-S-S-(C1-3-烷基)-(苯基)-(C＝O)-NH-(CH2)1-5-、-(C1-3烷基)-(苯基)-(C＝O)-NH-(CH2)1-5-(C＝O)-NH-、-S-S-(C1-3-烷基)-、-(C1-3-烷基)-(苯基)-(C＝O)-NH-、-O-(C1-C6烷基)-S(O2)-(C1-6烷基)-O-(C＝O)-NH-、-S-S-(CH2)1-3-(C＝O)-、-(CH2)1-3-(C＝O)-NH-N＝C-S-S-(CH2)1-3-(C＝O)-NH-(CH2)1-5-、-(CH2)1-3-(C＝O)-NH-(CH2)1-5-(C＝O)-NH-、-(CH2)0-3-(杂芳基)-(CH2)0-3-、-(CH2)0-3-苯基-(CH2)0-3-、-N＝C(R)-、-(C1-6烷基)-C(R)＝N-(C1-6烷基)-、-(C1-6烷基)-(芳基)-C(R)＝N-(C1-6烷基)-、-(C1-6烷基)-C(R)＝N-(芳基)-(C1-6烷基)-和-(C1-6烷基)-O-P(O)(OH)-O-(C0-6烷基)-，其中R为H、C1-6烷基、C3-6环烃基或具有5-8个内环原子的芳基。
在一些其它实施方案中，连接子L1和L2能为下列中的任一种：-C1-C12烷基-、-C3-C12环烃基-、(-(CH2)1-6-O-(CH2)1-6-)1-12-、(-(CH2)1-4-NH-(CH2)1-4)1-12-、-(CH2)1-12O-、(-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-、-(CH2)1-12-(CO)-O-、-(CH2)1-12-(CO)-NH-、-(CH2)1-12-O-(CO)-、-(CH2)1-12-NH-(CO)-、(-(CH2)1-4-O-(CH2)1-4)1-12-O-(CH2)1-12-、-(CH2)1-12-(CO)-O-(CH2)1-12-、-(CH2)1-12-(CO)-NH-(CH2)1-12-、-(CH2)1-12-O-(CO)-(CH2)1-12-、-(CH2)1-12-NH-(CO)-(CH2)1-12-、-(C3-C12环烃基)-、-(C1-C8烷基)-(C3-C12环烃基)-、-(C3-C12环烃基)-(C1-8烷基)-、-(C1-8烷基)-(C3-C12环烃基)-(C1-8烷基)-和-(CH2)0-3芳基-(CH2)0-3-。
在其它实施方案中，各个连接子L1和L2为独立地选自可水解连接子、酶可断裂连接子、pH敏感连接子、二硫化物连接子和光不稳定连接子的可断裂连接子。
用于本发明的其它连接子包括自分解连接子。有用的自分解连接子是本领域技术人员已知的，例如用于抗体药物共轭物的那些。示例性的自分解连接子在第7,754,681号美国专利中进行描述。
E.连接基团LG
本发明的连接子和功能剂能与引发剂片段I或共聚用单体M2上的连接基团反应以形成键。本发明的连接基团LG能为能与其它官能团形成键的任何合适的官能团，由此将两个基团连接在一起。例如，用于本发明的连接基团LG包括用于点击化学、马来酰亚胺化学和NHS-酯等的那些。与点击化学有关的连接基团包括但不限于通过Huisgen环加成方法形成三唑环的叠氮化物和炔烃(参见第7,375,234号美国专利，以其整体并入本文)。马来酰亚胺化学包括马来酰亚胺烯烃与诸如-OH、-SH或-NH2的亲核试剂的反应以形成稳定的键。其它连接基团包括在Bioconjugate Techniques(生物共轭技术)，Greg T.Hermanson，Academic Press，2d Ed.，2008(以其整体并入本文)中描述的那些。
连接基团和通常建立或引入至功能剂中的一些基团的反应的一些非限制性实例在表I中阐述。
表I
R’为C1-6烷基、C3-6环烃基或具有5-8个内环原子的芳基；
R”为H、C1-6烷基、C3-6环烃基或具有5-8个内环原子的芳基；
R”’为羰基衍生物*-(C＝O)-、*-(C＝O)-(CH2)1-8-S-S-、*-(C＝O)-(CH2)1-8-(C＝O)-O-、*-(C＝O)-(CH2)1-8-O-(C＝O)-、 *-(C＝O)-(CH2)1-8-(C＝O)-NH-或*-(C＝O)-(CH2)1-8-NH-(C＝O)-或者，R”’为*-(C＝O)-O-(CH2)1-8-S-S-、*-(C＝O)-O-(CH2)1-8-(C＝O)-O-、*-(C＝O)-O-(CH2)1-8-O-(C＝O)-、*-(C＝O)-O-(CH2)1-8-(C＝O)-NH-或*-(C＝O)-O-(CH2)1-8-NH-(C＝O)-形式的羰基衍生物，其中”*”表示与琥珀酰亚胺基或苯并三唑基的连接点；
X和Y各自为活化剂、连接子、单体或引发剂片段I、
-C(O)NR1aR1b、-NR1aR1b、C1-6烷基-NR1aR1b、-N(R1a)C(O)R1b、-N(R1a)C(O)OR1b、-N(R1a)C(O)NR1aR1b、-OP(O)(OR1a)2、-S(O)2OR1a、-S(O)2NR1aR1b、-CN、-NO2、环烃基、杂环烃基、芳基和杂芳基。
F.功能剂
用于本发明的无规共聚物的功能剂包括能够靶向特殊配体、受体、配合物、细胞器、细胞、组织、上皮片或器官，或能够治疗特殊疾病状态或疾病态的任何生物剂或合成化合物。特别关注的是共同靶向特殊疾病常见机制的生物活性剂的组合。例如，为在疾病中结合上调的蛋白质的生物药物剂的第一生物活性剂(稳定连接的)；为结合诸如硫酸肝素的细胞外基质组织成分的肽的第二生物活性剂(稳定连接的)；为随时间释放并发挥局部、细胞内作用，例如抗增殖作用的小分子药物的第三生物活性剂(不稳定连接的)。在一些实施方案中，生物活性剂为药物、治疗性蛋白质、小分子、肽、类肽、寡核苷酸(适体、siRNA、microRNA)、纳米颗粒、碳水化合物、脂质、糖脂、磷脂或靶向剂。基于预先确定的化学计量选择共聚用单体的比例(例如，以匹配生物亲和力；以匹配生物化学计量；以给予‘传动’作用)。用于本发明的无规共聚物的其它功能剂包括但不限于放射性同位素标记、荧光团和染剂。
能将功能剂与无规共聚物的引发剂片段I或共聚用单体M2或二者连接。能通过上述可断裂、不可断裂或自分解连接子在聚合之前或之后将功能剂与引发剂片段I或共聚用单体M2连接。还能将功能剂物理吸附或离子吸附于无规共聚物而非共价连接。
能通过首先将功能剂连接至与单体连接的连接基团并使偶联的功 能剂经历适用于合成本发明的无规共聚物的条件来进行与功能剂连接的本发明的无规共聚物的制备。在那些情况下，合适的连接基团能为用于ATRP反应的引发剂(例如，碘化的、溴化的或氯化的化合物/基团)。在功能剂与聚合物聚合反应相容的情况下这类反应方案是可能的并且需要任何随后的处理。然而，在功能剂与适用于聚合的条件不相容的情况下能使用功能剂的偶联以预先形成无规共聚物。此外，在成本使试剂损失而导致合成产率不完美的情况下，特别是在多步合成反应中时常遇到的，能使用功能剂的偶联以预先形成本发明的无规共聚物。
在功能剂与聚合反应使用的条件不相容的情况下，可能期望在聚合反应后引入功能剂。
能广泛选择生物活性剂A。在一些实施方案中，生物活性剂能选自一种或多种基于人类A域支架、双抗体、骆驼、鲨鱼IgNAR抗体、具有修饰特异性的III型纤维蛋白支架、抗体、抗体片段、维生素和辅因子、多糖、碳水化合物、类固醇、脂质、脂肪、蛋白质、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸的药物、疫苗、适体、avimer支架(例如，mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、microRNA、DNA、cDNA、反义结构、核酶等及其组合)。在一个实施方案中，生物活性剂能选自蛋白质、肽、多肽、可溶或细胞结合的、细胞外或细胞内的驱动蛋白、分子马达、酶、细胞外基质物质及其组合。在另一实施方案中，生物活性剂能选自核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如，mRNA、tRNA、snRNA、RNAi、DNA、cDNA、反义结构、核酶等及其组合)。在另一实施方案中，生物活性剂能选自类固醇、脂质、脂肪及其组合。例如，生物活性剂能结合细胞外基质，例如当细胞外基质为透明质酸或硫酸肝素蛋白多糖并且生物活性剂为诸如用于非特异性、静电的、Velcro型结合相互作用的胆碱的带正电荷的部分时。在另一实施方案中，生物活性剂能为非特异性或特异性结合的肽序列。
能设计和/或选择生物活性剂以具有完全活性(例如高水平的激动作用或拮抗作用)。或者，能选择多功能生物活性剂以调节一种靶向蛋白质的活性同时完全影响另一种。
正如镶嵌蛋白质包含细胞外结合域或子域(例如，VEGF和肝素结合表皮生长因子)，能将来自这些结合部位的序列复制为用于聚合物连接的生物活性剂。更广泛地，镶嵌蛋白质代表许多功能域系列(靶向结合、细胞外基质结合、间隔子、亲合力增加、酶)。能以相似方式将选择用于特殊应用的一组生物活性组合以复制一组期望的功能活性。
其它功能剂A包括带电荷的物质，例如胆碱、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和透明质酸等。带电荷的物质用于促进与例如玻璃体的离子连接。
治疗性蛋白质和抗体
在一个特别有用的实施方案中，功能剂为治疗性蛋白质。整个申请中公开了许多治疗性蛋白质，例如但不限于红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、GM-CSF、干扰素α、干扰素β、人生长激素和伊米苷酶。
在一个实施方案中，功能剂能选自特异性识别的多糖、蛋白质或肽生物活性剂，包括但不限于：Aβ、半乳糖苷酶、阿法赛特、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、氨多索韦(DAPD)、安替肽、贝卡普勒明、包括类型A和B和具有肉毒毒素活性的低分子量化合物的肉毒毒素、降钙素、蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin)、地尼白介素、红细胞生成素(EPO)、EPO激动剂、阿法链道酶、红细胞生成刺激蛋白(NESP)、诸如因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XII、因子XIII、血管性假性血友病因子的凝血因子；西利酶(ceredase)、伊米苷酶、α-葡糖苷酶、N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、胶原蛋白、环孢菌素、α防御素、β防御素、去氨加压素、毒蜥外泌肽-4(exendin 4)、细胞因子、细胞因子受体、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、依降钙素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、纤维蛋白原、非格司亭、生长激素人生长激素(hGH)、促生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、GRO-β、GRO-β抗体、诸如骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-6、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素相关肽、OP-1的骨形态发生蛋白；酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子21、CD-40配体、肝素、人血清白蛋白、低分子量肝素(LMWH)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素ω、干扰素ζ、复合干扰素、人赖氨酰氧化酶样-2(LOXL2)；诸如白介素-1受体、白介素-2、白介素-2融合蛋白、白介素-1受体拮抗剂、白介素-3、白介素-4、白介素4受体、白介素-6、白介素-8、白介素-12、白介素-17、白介素-21、白介素-23、p40、白介素-13受体、白介素-17受体的白介素和白介素受体；乳铁蛋白和乳铁蛋白片段、促黄体激素释放激素(LHRH)、胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物、瘦蛋白、胃饥饿素(ghrelin)、胰淀素(amylin)、C-肽，生长激素抑制素、包含奥曲肽的生长激素抑制素类似物、加压素、促卵泡激素(FSH)、伊米苷酶、流感疫苗、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素调理素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、诸如阿替普酶、尿激酶、瑞替普酶、链激酶、帕米普酶、拉诺替普酶和替奈普酶的纤溶酶原激活剂；神经生长因子(NGF)、骨保护素、血小板衍生生长因子、组织生长因子、转化生长因子-1、血管内皮生长因子、白血病抑制因子、角化细胞生长因子(KGF)、神经胶质生长因子(GGF)、T细胞受体、CD分子/抗原、肿瘤坏死因子(TNF)(例如TNF-α和TNF-β)、TNF受体(例如TNF-α受体和TNF-β受体)、CTLA4、CTLA4受体、单核细胞趋化蛋白-1、内皮生长因子、甲状旁腺素(PTH)、胰高血糖素样肽、生长激素、胸腺素α1、拉布立酶、胸腺素α1IIb/IIIa抑制剂、胸腺素β10、胸腺素β9、胸腺素β4、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4(非常晚期抗原-4)、VLA-4抑制剂、二膦酸酯、呼吸道合胞病毒抗体、囊性纤维化跨膜转导调节器(CFTR)基因、脱氧核糖核酸酶(Dnase)、杀菌/渗透增强蛋白(BPI)和抗-CMV抗体。示例性单克隆抗体包括依那西普(由与IgG1的Fc部分连接的人75kD TNF受体的细胞外配体-结合部分组成的二聚融合蛋白)、阿昔单抗、阿达木单抗、阿非莫单抗、阿仑单抗、B-淋巴细胞抗体、atlizumab、巴利昔单抗、贝伐单抗、比西单抗、柏替木单抗、CDP-484、CDP-571、CDP-791、CDP-860、CDP-870、西妥昔单抗、克立昔单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、芳妥珠单抗、加维莫单抗、吉妥单抗奥佐米星、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英夫利昔单抗、伊诺莫单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、乐德木单抗、奥马珠单抗、放射性同位素标记的lym-1、美替木单抗、美泊利单抗、米妥莫单抗、莫罗莫那-CD3、奈巴库单抗、那他珠单抗、奥度莫单抗、奥马佐单抗、奥伐伏单抗(oregovomab)、帕利珠单抗、帕尼单抗、培克珠单抗(pexelizumab)、rhuMAb-VEGF、利妥昔单抗、沙妥莫单抗喷地肽、司韦单抗、西利珠单抗(siplizumab)、托西莫单抗、I131托西莫单抗、曲妥珠单抗、妥韦单抗、维西珠单抗及其片段和模拟物。功能剂还包含结合这些特异性识别的多糖、蛋白质或肽生物活性剂的试剂。
在一个实施方案中，生物活性剂为融合蛋白。例如但不限于，生物活性组分能为与一个或多个某些有用的肽序列稠合的免疫球蛋白或免疫球蛋白的一部分。例如，生物活性剂可包含抗体Fc片段。在一个实施方案中，生物活性剂为CTLA4融合蛋白。例如，生物活性剂能为Fc-CTLA4融合蛋白。在另一实施方案中，生物活性剂为因子VIII融合蛋白。例如，生物活性剂能为Fc-因子VIII融合蛋白。
在一个特别有用的实施方案中，生物活性剂为人蛋白质或人多肽，例如，异源产生的人蛋白质或人多肽。本文公开了许多有相应的人形式的蛋白质和多肽(即，通常在人体的人细胞中产生的蛋白质或肽)。因此，在一个实施方案中，生物活性剂为本文公开的有相应的人形式的人形式的各种蛋白质和多肽。这种人蛋白质的实例包括但不限于人抗体、人酶、人激素和诸如粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素(例如，α干扰素和β干扰素)、人生长激素和红细胞生成素的人细胞因子。
可当生物活性剂的治疗性蛋白质的其它实例包括但不限于因子VIII、b-域删除因子VIII、因子VIIa、因子IX、抗凝血剂；水蛭素、阿替普酶、tpa、瑞替普酶、tpa、5域删除的tpa-3、胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、长效胰岛素类似物、hgh、胰高血糖素、tsh、促卵泡素-β、fsh、gm-csf、pdgh、ifnα2、ifnα2a、ifn α2b、inf-α1、复合干扰素、ifn-β、ifn-β1b、ifn-βl a、ifn-γ(例如，1和2)、ifn-λ、ifn-δ、il-2、il-11、hbsag、ospa、针对t-淋巴细胞抗原的小鼠单 克隆抗体、针对tag-72的小鼠单克隆抗体、肿瘤相关的糖蛋白、衍生自针对血小板表面受体gpII(b)/III(a)的嵌合单克隆抗体的fab片段、针对肿瘤相关的抗原ca125的小鼠单克隆抗体片段、针对人癌胚抗原的小鼠单克隆抗体片段、cea、针对人心肌球蛋白的小鼠单克隆抗体片段、针对肿瘤表面抗原psma的小鼠单克隆抗体片段、针对hmw-maa的小鼠单克隆抗体片段(fab/fab2混合物)、针对癌-相关的抗原的小鼠单克隆抗体片段(fab)、针对nca 90的单克隆抗体片段(fab)、表面粒细胞非特异性交叉反应抗原、针对在b淋巴细胞表面上发现的cd20抗原的嵌合单克隆抗体、针对il2受体的α链的人源化单克隆抗体、针对il2受体的α链的嵌合单克隆抗体、针对tnf-α的嵌合单克隆抗体、针对呼吸道合胞病毒表面上的抗原表位的人源化单克隆抗体、针对her2的人源化单克隆抗体、人表皮生长因子受体2、针对细胞角蛋白肿瘤相关的抗原抗-ctla4的人单克隆抗体、针对b淋巴细胞阿法链道酶-αdnase的cd20表面抗原的嵌合单克隆抗体、β葡糖脑苷酯酶、tnf-α、il-2-白喉毒素融合蛋白、tnfr-lgg片段融合蛋白拉罗尼酶、dnaases、阿法赛特、α达贝泊汀(集落刺激因子)、托西莫单抗、小鼠单克隆抗体、阿仑单抗、拉布立酶、β半乳糖苷酶、特立帕肽、甲状旁腺激素衍生物、阿达木单抗(lgg1)、阿那白滞素、生物调节剂、奈西立肽、人b-型利钠肽(hbnp)、集落刺激因子、培维索孟、人生长激素受体拮抗剂、重组激活的蛋白质c、奥马佐单抗、免疫球蛋白e(lge)阻滞剂、替伊莫单抗、ACTH、胰高血糖素、生长激素抑制素、生长激素、胸腺素、甲状旁腺激素、色素激素、生长调节素、红细胞生成素、促黄体激素、绒毛膜促性腺激素、下丘脑释放因子、依那西普、抗利尿激素、催乳激素和促甲状腺激素。能使用天然(例如，丝氨酸至半胱氨酸替代)(例如，红木生物科学方法中的甲醛)或非天然氨基酸修饰任意这些以具有位点特异性结合点(N-末端或C-末端或其它位置)。
可充当生物活性剂的治疗性抗体(或其各自的scFv或Fab片段)的实例包括但不限于HERCEPTINTM(曲妥珠单抗)(Genentech，CA)，其为用于治疗患有转移性乳腺癌的患者的人源化抗HER2单克隆抗体；REOPROTM(阿昔单抗)(Centocor)，其为用于预防血栓形成的血小板上 的抗糖蛋白IIb/IIIa受体；ZENAPAXTM(达利珠单抗)(Roche Pharmaceuticals，Switzerland)，其为用于预防急性肾移植排斥的免疫抑制的人源化抗CD25单克隆抗体；PANOREXTM，其为小鼠抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2，其为小鼠抗独特型(GD3抗原表位)IgG抗体(ImClone System)；IMC-C225，其为嵌合抗EGFR IgG抗体(ImClone System)；VITAXINTM，其为人源化抗αVβ3整合素抗体(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；Campath；Campath 1H/LDP-03，其为人源化抗CD52IgG1抗体(Leukosite)；Smart M195，其为人源化抗CD33IgG抗体(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXANTM，其为嵌合抗CD2O IgG1抗体(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM，其为人源化抗CD22IgG抗体(Immunomedics)；ICM3为人源化抗ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114为灵长类抗CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi)；ZEVALINTM为放射性同位素标记的小鼠抗CD20抗体(IDEC/Schering AG)；IDEC-131为人源化抗CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151为灵长源抗CD4抗体(IDEC)；IDEC-152为灵长源抗CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗CD3为人源化抗CD3IgG(Protein Design Lab)；5G1.1为人源化抗补体因子5(CS)抗体(Alexion Pharm)；D2E7为人源化抗TNF-α抗体(CATIBASF)；CDP870为人源化抗TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151为灵长源抗CD4IgG1抗体(IDEC Pharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4为人抗CD4IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571为人源化抗TNF-αIgG4抗体(Celltech)；LDP-02为人源化抗α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A为人源化抗CD4IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVATM为人源化抗CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGRENTM为人源化抗VLA-4IgG抗体(Elan)；CAT-152，人抗TGF-β2抗体(Cambridge Ab Tech)；西妥昔单抗(BMS)为单克隆抗EGF受体(EGFr)抗体；Bevacizuma(Genentech)为抗VEGF人单克隆抗体；英夫利昔单抗(Centocore，JJ)为用于治疗自身免疫病症的嵌合(小鼠和人)单克隆抗体；吉妥单抗奥佐米星(Wyeth)为用于化疗的单克隆抗体；并且兰尼单 抗(Genentech)为用于治疗黄斑变性的嵌合(小鼠和人)单克隆抗体。
建立抗体药物共轭物的现有方法的范围通常依赖在一至八个位点将单一毒素样分子以及连接子与抗体结合。本发明概述的方法包括通过可断裂或不可断裂连接化学将无规共聚物与免疫球蛋白连接。设计共聚物以具有多个通过可断裂(包括自分解)或不可断裂连接化学进行化学计算连接的小分子生物活性部分的副本。由于本发明固有的另外适应性，因此能通过与聚合物共聚用单体结合或连接而包含多于一种类型的生物活性部分和更多的各个生物活性部分的副本，例如10、20、50、100、250或500。包含更多的能力使得人们扩展了除毒素之外的抗体药物共轭物的前景以包含具有协同生物学的其它小分子药物(非限制性实例包括包括帕尼单抗和kras抑制剂；阿达木单抗和p38或JAK抑制剂；贝伐单抗和cMet抑制剂)。结果是靶向性分布，病灶递送、降低靶向作用的调整的药物释放动力学。此外，小分子生物活性与聚合物骨架共聚用单体的连接拯救了具有差的口服吸收、分布、代谢和/或排泄或其它缺点的生物活性。所有结果为由多功能性、低的Cmax、增加的药物负载和其它益处导致的功效的阶跃变化。重要地，使用与常见聚合物核或支架连接的不同生物活性剂建立联合治疗的该方法导致产生能为协同的并能显著提高功效同时减少毒性的局部组织治疗作用。
还能将本发明的抗体与本领域范围内描述或已知的治疗剂连接以形成抗体药物共轭物(ADC)。靶向治疗提供了与现有技术相比的若干优点，包括降低的非特异性毒性和提高的功效。诸如单克隆抗体(mABs)和mAB片段(scFv和FAb’)的抗体的靶向性质能够递送与mAB偶联的有效治疗剂。治疗剂能为任何有用的药物、蛋白质、肽或放射性核素。用于与本发明的无规共聚物组合的抗体药物共轭物在例如，第7,745,394号(Seattle Genetics)、第7,695,716号(Seattle Genetics)、第7,662,387号(Seattle Genetics)、第7,514,080号(ImmunoGen)、第7,491,390号(Seattle Genetics)、第7,501,120号(ImmunoGen)、第7,494,649号(ImmunoGen)和第7,374,762号(ImmunoGen)美国专利中进行描述。
蛋白质、肽和氨基酸
能通过任何有用的方法制备用作本文公开的生物活性剂的蛋白质和肽，所述方法包括通过体外合成和通过在生物系统中制备来生产。本领域熟知的体外合成方法的典型实例包括固相合成(“SPPS”)和固相片段缩合(“SPFC”)。用于制备蛋白质的生物系统也是本领域熟知的。细菌(例如，大肠杆菌(E coli)和芽孢杆菌(Bacillussp.))和酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris))广泛用于制备异源蛋白质。此外，能使用诸如哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞)的动物细胞系完成用于制备用作本文公开的生物活性剂的异源基因表达。在一个特别有用的实施方案中，在诸如牛、绵羊、山羊和鸟(例如，鸡、鹌鹑、鸭和火鸡)的转基因或克隆动物中制备生物活性剂，其各自为本领域了解的。参见例如，2004年8月24日发布的第6,781,030号美国专利，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
在诸如鸡的家禽中制备的诸如蛋白质的生物活性剂能称为“禽源”生物活性剂(例如，禽源治疗性蛋白质)。禽源治疗性蛋白质的制备在本领域是已知的并在例如，2004年5月4日发布的第6,730,822号美国专利中进行描述，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
在其中生物活性剂为蛋白质或多肽的实施方案中，存在于蛋白质多肽序列的氨基酸中的官能团能用于将试剂与无规共聚物连接。能将蛋白质或多肽生物活性剂的连接基团制备为其序列中的天然存在的氨基酸或制备为加入至序列或代替其它氨基酸而被插入的天然存在的氨基酸，例如由半胱氨酸代替丝氨酸。
除了在蛋白质和多肽中发现的常见天然存在的氨基酸之外，蛋白质或多肽生物活性剂还可包含非天然存在的氨基酸。除了出于改变多肽或蛋白质的性质的目的而存在之外，能引入非天然存在的氨基酸以提供能用于将蛋白质或多肽与无规共聚物直接连接的官能团。此外，能以该方式使用天然存在的氨基酸，例如半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸。
能通过多种方法将非天然存在的氨基酸引入至蛋白质和肽。用于引入非天然氨基酸的一些技术在第5,162,218号美国专利中进行描述， 其公开内容以其整体通过引用并入本文。首先，能通过在氨基酸侧链上或在氨基末端或羧基末端处化学修饰多肽或蛋白质引入非天然存在的氨基酸。蛋白质或肽的化学修饰的非限制性实例可为通过诸如重氮甲烷的试剂的甲基化，或在存在于赖氨酸侧链的氨基处或在肽或蛋白质的氨基末端处引入乙酰化。蛋白质/多肽氨基修饰以制备非天然氨基酸的其它实例为使用3-巯基丙亚胺酸甲酯或2-亚氨基硫烷以引入具有功能性的硫醇(巯基，-SH)，其与蛋白质或多肽中具有伯胺的位置连接。一旦引入，则能使用这类基团以形成与蛋白质或多肽的共价连接。
其次，能在化学合成过程中将非天然存在的氨基酸引入至蛋白质和多肽。合成方法通常用于制备具有少于约200个氨基酸，通常具有少于约150个氨基酸，并且更通常具有100个或更少的氨基酸的多肽。能通过化学合成制备具有具有少于约75个或少于约50个氨基酸的较短的蛋白质或多肽。
特别便于使非天然氨基酸在期望位置插入的合成制备方法是本领域已知的。合适的合成多肽制备方法能基于Merrifield固相合成方法，其中将氨基酸依次加入至生长的链(Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156)。现在可从诸如Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Calif.94404；New Brunswick S cientific，Edison，N.J.08818；和Pharmacia，Inc.，Biotechnology Group，Piscataway，N.J.08854的供应商商购用于通过这类技术合成多肽的自动化系统。
能在多肽的化学合成过程中引入的非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于：D-氨基酸和20种天然存在的氨基酸的D和L-形式的混合物、N-甲酰基甘氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、羟基脯氨酸、β-丙氨酸、羟基缬氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔丁基甘氨酸(叔亮氨酸、2-氨基-3，3二甲基丁酸)、羟基-叔丁基甘氨酸、氨基丁酸、环亮氨酸、4-羟基脯氨酸、焦谷氨酸(5-氧代脯氨酸)、氮杂环丁烷羧酸、哌啶酸、二氢吲哚-2-羧酸、四氢-3-异喹啉羧酸、2，4-二氨基丁酸、2，6-二氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、2，6-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、5-羟基赖氨酸、神经氨酸和3，5-二碘酪氨酸。
第三，能通过在相应于待插入非天然氨基酸的位置的密码子处编 码多肽的DNA序列(例如，基因)中插入无义密码子(例如，琥珀密码子或赭石密码子)的体内或体外生物合成来引入非天然存在的氨基酸。这种技术例如在第5,162,218号和第6,964,859号美国专利中进行讨论，其公开内容以其整体通过引用并入本文。多种方法能用于插入包括寡核苷酸定点突变在内的突变密码子。随后在系统中体内或体外转录和翻译改变的序列，所述系统提供了针对使用期望的非天然存在的氨基酸通过化学或酶来酰化的无义密码子的抑制型tRNA。在相应于无义密码子的位置插入合成氨基酸。为了制备较大和/或糖基化多肽，通常优选的是该类型的重组制备技术。能以该方式引入的氨基酸为：甲酰基甘氨酸、氟丙氨酸、2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸、高半胱氨酸、高精氨酸等。获得蛋白质中的非天然氨基酸的其它类似方法包括蛋氨酸替代物方法。
在非天然存在的氨基酸具有易受选择性修饰的功能的情况下，它们特别用于形成与蛋白质或多肽的共价连接基团。其中功能性为易受选择性修饰的情况包括该功能性是唯一的情况下的那些或可在感兴趣的条件下反应的其它功能性在立体化学或其它方面受阻的情况下的那些。
将诸如单一域抗体的其它抗体用于本发明。单一域抗体(sdAb，由Ablynx称为纳米抗体)为由单一单体可变抗体域组成的抗体片段。如同整个抗体，sdAb能够与特异性抗原选择性结合。由于分子量仅为12-15kDa，因此单一域抗体明显小于常见的整个抗体(150-160kDa)。单一域抗体为长度为约110个氨基酸的肽链，其包含重链抗体或常见IgG的一个可变域(VH)。
与整个抗体不同，sdAbs不显示补体系统触发的细胞毒性，因为它们缺乏Fc区域。骆驼源和鱼源sdAbs能够结合不易接近整个抗体的隐蔽抗原，例如酶的活性部位。
能通过具有期望抗原的单峰骆驼、骆驼、美洲驼、羊驼或鲨鱼的免疫获得单一域抗体(sdAb)并随后分离用于重链抗体的mRNA编码。或者，能通过筛选合成库制备它们。骆驼为生物科骆驼科的成员，是胼足亚目中唯一生存的科。骆驼、单峰骆驼、双峰骆驼、美洲驼、羊 驼、驼马 和栗色羊驼在该组中。
用于本发明的肽还包括但不限于大环肽、大环寡肽、LDL受体A-域、蛋白支架(如在第60/514,391号美国专利中讨论的，以其整体并入本文)、可溶性受体、酶、肽多聚体、域多聚体、抗体片段多聚体和融合蛋白。
药物
在另一实施方案中，生物活性剂还能选自特异性识别的药物或治疗剂，其包括但不限于：他克林、美金刚、卡巴拉汀、加兰他敏、多奈哌齐、左乙拉西坦、瑞格列奈、阿托伐他汀、阿法赛特、他达拉非(tadalafil)、伐地那非、西地那非、福沙那韦、奥司他韦、伐昔洛韦和缬更昔洛韦、阿巴瑞克、阿德福韦、阿夫唑嗪、阿洛司琼、阿米福汀、胺碘酮、氨基己酸、氨基马尿酸钠、氨鲁米特、氨基乙酰丙酸、氨基水杨酸、氨氯地平、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、阿瑞吡坦、阿立哌唑、天冬酰胺酶、阿扎那韦、阿托莫西汀、蒽环类、贝沙罗汀、比卡鲁胺、博来霉素、硼替佐米、布舍瑞林、白消安、卡麦角林、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、西司他丁钠、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖孢苷、喜树碱、13-顺式视黄酸、全反式视黄酸；达卡巴嗪、更生霉素、达托霉素、柔红霉素、去铁胺、地塞米松、双氯芬酸、己烯雌酚、多西他赛、阿霉素、度他雄胺、依来曲普坦、恩曲他滨、恩夫韦地、依普利酮、表柔比星、雌莫司汀、炔雌醇、依托泊苷、依西美坦、依泽替米贝、芬太尼、非索非那定、氟达拉滨、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、氟他胺、氟替卡松、戊聚糖、氟维司群、γ-羟基丁酸、吉非替尼、吉西他滨、肾上腺素、左旋多巴、羟基脲、艾考糊精、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、伊曲康唑、戈舍瑞林、拉罗尼酶(laronidase)、兰索拉唑、来曲唑、亚叶酸、左旋咪唑、赖诺普利、左甲状腺素钠、洛莫司汀、氮芥、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、美金刚、巯嘌呤、对甲氧酚、重酒石酸间羟胺、甲氨蝶呤、甲氧氯普胺、美西律、美格鲁特、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、莫达非尼、纳洛酮、萘普生、奈韦拉平、 尼古丁、尼鲁米特、硝唑尼特、尼替西农、炔诺酮、奥曲肽、奥沙利铂、帕洛诺司琼、帕米磷酸、培美曲塞、培高利特、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆钠、强的松、丙卡巴肼、丙氯拉嗪、昂丹司琼、帕洛诺司琼、奥沙利铂、雷替曲塞、瑞舒伐他汀、西罗莫司、链佐星、吡美莫司、舍他康唑、他克莫司、它莫西芬、替加色罗、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、四氢大麻醇、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替哌、噻托、托吡酯、拓扑替康、曲前列尼尔(treprostinil)、维甲酸、伐地昔布、塞来昔布、罗非昔布、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立康唑、多拉司琼、格拉司琼、福莫特罗、氟替卡松、亮丙瑞林、咪达唑仑、阿普唑仑、两性霉素B、鬼臼毒素、核苷抗病毒剂、芳酰基腙、舒马曲坦、依来曲普坦；大环内酯类，例如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素、环酯红霉素、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、氯雷他定、地氯雷他定、白霉素、美欧卡霉素、罗他霉素和阿奇霉素以及swinolide A；氟喹诺酮类，例如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星；氨基糖苷类，例如庆大霉素、奈替米星、草履虫素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和链霉素，万古霉素、替考拉宁、雷莫拉宁、麦地拉宁、粘菌素、达托霉素、短杆菌肽、粘菌素甲磺酸盐(colistimethate)；多粘菌素类，例如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯类；包括诸如青霉素G、青霉素V的青霉素酶敏感剂在内的青霉素类；抗青霉素酶试剂，例如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏阴性微生物活性剂，例如氨比西林、阿莫西林和海他西林，西林和galampicillin；抗假单胞菌青霉素，例如羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；头孢菌素类，例如头孢泊肟、头孢丙烯、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑啉、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星、头孢呋辛、 头孢雷特、头孢噻肟、头孢曲嗪、头孢乙腈、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、氯碳头孢和拉氧头孢；诸如氨曲南的单环内酰胺类；以及碳青霉烯类，例如亚胺培南、美罗培南和厄他培南，喷他脒羟乙磺酸盐、沙丁胺醇硫酸盐、利多卡因、硫酸间羟异丙肾上腺素、丙酸倍氯米松、曲安奈德、布地奈德、沙美特罗、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠和酒石酸麦角胺；紫杉烷类，例如紫杉醇；SN-38和酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostines)。在其它实施方案中，生物活性剂还可选自氨基马尿酸钠盐、两性霉素B、阿霉素、氨基己酸、氨基乙酰丙酸、氨基水杨酸、重酒石酸间羟胺、帕米膦酸二钠、柔红霉素、左旋甲状腺素钠、赖诺普利、西司他丁钠、美西律、头孢氨苄、去铁胺和氨磷汀。
用于本发明的其它生物活性剂包括细胞外基质靶向剂、功能转运部分和标记剂。细胞外基质靶向剂包括但不限于肝素结合部分、基质金属蛋白质酶结合部分、赖氨酰氧化酶结合域、带负电荷的部分或带正电荷的部分和透明质酸。功能转运部分包括但不限于血脑屏障转运部分、细胞内转运部分、细胞器转运部分、上皮转运域和肿瘤靶向部分(叶酸、其它)。在一些实施方案中，用于本发明的靶向剂靶向抗TrkA、抗A-β(肽1-40、肽1-42、单体形式、寡聚形式)、抗IGF1-4、激动剂RANK-L、抗ApoE4或抗ApoAl等。
诊断剂
用于本发明的无规共聚物的诊断剂包括成像剂和检测剂，例如放射性同位素标记、荧光团、染剂和造影剂。
成像剂是指与本发明的无规共聚物连接的标记用于使个体中的肿瘤、器官或组织成像。成像部分能与无规共聚物共价连接或非共价连接。适用于本发明的成像部分的实例包括但不限于放射性核素、诸如荧光素、若丹明，德克萨斯红、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5和荧光团范围内的AlexaFluor(Invitrogen，Carlsbad，CA)的荧光团、抗体、钆、金、纳米材料、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、其衍生物及其混合物。
放射性同位素标记是指表现出放射性的核素。“核素”是指由其原 子数、原子质量和能态规定的原子类型，例如碳14(14C)。“放射性”是指包括由放射性物质发射的α颗粒、β颗粒、核子、电子、正电子、中微子和γ射线在内的辐射。适用于本发明的放射性核素包括但不限于氟18(18F)、磷32(32P)、钪47(47Sc)、钴55(55Co)、铜60(60Cu)、铜61(61Cu)、铜62(62Cu)、铜64(64Cu)、镓66(66Ga)、铜67(67Cu)、镓67(67Ga)、镓68(68Ga)、铷82(82Rb)、钇86(86Y)、钇87(87Y)、锶89(89Sr)、钇90(90Y)、铑105(105Rh)、银111(111Ag)、铟111(111In)、碘124(124I)、碘125(125I)、碘131(131I)、锡117m(117mSn)、锝99m(99mTc)、钷149(149Pm)、钐153(153Sm)、钬166(166Ho)、镥177(177Lu)、铼186(186Re)、铼188(188Re)、铊201(201Tl)、砹211(211At)和铋212(212Bi)。如本文使用的，117mSn和 99mTc中的“m”代表亚态(meta state)。此外，通常代表放射性同位素混合物的诸如铀、镭和钍的天然存在的放射性元素是放射性核素的合适实例。67Cu、131I、177Lu和186Re为β-和γ-发射的放射性核素。212Bi为α-和β-发射的放射性核素。211At为α-发射的放射性核素。32P、47Sc、 89Sr、90Y、105Rh、111Ag、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho和188Re是β-发射的放射性核素的实例。67Ga、111In、99mTc和201Tl是γ-发射的放射性核素的实例。55Co、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、68Ga、82Rb和86Y是正电子-发射的放射性核素的实例。64Cu为β-和正电子-发射的放射性核素。还能在合成引发剂、连接子、连接基团、共聚用单体的过程中通过加入诸如氘、13C或15N的天然存在的同位素将成像剂和检测剂设计成本发明的无规共聚物。
纳米颗粒
功能剂还能包含纳米颗粒。用于本发明的纳米颗粒包括尺寸为lnm至1000nm的颗粒。纳米颗粒能为珠、金属颗粒或在一些情况下能为胶束并在一些其它情况下为脂质体。其它纳米颗粒包括碳纳米管、量子点和胶态金。纳米颗粒能包装有诊断剂和/或治疗剂。
本领域技术人员还将意识到本发明能用于实现多于一种相同或不同类型试剂的同步检测。另外，灵活的连接子化学的使用还能用于证明一种荧光标记的损失，例如当将分子放入细胞中和放入低pH环境 中时。
在一些实施方案中，无规共聚物具有下列通式：
其中下标x和y1使得聚合物部分的Mn为约95,000g/mol；A1为抗体；且L-CTP具有通式：
在其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中下标x、y1a和y1b使得聚合物部分的Mn为约107，100g/mol；A1为抗体；且L-CTP如上述定义的。
在其它实施方案中，无规共聚物具有通式：
其中下标x和y1使得聚合物部分的Mn为约95,000g/mol；A1为IgG；且L-CTP如上述定义的。
在一些实施方案中，各个A1和A2独立地为抗体、抗体片段、Fab、IgG、肽、蛋白质、酶、寡核苷酸、多核苷酸、核酸或抗体药物共轭物(ADC)。
在一些实施方案中，A1独立地选自抗体、抗体片段、Fab、scFv、免疫球蛋白结构域、IgG，且A2独立地选自抗癌剂、毒素、小分子药物、化疗剂、激酶抑制剂、抗炎剂和抗纤维化剂。
在一些实施方案中，R1为LG1，且L2-A2独立地选自抗癌剂、毒素、小分子药物、化疗剂、激酶抑制剂、抗炎剂和抗纤维化剂。
IV.含两性离子的无规共聚物的制备
能通过本领域已知的任何方法制备本发明的无规共聚物。在一些实施方案中，本发明提供了用于制备本发明的无规共聚物的方法，所述方法包括在足以通过游离自由基聚合制备无规共聚物的条件下使第一单体和第二单体的混合物与引发剂I1接触的步骤，其中第一单体包含磷酰胆碱，并且各个第二单体和引发剂独立地包含功能剂或用于连接功能剂的连接基团中的至少一种。
用于制备本发明的无规共聚物的混合物能包含各种其它组分。例如，混合物还能包含催化剂、配体、溶剂和其它添加剂。在一些实施方案中，混合物还包含催化剂和配体。合适的催化剂和配体在下文更详细地进行描述。
能使用半连续方法制备用于制备本发明的无规共聚物的混合物以当单体的反应比例不同时控制聚合物的结构从而使最终的聚合物为交替共聚物、周期共聚物、梯度共聚物、嵌段共聚物或统计共聚物。
诸如上述那些的任何合适的单体能用于本发明的方法。
能通过任何合适的聚合方法制备本发明的无规共聚物，例如通过活性自由基聚合。活性自由基聚合由Odian，G.在Principles of Polymerization(聚合原理)，第4版，Wiley-Interscience John Wiley和Sons：New York，2004中讨论并例如在US 6,852,816中应用于两性离子聚合物。能使用若干不同的活性自由基聚合方法，包括稳定的游离自由基聚合(SFRP)、自由基加成-断裂转移(RAFT)和氮氧-调控聚合(NMP)。此外，原子转移自由基聚合(ATRP)提供了用于制备本发明的无规共聚物的简便方法。
通过ATRP进行的聚合物制备包括从具有一个或多个卤素的引发剂开始的单体的自由基聚合。通过诸如能通过配体(例如，联吡啶或PMDETA)增溶的过渡金属盐(CuBr)的催化剂(或当使用CuBr2时催化剂的混合物)活化卤化的引发剂。RAFT聚合使用诸如二硫代酯、二硫代氨基甲酸酯、三硫代碳酸酯和黄原酸酯的硫代羰基硫化合物来通过可逆链-转移过程调控聚合过程。用于制备本发明的无规共聚物的其它“活性”或受控的自由基过程包括NMP。
引发剂
用于制备本发明的无规共聚物的引发剂包括适用于通过原子转移自由基聚合(ATRP)而聚合的任何引发剂，例如上述那些。其它有用的引发剂包括用于氮氧-调控的自由基聚合(NMP)或可逆加成-断裂-终止(RAFT或MADIX)聚合的那些。还能使用控制游离-自由基聚合过程的其它技术，例如使用引发转移终止法(iniferters)、衰减链转移法或调聚反应法。此外，用于本发明的引发剂包括诸如上述那些的具有至少一个分枝点的那些。
具有络合物结构的本发明的无规共聚物包括具有多聚合物臂的支 链化合物，所述多聚合物臂包括但不限于梳状和星状结构。能使用具有三个或多个卤素原子的直链引发剂获得梳状结构，优选地，卤素为氯、溴或碘原子，更优选地，卤素为氯或溴原子。还能使用在单一碳原子上具有多个卤素的化合物或具有多个卤素的环状分子制备星状结构。在一些实施方案中，具有星状结构的化合物具有3个聚合物臂并在其它实施方案中它们具有4个聚合物臂。参见上述引发剂。
催化剂和配体
用于ATRP或基团自由基转移聚合的催化剂可包括Cu1+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ru2+、Ru3+、Cr2+、Cr3+、Mo2+、Mo3+、W2+、W3+、Mn2+、Mn2+、Mn4+、Rh3+、Rh4+、Re2+、Re3+、Co1+、Co2+、Co3+、V2+、V3+、Zn1+、Zn2+、Ni2+、Ni3+、Au1+、Au2+、Ag1+和Ag2+的合适的盐。合适的盐包括但不限于：卤素、C1-C6-烷氧基、硫酸盐、磷酸盐、三氟甲磺酸盐、六氟磷酸盐、甲烷磺酸盐、芳基磺酸盐。在一些实施方案中，催化剂为上述引用的金属离子的氯化物盐、溴化物盐。在其它实施方案中，催化剂为CuBr、CuCl或RuCl2。
在一些实施方案中，期望使用一种或多种配体以增溶过渡金属催化剂。合适的配体有效地用于结合多种过渡金属催化剂，所述过渡金属催化剂包括其中铜氯化物或溴化物，或钌氯化物过渡金属盐是催化剂的一部分。配体的选择影响催化剂作为配体的功能，即不仅帮助使过渡金属催化剂在有机反应介质中增溶，而且调整它们的氧化还原电势。配体的选择还基于催化剂催化剂在产物混合物中的溶解度和可分离性。尽管能使用固定化催化剂，但通常期望聚合在液相可溶性配体/催化剂中进行。合适的配体包括那些吡啶基(包括烷基吡啶，例如，4.4.二烷基-2，2’联吡啶)和具有烷基取代的亚氨基的吡啶基，在存在的情况下，较长的烷基提供在较低极性单体混合物和溶剂介质中的溶解度。除茚满基或环戊二烯基配体之外，还能将三苯基膦和其它磷配体与过渡金属催化剂一起使用(例如，具有三苯基膦、茚满基或环戊二烯基配体的Ru+2-卤化物或Fe+2-卤化物络合物)。
在一些实施方案中，当金属离子被完全络合时，基于组分的摩尔 比，在催化剂中使用接近化学计量的金属化合物和配体。在其它实施方案中中，金属化合物和配体之间的比例为1∶(0.5至2)或为1∶(0.8至1.25)。
通常，在催化剂为铜、双齿或多齿氮配体的情况下产生更活泼的催化剂。此外，桥或环配体以及支链脂肪族聚胺提供比简单的直链配体更活泼的催化剂。在溴为抗衡离子的情况下，每个Cu+1需要双齿或二分之一四配位的配体。在使用诸如三氟甲磺酸盐或六氟磷酸盐的更多络合抗衡离子的情况下，能使用两个双齿或一个四配位的配体。在一些实施方案中金属铜的添加能为有利的，特别是期望快速聚合的情况下，因为金属铜和Cu+2可能经历氧化还原反应以形成Cu+1。能使用在一些ATRP反应的开始时添加一些Cu+2以降低正常终止的量。
在一些实施方案中，聚合反应中使用的催化剂的量是存在的引发剂的摩尔当量。然而，由于在反应中催化剂不消耗，因此不必包含与引发剂一样高的量的催化剂。基于过渡金属化合物，引发剂中包含的催化剂与各个卤素的比例在一些实施方案中为约1∶(1至50)，在其它实施方案中为约1∶(1至10)，在其它实施方案中为约1∶(1至5)，并且在其它实施方案中为1∶1。
聚合条件
在一些实施方案中，优选进行本发明的“活性”或受控的自由基聚合方法以实现3至约2000的聚合度，并在其它实施方案中为约5至约500。其它实施方案中的聚合度为10至100，或者为约10至约50。基团或原子转移自由基聚合技术中的聚合度与引发剂和单体的初始比例直接相关。因此，在一些实施方案中，引发剂和单体的初始比例为1∶(3至约2,000)或约1∶(5至500)，或约1∶(10至100)，或约1∶(10至50)。
通常在使用单一均相溶液的液相中进行聚合反应。然而，反应可为包含固体和液相的非均相(例如，悬浮液或水性乳液)。反应可在其中聚合物与平面表面(晶片)或非平面表面(珠)连接的固态中进行。在其中使用不聚合的溶剂的那些实施方案中，考虑两性离子单体、引发剂、催化剂及其配体的性质来选择使用的溶剂；此外，能使用任何共聚用 单体。
溶剂可包含单一化合物或化合物的混合物。在一些实施方案中，溶剂为水，并在其它实施方案中，基于反应中存在的单体的重量，水以约10质量％至约100质量％的量存在。在其中将水可溶性共聚用单体与两性离子单体聚合的那些实施方案中，期望使用允许所有存在的单体溶解的溶剂或共溶剂(结合水)。合适的有机溶剂包括但不限于甲酰胺(例如，N，N’-二甲基甲酰胺)、醚(例如，四氢呋喃)、酯(乙酸乙酯)，且最优选地，醇。在一些实施方案中，在使用水和有机溶剂的混合物的情况下，C1-C4水溶性烷基醇(甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇和叔丁醇)是有用的有机溶剂。在其它实施方案中，水和甲醇组合适用于进行聚合反应。还可在诸如CO2的超临界溶剂中进行反应。
如上所述，在一些实施方案中，期望基于待聚合的单体的质量，以约10质量％至约100质量％的量而在聚合混合物中包含水。在其它实施方案中，基于反应混合物中存在的单体的质量，总的不可聚合的溶剂为约1质量％至约500质量％。在其它实施方案中，基于反应混合物中存在的单体的质量，总的不可聚合的溶剂为约10质量％至约500质量％或者为20质量％至400质量％。在一些情况下还期望控制诸如引发剂或单体的输入试剂的溶解度，例如通过改变温度或溶剂或其它方法从而以动态方式改变反应条件。
在一些实施方案中，在与引发剂和催化剂接触之前，通过形成包含除两性离子单体之外的所有组分的预混合物并用于将两性离子单体最后加入预混合物来最小化两性离子单体和水的接触时间。
能在任何合适的温度下进行聚合反应。在一些实施方案中，温度能为约环境温度(室温)至约120℃。在其它实施方案中，能在从环境温度升高的约60℃至80℃的温度下进行聚合。在其它实施方案中，在环境温度(室温)下进行反应。
在一些实施方案中，根据凝胶渗透色谱的判断，本发明的化合物的多分散性(分子量的)小于1.5。在其它实施方案中，多分散性能为1.2至1.4。
诸如聚合物的沉淀、分馏、再沉淀、膜分离和冷冻干燥的多种后 处理步骤能用于纯化有关的聚合物。
非卤化的聚合物末端
在一些实施方案中，期望使用其它官能团替代卤素或其它自由基清除剂I’。多种反应能用于转化脂肪族卤素。在一些实施方案中，脂肪族卤素的转化能包括制备烷基、烷氧基、环烃基、芳基、杂芳基或羟基的反应。还能使卤素进行消除反应以产生烯烃(双键)。修饰卤化末端的其它方法在Matyjaszewski等人，Prog.Polym.Sci.2001，26，337，中进行描述，以其整体通过引用并入本文。
功能剂的连接
能使用适用于被进行的反应的化学条件和试剂进行功能剂与本发明的无规共聚物的偶联。示例性方法在Bioconjugate Techniques (生物技术)，Greg T.Hermanson，Academic Press，2d Ed.，2008(以其整体并入本文)中进行描述。其它生物共轭技术在Bertozzi等人，Angewandte Chemie 2009，48，6974和Gauthier等人，Chem.Commun.2008，2591中进行描述，各自以其整体通过引用并入本文。
例如在偶联需要形成酯或酰胺的情况下，羧酸和醇或胺之间的脱水反应可使用脱水剂(例如，诸如二环己基碳二亚胺的碳二亚胺，DCC或水可溶的试剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，EDC)。或者，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)能用于制备酰胺。通常在4℃至25℃下在磷酸盐、碳酸氢盐、硼酸盐、HEPES或其它包含非胺的缓冲液中在接近中性的pH下进行使用NHS酯制备酰胺的反应。在一些实施方案中，使用EDC作为脱水剂的反应，能使用4.5-7.5的pH；在其它实施方案中，能使用4.5至5的pH。吗啉基乙烷磺酸，MES为有效的碳二亚胺反应缓冲液。
能在多种条件下使硫醇基团反应以制备不同产物。在将硫醇与马来酰亚胺反应以形成硫醚键的情况下，通常在6.5-7.5的pH下进行反应。能通过添加诸如巯基乙醇的游离硫醇试剂淬灭过量的马来酰亚胺基团。在存在二硫化物键作为连接基团的情况下，能通过存在于生物 活性基团中的巯基和为诸如吡啶基二硫化物的二硫化物的X官能团之间的硫醇-二硫化物交换制备它们。能在pH 4-pH 5下进行涉及吡啶基二硫化物的反应并且能在343nm下监测反应以检测释放的吡啶-2-硫酮。还可在水溶液中使硫醇基团与环氧化物反应以产生羟基硫醚。还可在弱碱性pH下使硫醇与诸如碘代醋酸盐的卤代醋酸盐反应以形成硫醚键。
能在pH 7.0-8.0下进行胍基基团(例如，目标蛋白质或多肽中的精氨酸的那些)与乙二醛的反应。反应通常在25℃下进行。每胍基基团包含两个苯基乙二醛部分的衍生物在弱酸性条件(低于pH 4)下比在中性或碱性pH下更稳的，并允许连接的物质分离。在中性或碱性pH值下，连接基团缓慢分解。在将蛋白质或多肽的精氨酸残基与苯基乙二醛试剂反应的情况下，约80％的连接基团在约pH 7下，在37℃在接近48小时内水解以再生原始的精氨酸残基(在没有过量反应剂的情况下)。
通常在pH为8-10，且优选为约pH 10下进行亚氨酸酯与胺的反应。由亚氨酸酯与胺的反应形成的脒连接是可逆的，特别是在高pH下。
能在宽pH范围下使卤代缩醛与巯基反应。为避免能存在的组氨酸残基之间的副反应，特别是在蛋白质或多肽上存在巯基的情况下，能在约pH 8.3下进行反应。
醛能在多种条件下与胺反应以形成亚胺。在醛或胺紧密邻近芳基的情况下，产物为倾向于比不存在芳基时更稳定的席夫碱。胺与醛反应以形成亚胺键的条件包括使用约pH 9至约pH 11的碱性pH和约0℃至室温的温度，时间为1小时至24小时。或者，在期望与蛋白质的N-末端胺优先偶联的情况下，能使用约4-7的较低pH。含硼氢化物的缓冲液和含叔胺的缓冲液常用于制备亚胺。在其为易水解的期望的亚胺共轭物的情况下，能将其还原以形成不易水解的胺键。能使用包括硼氢化钠或氰基硼氢化钠在内的多种合适的还原剂进行还原。
上述提供的反应条件旨在向技术人员提供一般指南。技术人员了解能根据需要改变反应条件以促进功能剂与本发明的无规共聚物连接 并且所述用于修饰反应的指南能从有机化学的标准教科书中获得。能从讨论了相关的化学反应的诸如Wong，S.S.，“Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(蛋白质结合和交联化学)”(CRC Press1991)的教科书中获得另外的指南。
V.组合物
本发明包括并提供了包含一种或多种本发明的化合物和一种或多种药物可接受的赋形剂的药物组合物。在本发明的药物组合物中，本发明的化合物可以其药物可接受的盐、前药、代谢物、类似物或衍生物的形式存在。如本文使用的，“药物可接受的赋形剂”或“药物可接受的载体”旨在包括任意和所有与药物给予相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
用于制备本发明的无规共聚物的药物可接受的载体包括但不限于：诸如乳糖、石膏、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等的固体载体；和诸如糖浆、盐水、磷酸盐缓冲盐水、水等的液体载体。载体可包含本领域已知的任何时间延迟物质，例如单独或具有蜡、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
还可将诸如本领域已知的其它填充剂、赋形剂、调味剂和其它添加剂包含在本发明的药物组合物中。将这类介质和试剂用于药物活性物质是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，其用于本发明的组合物是预期的。还能将补充的活性化合物包含在本发明的组合物中。
药物制备包括所有类型的剂型。在一些实施方案中，它们为适于注射或灌输的肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、腹膜内、鞘内、心室内、颅内、椎管内、囊内和骨内)剂型(例如，能重新组成或稀释的粉末剂或浓缩溶液剂以及悬浮剂和溶液剂)。在组合物为需要重新组成的固体或需要使用液体介质稀释的浓缩液的情况下，可使用任何合适的液体介质。液体介质的优选实例包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、Hank溶液、葡萄糖溶液和5％的人血清白蛋 白。
在包含本发明的无规共聚物的化合物或药物组合物适用于治疗包括但不限于癌症的细胞增殖病症的情况下，能通过多种途径将化合物或药物组合物给予个体，包括直接注射至肿瘤、血流或体腔中。
尽管药物组合物可为液体溶液、悬浮液或在给药之前能立即重新组成的粉末，但它们还可采用其它形式。在一些实施方案中，可将药物组合物制备为糖浆剂、渗透剂(drenches)、丸剂、颗粒剂、糊剂、悬浮剂、乳膏剂、软膏剂、片剂、胶囊剂(硬或软)、喷雾剂、乳剂、微型乳剂、贴剂、栓剂、粉末剂等。还可制备组合物用于除肠胃外给药之外的给药途径，包括但不限于，局部给药(包括颊给药和舌下给药)、肺部给药、直肠给药、透皮给药、跨膜给药、口服给药、眼部给药等。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的无规共聚物。
本发明的其它药物组合物可包含一种或多种充当对抗原或靶向分子具有特异性的生物配体的本发明的无规共聚物。这类组合物可包含本发明的无规共聚物，其中生物活性剂为包含抗体的氨基酸序列的多肽，或诸如FAb2或FAb’片段的抗体片段或抗体可变区。或者，化合物可为无规共聚物且多肽可包含单一链抗体的抗原结合序列。其中存在于本发明的无规共聚物中的生物活性剂充当对抗原或靶向分子具有特异性的配体，那些化合物还可用作诊断剂和/或成像剂和/或用于诊断检验。
药物组合物中化合物的量依赖多种因素而变化。在一个实施方案中，其可为适用于单一剂量容器(例如，小瓶)的治疗有效剂量。在一个实施方案中，化合物的量为适用于一次性注射器的量。在其它实施方案中，该量适用于多用途分配器(例如，当用于递送局部剂型时适用于递送滴剂剂型的容器)。技术人员能够通过重复给予增加量的药物组合物以实现临床期望终点来通过实验确定产生治疗有效剂量的化合物的量。
通常，药物可接受的赋形剂在组合物中以约0.01质量％至约99.999质量％，或约1质量％至约99质量％的量而存在。药物组合物 可包含约5质量％至约10质量％，或约10质量％至约20质量％，或约20质量％至约30质量％，或约30质量％至约40质量％，或约40质量％至约50质量％，或约50质量％至约60质量％，或约60质量％至约70质量％，或约70质量％至约80质量％，或约80质量％至约90％重的赋形剂。其它合适的赋形剂范围包括约5质量％至约98质量％、约15质量％至约95质量％，或约20质量％至约80质量％。
药物可接受的赋形剂在各种公知来源中进行描述，包括但不限于“Remington：The Science & Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学和实践)”，第19版，Williams和Williams，(1995)和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)，第3版，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000。
VI.方法
本发明的无规共聚物用于治疗任何疾病态或疾病状态。通过结合合适的靶向剂、药物和治疗性蛋白质以及诸如磷酰胆碱的两性离子，本发明的无规共聚物能用于处理由任何一种疾病态或疾病状态提供的一整套机制。例如，疾病态或疾病状态能为急性或慢性的。
能使用本发明的无规共聚物治疗的疾病态和疾病状态包括但不限于癌症、自身免疫病症、遗传病症、传染病、炎症、纤维化病症和代谢病症。
能使用本发明的无规共聚物治疗的癌症包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、肝癌、胸膜癌、胰腺癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、肛门癌、胆管癌、胃肠道类癌、食道癌、胆囊癌、直肠癌、阑尾癌、小肠癌、胃(stomach)(胃(gastric))癌、肾癌、中枢神经系统癌症、皮肤癌、绒膜癌、头颈癌、骨肉瘤、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、白血病和淋巴瘤。
能使用本发明的无规共聚物治疗的自身免疫疾病包括但不限于多发性硬化、重症肌无力、克罗恩病、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬化、1型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病或IDDM)、格雷夫氏病、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性血小板减少、诸如韦格氏 肉芽肿的血管炎、贝赫切特氏综合症、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(狼疮)、硬皮病、系统性硬化症、格林-巴利综合症、纤维化、肝纤维化、移植后纤维化、特发性肺纤维化、桥本氏甲状腺炎、诸如强直性脊柱炎的脊柱关节病、牛皮癣、疱疹样皮炎、炎性肠病、寻常型天疱疮和白癜风。
能通过本发明的无规共聚物治疗的一些代谢病症包括溶酶体贮积症，例如粘多糖贮积症IV或莫尔基奥氏综合症、激活剂缺乏症/GM2神经节苷脂贮积症、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、胆固醇脂贮积病、慢性氨基己糖苷酶A缺乏症、胱氨酸贮积症、Danon病、法布雷病、法伯病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、高雪氏症、GM1神经节苷脂沉积症、低磷酸酯酶症、细胞内含物病/粘脂贮积症II、婴儿游离唾液酸贮积症/ISSD(Infantile Free Sialic Acid Storage Disease)、青少年氨基己糖苷酶A缺乏症、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、诸如假胡尔勒氏多种营养不良/粘脂贮积症IIIA、胡尔勒氏综合症、沙伊综合症、胡尔勒氏-沙伊综合症、亨特氏综合症、沙费利波综合症、透明质酸酶缺乏症、马-拉综合症、拉米氏综合症、粘脂病I/涎酸贮积症、粘脂贮积症和粘脂贮积症的粘多糖贮积症，多种硫酸酯酶缺乏症、尼曼-匹克氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、庞贝氏症/II型糖原贮积症、致密性成骨不全症、山德霍夫氏病、辛德勒氏病(Schindler disease)、萨拉氏病/唾液酸贮积症、戴萨克斯症/GM2神经节苷脂贮积症和伍尔曼氏病。
本发明的共轭物和包含本发明的共轭物的组合物(例如，药物组合物)能用于治疗多种疾病状态。例如，有许多其中使用本文公开的功能剂治疗的疾病状态的治疗疗法是本领域的执业医师已知的。本发明包括本发明的共轭物(例如，与多种功能剂共轭的包含磷酰胆碱的聚合物)和包含本发明的共轭物的组合物能用于治疗这样的疾病状态并且相对于未与包含磷酰胆碱的聚合物偶联的相同功能剂这类共轭物提供了增强的治疗疗法。
因此，本发明包括已知可通过某些生物活性剂治疗的疾病状态，所述生物活性剂通过使用与包含磷酰胆碱的聚合物共轭的相同的某些 生物活性剂治疗疾病状态。
本发明的其它方面涉及治疗响应于生物试剂的疾病状态的方法，其包括给予有需要的个体治疗有效量的如上所述的本发明的化合物或本发明的药物可接受的组合物。调整剂量和给药以提供足够水平的生物活性剂从而保持期望的效果。对于任何给定个体，合适的剂量和/或给药方案可依据多种因素而变化，包括疾病态的严重程度、个体的健康状况、个体的年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受性/反应。能通过临床医生技术和判断范围内的常规实验确定给定情况下的治疗有效量。
可单独给予本文描述的药物组合物。或者，可相继地，或以包含两种本发明的无规共聚物或一种本发明的无规共聚物及其它生物活性剂的混合物或组合形式给予两种或多种药物组合物。可在标准参考教科书中获悉本文阐述的生物活性剂的其它用途，例如Merck Manual of Diagnosis and Therapy(诊断和治疗的默克手册)，Merck&Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ以及Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础)，Pergamon Press，Inc.，Elmsford，N.Y.，(1990)。
本发明的无规共聚物用于治疗、检测和成像多种疾病态或疾病状态。无规共聚物能用作其中引发剂片段I并非功能化的癌症治疗中的化疗剂并且R2包含通过点击化学或任何合适的共轭化学负载在无规共聚物上的癌症化疗剂A2：
使用无规共聚物的另外的癌症治疗剂能包括抗血管生成蛋白的靶向剂，例如通过C-末端半胱氨酸与马来酰亚胺引发剂I共轭的抗VEGFscFv片段A1。无规共聚物还能包括通过可断裂或自分解连接子与聚合物骨架连接的癌症化疗剂A2a。此外，通过点击化学或任何合适的共轭化学将癌症化疗剂负载在无规共聚物上。例如，在尤文氏肉瘤中：靶向剂能为抗癌抗体片段，例如与诸如VEGF的血管生成长因子结合的 Fab’或scFv片段。此外，骨靶向共聚用单体A2b能包括天冬氨酸盐或谷氨酸盐富集肽或二膦酸酯。其它共聚用单体A2c能包括通过可断裂或自分解连接子连接的长春新碱、阿霉素和/或环磷酰胺：
用于湿性或干性黄斑变性的更有效和更长停留时间治疗的无规共聚物能包括抗炎或抗血管生成蛋白质，例如通过C-末端半胱氨酸与马来酰亚胺引发剂I共轭的抗VEGF或抗IL-6scFv片段A1。制备的无规共聚物能为磷酰胆碱的均聚物或与聚合物骨架稳定连接的磷酰胆碱的共聚物，结合通过可断裂连接子L2与聚合物骨架连接的抗炎小分子或抗血管生成小分子A2。或者，无规共聚物能包括诸如胆碱或带正电荷的氨基酸的具有通过不可断裂连接子L2连接的玻璃体细胞外基质(透明质酸)结合部分A2的其它共聚用单体：
用于实时诊断估计肿瘤负荷和肿瘤学成像的无规共聚物能包括抗肿瘤相关的蛋白质，例如通过C-末端半胱氨酸与马来酰亚胺引发剂I共轭的抗癌胚抗原(CEA)scFv片段A1。无规共聚物能包括稳定连接的磷酰胆碱和诸如荧光染料(荧光探针检测)或钆(用于全身成像检测)的成像剂A2a。能添加具有通过可断裂连接子L2b连接的小分子化疗剂A2b的另外的共聚用单体以添加治疗元素。这些结构提供了治疗和诊断功能二者，并常被称为治疗诊断学：
用作骨酶替代治疗，具体为低磷酸酯酶症的靶向平台的无规共聚物能包括通过稳定的连接基团L1与醛-修饰的引发剂I共轭的重组碱性 磷酸酶A1。无规共聚物能包括与聚合物稳定连接的磷酰胆碱和用于通过诸如天冬氨酸盐或谷氨酸盐富集肽序列或二膦酸酯的稳定连接的骨靶向部分A2靶向的共聚用单体使得存在多于五种靶向部分(y1大于5)。当然，A1能为诸如生长因子的任何蛋白质，例如人生长激素，并且靶向肽能为适用于将共轭物定位于任何组织的任何肽。这些共聚物用于皮下递送：
其它无规共聚物用作用于骨酶替代治疗的靶向平台，特别是莫尔基奥氏综合症(MPS类型IVa)。这些类型的无规共聚物包括通过可断裂连接子L1与定位化学引发剂I共轭的重组N-乙酰基半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶A1。无规共聚物能包括与聚合物稳定连接的磷酰胆碱，和包含诸如通过不可断裂连接子L2连接的天冬氨酸盐或谷氨酸盐富集肽序列或二膦酸酯的骨靶向部分A2的靶向共聚用单体，使得存在多于五种靶向部分。这些共聚物用于皮下递送：
用于安全、更有效地治疗类风湿关节炎的靶向平台的无规共聚物能包括若干不同药物，包括诸如通过不可断裂连接子L1与引发剂I连接的抗体片段A1的抗TNFα生物药物，或抗VEGFR2，小分子A2a作为激酶抑制剂，以及甲氨蝶呤A2b，抗肿瘤抗代谢药，二者分别通过可断裂连接子L2a和L2b连接并具有免疫抑制剂性质：
能通过使用小蛋白质双域抑制剂代替A1的抗FNFα生物药物制备与上述那些类似的无规共聚物，所述小蛋白质双域抑制剂例如抑制两种蛋白质的目标物或scFv二聚体，例如TNFα以及VEGF，但没有小分子抑制剂。此外，甲氨蝶呤A2能被环磷酰胺替代：
最终，能制备靶向和受保护的RNAi的无规共聚物而没有功能化引发剂I。无规共聚物能包括与聚合物稳定连接的磷酰胆碱，和具有通过可断裂键L2a与聚合物连接的siRNA A2a的共聚用单体，以及具有通过不可断裂连接子L2b连接的细胞-或组织-靶向基团A2b的其它共聚用单体。能使用具有适用于点击化学或任何合适的共轭化学的连接基团的单体制备包含siRNA的共聚用单体，其中在聚合后将siRNA与连接基团连接。具有靶向部分的共聚用单体能已经包含靶向部分，或通过具有适用于点击化学或任何合适的共轭化学的连接基团的共聚用单体与靶向部分连接，所述共轭化学为与用于连接siRNA不同的化学。可断裂连接子优选为pH敏感连接子。能使用每药物A2c接近五种寡核苷酸部分和每药物五种靶向部分的靶向化学计量制备无规共聚物(使得y1a∶y1b∶y1c的比例为约5∶5∶1)。此外，能最佳化磷酰胆碱聚合物骨架并非半衰期，但用于从其注射位置到靶向组织的行程中保护siRNA。
siRNA能被microRNA替代：
此外，能任选将引发剂I与诸如靶向和治疗用的抗体片段的生物活性部分A1连接：
在一些其它实施方案中，新型多功能治疗系统的设计能将磷酰胆碱聚合物与具有成像和/或感知能力的药物或基因靶向剂结合。系统能 具有至少3种组分：(1)能靶向递送至特定位置的靶向部分或分子标记，(2)用于可视化或监测系统的合适的成像剂/探针/标签以及(3)一种或多种治疗剂以有效治疗特殊疾病或病症。
下列为包含靶向、成像和药物/基因部分的多功能系统的实例。该列表不旨在排除包含磷酰胆碱的聚合物系统。能通过诸如pH、酶断裂的内部过程或用于治疗递送和成像的诸如接近IR光、超声、加热或磁场的外部刺激激活的靶向系统也是适当的。首先，能在概念上将我们的方法与下列中的所有结合：
●包封治疗性基因、用于MRI分析的钆造影剂并使用抗体功能化以靶向特定疾病位点的基于合成的生物可降解聚合物的纳米颗粒。
●包封小或大药物分子，使用18氟标记以用于PET分析并使用抗体功能化以靶向特定疾病位点的脂质体。
●包含siRNA分子、用于MRI分析的氧化铁造影剂并使用细胞结合配体和细胞-渗透肽修饰以分别用于靶向细胞和细胞内递送的Polyplexes。
●插有用于光学成像和感知递送的药物分子并使用RNA适体功能化以靶向特殊疾病的荧光量子点。
●包含用于基因疗法的反义寡核苷酸、用于MRI分析的钆造影剂、用于光学成像的荧光团和修饰的表面以靶向特殊疾病的无机或有机纳米颗粒。
●具有被释放作为pH函数的药物分子、用于MRI成像的氧化铁造影剂、用于光学成像的CdTe量子点并使用抗体功能化以靶向特殊疾病的pH敏感聚合纳米复合物。
●包含药物和用于SPECT成像的诸如111In的放射性示踪剂并使用疾病-特异性膜抗体功能化的纳米颗粒-DNA适体共轭物。
其次，能特异性地将本发明的聚合物与上述结合：
●包含治疗性基因(生物活性1)、用于MRI分析的钆造影剂(功能1)和小蛋白质(例如抗体片段)以靶向特殊疾病位点的基于磷酰胆碱聚合物的结构。
●具有用于PET分析的18氟并使用小蛋白质(例如抗体片段)功能 化以靶向特殊疾病位点的成像剂。
●包含一种或多种siRNA分子、用于MRI分析的氧化铁造影剂和使用细胞结合配体和细胞-渗透肽修饰以分别用于靶向细胞和细胞内递送的磷酰胆碱聚合物。
●插有用于光学成像和感知递送的药物分子(功能剂)并使用RNA适体或小蛋白质(例如抗体片段或支架衍生的蛋白质)功能化以靶向特殊疾病的荧光量子点(功能剂)的磷酰胆碱聚合物
●含包含用于基因治疗的反义寡核苷酸、用于MRI分析的钆造影剂、用于光学成像的荧光团和用于靶向特殊疾病的诸如用于靶向细胞外基质的静电相互作用的肿瘤或胆碱的叶酸的另外的功能剂的聚合物的磷酰胆碱。
●具有被释放作为pH的函数的药物分子、用于MRI成像的氧化铁造影剂、用于光学成像的CdTe量子点并使用抗体或其它蛋白质或适体功能化以靶向和治疗特殊疾病的pH敏感的磷酰胆碱聚合物。
●具有包含药物和用于SPECT成像的诸如111In的放射性示踪剂并使用疾病-特异性膜抗体进一步功能化的适配子功能剂共轭物的磷酰胆碱聚合物。
VII.实施例
实施例1.N-(2-羟基乙基)-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚胺的制备
将50ml的乙醇和2.0克的外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酸酐装入100-ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。使用冰水浴冷却搅拌的混合物，并在10分钟内滴加0.73克的乙醇胺的20ml的乙醇溶液。将反应在回流下加热4小时，然后冷冻过夜。过滤并使用乙醇冲洗产生0.73克白色结晶固体形式的目标产物。将滤液浓缩并再次冷冻以获得第二晶体产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.90(s，2H，CH)，3.71(m，2H，OCH2)，3.77(t，J＝5.0Hz，NCH2)，5.29(t，J＝1.0Hz，2H，OCH)，6.53(t， J＝1.0Hz，2H，CH＝CH).
实施例2.异亚丙基-2，2-双(羟基甲基)丙酸的制备
将50ml的丙酮、13.8ml的2，2-二甲氧基丙烷、10克的2，2-双(羟基甲基)丙酸和0.71克对甲苯磺酸单水合物装入100ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。将混合物环境温度下搅拌两小时，然后使用1ml的2M氨水的甲醇溶液中和。蒸发溶剂并将混合物溶于二氯甲烷，然后使用20ml的水萃取两次。在硫酸镁上干燥有机相并蒸发以产生10.8克白色结晶固体形式的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.20(s，3H，CH3CC＝O)，1.43(s，3H，CH3)，1.46(s，3H，CH3)，3.70(d，J＝12.4Hz，2H，OCH2)，4.17(d，J＝12.4Hz，2H，OCH2)。
实施例3.N，N-二甲基吡啶鎓对甲苯磺酸盐(DPTS)的制备
通过使用Dean-Stark分水器(Dean-Stark trap)进行共沸蒸馏来干燥1.9克的对甲苯磺酸单水合物的10ml苯溶液，然后加入3.42克的4-二甲基氨基吡啶。大量固体形成，并且需要另外25ml的苯以促进反应，当其冷却至室温时缓慢搅拌。通过过滤分离产生的固体，使用10ml的苯洗涤，并干燥以产生7.88克白色固体形式的产物。
实施例4.保护的马来酰亚胺溴丙酸酯引发剂的制备
将50ml的四氢呋喃、2克的N-(2-羟基乙基)-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚胺和2.0ml的三乙胺装入100-ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。将搅拌的混合物冷却至0度，并在30分钟内滴加1.18ml的2-溴异丁酰溴的5ml四氢呋喃溶液。使反应在冰上搅拌3小时，随后室温过夜。反应混合物的浓缩产生油状残留物，通过使用30％-50％乙 酸乙酯的己烷的硅胶快速层析将其纯化，产生1.96克白色粉末形式的目标产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.89(s，6H，CH3)，2.87(s，2H，CH)，3.82(t，J＝5.4Hz，2H，NCH2)，4.33(t，J＝5.4Hz，2H，OCH2)，5.27(t，J＝1.0Hz，2H，OCH)，6.51(t，J＝1.0Hz，2H，CH乙烯基)。
实施例5.保护的马来酰亚胺双(溴丙酸酯)引发剂的制备
保护的马来酰亚胺异亚丙酸
使用2.37克的N，N’-二环己基碳二亚胺的10ml干燥二氯甲烷溶液逐滴处理2.00克的N-(2-羟基乙基)-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚胺和1.67克的异亚丙基-2，2-双(羟基甲基)丙酸的30ml干燥二氯甲烷溶液以及563mg的DPTS。当将反应混合物在环境温度下搅拌过夜时大量固体开始形成。将反应过滤，并使用少量二氯甲烷洗涤沉淀。将合并的有机层浓缩以产生包含少量固体的透明油状物。首先使该油状物进行使用20％-100％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将包含目标产物的部分合并，并且浓缩以产生3.17克白色固体形式的最终产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.19(s，3H，CH3CC＝OO)，1.37(s，3H，CH3)，1.41(s，3H，CH3)，1.55(s，6H，(CH3)2C)，2.86(s，2H，C＝OCHCHC＝O)，3.58(d，J＝12Hz，CH2O)，3.78(t，J＝5.4Hz，CH2CH2O)，4.14(d，J＝12H，CH2O)，4.30(t，J＝5.4Hz，CH2CH2O)，5.27(t，2H，CHOCH)，6.51(s，2H，CH＝CH)。
保护的马来酰亚胺二醇
使用1.0克的Dowex 50Wx8-100离子交换树脂(H+形式)处理来自上述的异亚丙基化合物的50ml甲醇溶液并将反应在室温下搅拌过夜，此时通过tlc(硅胶，乙酸乙酯)反应显示完成。将混合物过滤，并使用少量甲醇洗涤固体树脂。将合并的有机物浓缩并在真空下放置以产生 1.55克的略混浊的油状物，将其用于下一反应而不需进一步纯化。
保护的马来酰亚胺双(溴丙酸酯)引发剂
在冰水浴中将来自上述的粗产物的40ml无水四氢呋喃(THF)溶液以及1.45ml的三乙胺冷却，并在几分钟内滴加1.23ml的2-溴异丁酰溴的20ml无水THF溶液。将反应在冷却条件下搅拌30分钟，然后使其升温至室温，时间为6小时。加入另外600μl的三乙胺，随后是另外0.5ml的2-溴异丁酰溴。通过pH试纸检测反应为酸性的，因此加入另外200μl的三乙胺以使溶液的pH达到9。将反应搅拌过夜，浓缩，并将残留物在50ml的二氯甲烷和50ml的水之间分层。在硫酸钠上干燥有机层，过滤并浓缩以产生油状物。首先使用20％，然后30％且最终40％的乙酸乙酯的己烷使其进行硅胶上的快速柱层析。将包含产物的部分合并，并且浓缩以产生1.63g的油状物，其凝固为白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.32(s，3H，CH3CC＝O)，1.91[s，12H，(CH3)2CBr]，2.90(s，2H，CHC＝O)，3.78(t，2H，NCH2CH2O)，4.28(t，2H，NCH2CH2O)，4.31(app q，4H，CH2OC＝O)，5.30(s，2H，CHOCH)，6.52(s，2H，CH＝CH)。
实施例6.N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚 胺的制备
将100ml的甲醇和20克的外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酸酐装入250ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。将搅拌的混合物冷却至0度，并在45分钟内滴加0.73克2-(2-氨基乙氧基)乙醇的40ml甲醇溶液。将反应在室温下搅拌2小时，然后在温和回流下加热过夜。将溶液浓缩并将产物溶于100ml的二氯甲烷，然后使用100ml的盐水洗涤。 在硫酸钠上干燥有机层，浓缩并通过使用100ml的二氯甲烷和100ml的乙酸乙酯的硅胶塞纯化。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.90(s，2H，CH)，3.49(m，2H，OCH2)，3.59(m，4H，OCH2)，3.65(m，2H，NCH2)，5.15(t，J＝0.8Hz，2H，OCH)，6.55(t，J＝0.8Hz，2H，CH＝CH)。
实施例7.双2，2-[(2-溴异丁酰)羟基甲基]丙酸的制备
在30分钟内向在冰水浴中冷却的17.5ml的2-溴异丁酰溴的100ml的二氯甲烷溶液滴加10.0克的2，2-双(羟基甲基)丙酸和41ml的三乙胺的100ml二氯甲烷溶液。使反应在冷却条件下搅拌1小时，然后使其升温至室温。然后，使用200ml的1N HCl，然后使用100ml的0.5N HCl且最终使用50ml的饱和NaCl洗涤反应混合物。在无水硫酸钠上干燥有机层，过滤并浓缩以产生黄色油状物。若需要，使用加热枪在100ml的15％乙酸乙酯的己烷中处理该油状物以影响溶液。然后，使溶液在1小时内冷却，当溶液接近室温时添加晶种。使结晶进行2小时，首先在冰水浴中冷却，然后在冰箱中过夜。产生的溶液接近凝固，因此加入25ml的10％乙酸乙酯的己烷，将混合物搅拌，并通过过滤回收结晶固体。使用最少量的己烷将其洗涤并真空干燥以产生14.55克白色固体形式的目标产物。若需要，从母液中能获得另外的产物。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ＝1.33(s，3H，CCH3)，1.90(s，12H，(CH3)2CBr)，4.30(d，J＝5.4Hz，2H，NCH2)，4.39(d，J＝5.4Hz，2H，OCH2)。
实施例8.保护的马来酰亚胺延长的双(溴丙酸酯)引发剂的制备
将100ml的二氯甲烷、1.0克的N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚胺、2.5克来自实施例7的二溴酸、0.5克的二甲基氨基吡啶和0.35克的DPTS装入250ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。将氮气短暂地鼓入溶液，并缓慢加入1.6克的DCC。使反应在室温下搅拌过夜。过滤并蒸发产生粉红色油状残留物，通过硅胶快速层析将其纯化。1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ＝1.34(s，3H，CH3)，1.90(s，6H，CH3)，2.94(s，2H，CH)，3.64(m，6H，OCH2)，4.22(t，J＝5.4Hz，2H，NCH2)，4.35(app q，4H，OCH2)，5.15(t，J＝1.0Hz，2H，OCH)，6.54(t，J＝1.0Hz，2H，CH＝CH)。
实施例9.N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚 胺，异亚丙基-2，2-双(羟基甲基)丙酸酯的制备
使用12.9克的DCC处理11.0克的N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚胺和8.22克的异亚丙基-2，2-双(羟基甲基)丙酸的250ml二氯甲烷溶液以及1.3克的DPTS和5.24克的DMAP，并将反应搅拌过夜。将反应过滤并浓缩以产生残留物，使用40％-50％的乙酸乙酯的己烷在硅胶上使其以两部分进行快速柱层析以产生透明油状物形式的目标产物。
实施例10.N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰 亚胺，2，2-双(羟基甲基)丙酸酯的制备
将来自上述的产物溶于100ml的甲醇并使用2.0克的Dowex50Wx8-100离子交换树脂(H+形式)处理，并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤并浓缩以产生油状物形式的目标产物，使用该产物而不需进一步纯化。NMR(CD3OD)：δ6.546(t，2H，CH＝CH，J＝0.8Hz)，5.158(t，2H，CH-O，J＝0.8Hz)，4.180(m，2H，CH2-CH2-O-C＝O，J＝4.9 Hz)，3.63(m，10H，N-CH2和N-CH2-CH2和CH2-CH2-O-C＝O和CH2-OH)，2.936(s，2H，CH-CH)，1.147(s，3H，CH3)。
实施例11.N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰 亚胺，2，2-双-[2，2-双(2-溴异丁酰氧基甲基)丙酰氧基甲基]丙酸酯引发剂的制备
使用1.40克的二异丙基碳二亚胺处理1.5克的来自前面步骤的二醇和3.72克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸的50ml的二氯甲烷溶液以及500mg的DPTS和810mg的DMAP，并将反应在室温下搅拌过夜。将反应浓缩并在硅胶上使用40％乙酸乙酯的己烷将残留物层析数次。将各个情况下的合适的部分合并，并且浓缩以产生油状物形式的目标产物。NMR(CD3OD)：δ6.55(t，2H，CH＝CH，J＝0.8Hz)，5.17(t，2H，CH-O，J＝0.8Hz)，3.34(m，12H，CCH2)，4.23(m，2H，CH2-CH2-O-C＝O，J＝4.7Hz)，3.68(m，2H，N-CH2，J＝4.7Hz)，3.64(app q，4H，N-CH2-CH2和CH2-CH2-O-C＝O)，2.95(s，2H，CH-CH)，1.907(s，24H，Br-C-CH3)，1.34(s，6H，CH3)，1.308(s，3H，CH3)。
实施例12.N-(3-丙酸)-外-3，6-环氧-3，6-二甲基-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚 胺，具有2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸的酯，3-羟基丙酯引发剂的制备
使用375mg的DCC处理738mg的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，3-羟基丙酯和399mg的N-(3-丙酸)-外-3，6-环氧-3，6-二甲基-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酰亚胺的20ml干燥乙腈溶液以及50mg的DPTS和100mg的DMAP，并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤以产生残留物，在硅胶上使用30％-40％的乙酸乙酯的己烷使其进行快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生1.02克透明油状物形式的目标产物。通过1H NMR，显示约10％的产物已经经历逆Diels-Alder反应。NMR(CDCl3)：δ6.19(s，2H，CH＝CH)，4.37(app q，4H，CCH2O，J＝10.9，29.7Hz)，4.23(t，2H，CH2CH2O，J＝6.3Hz)，4.15(t，2H，CH2CH2O，J＝6.3Hz)，3.62(t，2H，NCH2，J＝7.4Hz)，3.22(s，2H，CHC＝O)，2.48(t，2H，CH2C＝O，J＝7.4Hz)，2.00(m，2H，CH2CH2CH2，J＝6.3Hz)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.78(s，6H，CH3)，1.35(s，3H，CH3)。
实施例13.双(溴丙酸酯)乙缩醛引发剂的制备
使用1.58克的N，N’-二环己基碳二亚胺处理1.03克的3，3-二乙氧基-1-丙醇和3.0克的2，2-双(2-溴异丁酰氧基甲基)丙酸的50ml二氯甲烷溶液以及817mg的N，N-二甲基吡啶鎓对甲苯磺酸盐，并将反应在环境温度下搅拌过夜。将反应过滤，并使用少量二氯甲烷洗涤沉淀。将合并的有机物浓缩，并在硅胶上使用10％-20％的乙酸乙酯的己烷使残留物进行快速柱层析。将包含目标产物的部分合并，并且浓缩以产生2.87克的透明、无色油状物。通过1H NMR可知该物质仍不纯，因此在硅胶上使用二氯甲烷使其再次进行快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生2.00克粘稠、透明油状物形式的目标产物。1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.20(t，6H，CH3CH2O)，1.34(s，3H，CH3CC＝O)，1.92[s，12H，(CH3)2CBr]，1.98(app q，2H，CHCH2CH2)，3.50(m，2H，OCH2CH3)，3.66(m，2H，OCH2CH3)，4.24(t，2H，CH2CH2OC＝O)，4.37(app q，4H，CH2OC＝OCBr)，4.60(t，1H，O-CH-O)。
实施例14.乙烯基双(溴丙酸酯)引发剂1的制备
将30ml的二氯甲烷、86毫克的4-戊烯-1-醇、432毫克来自实施例7的二溴酸和88毫克的DPTS装入100ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。将氮气短暂鼓入溶液，并缓慢加入169μl的N，N’-二异丙基碳二亚胺。使反应在室温下搅拌过夜，然后加入另外0.1克的DPTS并将反应再次搅拌过夜。过滤并蒸发产生油状残留物，在硅胶上通过使用20％-40％的乙酸乙酯的己烷的快速层析将其纯化。将溶剂从第一产物中去除以脱离柱，产生0.13克无色油状物形式的目标产物。1HNMR(400MHz，CD3OD)：δ＝1.34(s，3H，CH3)，1.77(m，2H，CH2CH2CH2)，1.90(s，12H，CH3)，2.15(q，J＝7.2Hz，2H，CHCH2CH2)，4.16(t，J＝6.4Hz，2H，OCH2)，4.36(app q，4H，CCH2O)，5.02(m，2H，CH2＝CH)，5.82(m，1H，CH2＝CH)。
实施例15.乙烯基双(溴丙酸酯)引发剂2的制备
将25ml的二氯甲烷、370毫克的乙二醇单乙烯基醚、432毫克来自实施例7的二溴酸和590克的DPTS装入100ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。使用氮气冲洗烧瓶，并缓慢加入681μl的N，N’-二异丙基碳二亚胺。使反应在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，然后在硅胶上干燥以进行使用5％-10％的乙酸乙酯的己烷的快速层析，产生无色油状物形式的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.36(s，3H，CH3)，1.92(s，12H，CH3)，3.90(app q，J＝5.4Hz，2H，NCH2CH2O)，4.05(dd，1H，J＝2.4，6.8Hz，＝CH)，4.19(dd，J＝2.4，14.4Hz，1H，＝CH)，4.39(m，2H， NCH2CH2O)，4.40(app q，4H，OCH2)，6.45(dd，1H，J＝6.8，14.4Hz，＝CHO)。
实施例16.Boc-氨基双(马来酰亚胺)引发剂的制备
使用3.0克的N，N’-二环己基碳二亚胺处理2.19克的N-Boc-3-氨基-1-丙醇和5.20克的2，2-双(2-溴异丁酰氧基甲基)丙酸的50ml的二氯甲烷溶液以及350mg的DPTS，并将反应在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物过滤，并使用少量二氯甲烷洗涤沉淀。浓缩产生残留物，在硅胶上使用5％-20％的乙酸乙酯的己烷使其进行快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生包含少量固体残留物的油状物。在乙酸乙酯中处理该物质并过滤。再次浓缩产生仍包含少量固体的油状物，因此在乙酸乙酯中再次处理所述物质，过滤并浓缩以产生透明油状物形式的目标产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝4.8(br s，1H，NH)，4.37(app q，4H，CH2OC＝OCBr)，4.22(t，2H，CH2CH2OC＝O)，3.20(app q，2H，NHCH2)，1.92[s，12H，(CH3)2CBr]，1.85(t，2H，CH2CH2CH2)，1.43(s，9H，(CH3)3O)，1.35(s、CH3CC＝O)。
实施例17.N-(3-丙酸叔丁酯)-2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酰胺的制备
使用25ml的饱和碳酸氢钠水溶液处理1.00克的b-丙氨酸叔丁酯盐酸盐的50ml二氯甲烷溶液，并将混合物搅拌15分钟。将层分离，并在硫酸钠上干燥有机物。向该溶液加入2.38克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基]甲基)丙酸，随后加入1.92ml的二异丙基乙胺和2.1克的 HBTU，并将反应在室温下搅拌过夜。然后，使用另外50ml的二氯甲烷稀释反应混合物，使用2×50ml的水洗涤，并在硫酸钠上干燥。过滤并浓缩产生油状物，使用20％-25％的乙酸乙酯的己烷使其进行快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生730mg的白色固体。NMR(CDCl3)：δ6.70(t，1H，NH，J＝5.4Hz)，4.33(app q，4H，CH2O，J＝16.3，11.4Hz)，3.51(q，2H，NCH2，J＝6.0Hz)，2.46(t，2H，CH2CO，J＝6.0Hz)，1.93(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.45(s，9H，C(CH3)3)，1.33(s，3H，CH3)。
实施例18.保护的马来酰亚胺4-醇的制备
将30ml的二氯甲烷、1.6克来自实施例7的二醇、1.71克的异亚丙基-2，2-双(羟基甲基)丙酸和0.5克的DPTS装入100ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。将氮气短暂地鼓入溶液，缓慢加入1.70ml的N，N’-二异丙基碳二亚胺，并使反应在室温下搅拌过夜。过滤并蒸发产生油状残留物，使用10％-40％的乙酸乙酯的己烷通过在硅胶上的快速层析将其纯化。使用2％的甲醇的二氯甲烷通过在硅胶上的快速层析进行第二次纯化产生约2克的无色油状物。将该油状物溶于25ml的甲醇并使用Dowex 50WX8-100树脂(H+形式)在室温下搅拌60小时。将反应过滤，浓缩，然后使用150ml的15％的甲醇的二氯甲烷通过硅胶塞。蒸发产生1.3克接近无色的硬泡沫。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.13(s，6H，CH3)，1.25(s，3H，CH3)，2.96(s，2H，CHC＝ON)，3.57-3.65(m，8H，CH2OH)，3.64(t，J＝2.8Hz，2H，CH2CH2OC＝O)，4.22(app q，4H，C(CH3)CH2OC＝O1)，4.22(t，J＝2.8Hz，CH2CH2OC＝O)，5.21(t，J＝0.8Hz，CHOCH)，6.55(t，J＝0.8Hz，CH＝CH)。
实施例19.保护的马来酰亚胺四(溴丙酸酯)引发剂的制备
将20ml的二氯甲烷、0.55克来自实施例13的四醇和1.69ml的三乙胺装入100ml装备有搅拌棒的圆底烧瓶。将搅拌的混合物冷却至0度，并滴加0.99ml的2-溴异丁酰溴的10ml二氯甲烷溶液。使反应在室温下搅拌过夜，然后使用50ml的半饱和的碳酸氢钠洗涤。浓缩反应混合物产生油状褐色残留物，使用40％的乙酸乙酯的己烷通过在硅胶上的快速层析将其纯化。将褐色残留物溶于甲醇并使用炭处理以去除颜色，产生0.68克浅褐色油状物形式的目标产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.26(s，3H，CH3CC＝O)，1.34(s，6H，CH3CC＝O)，1.90(s，24H，(CH3)2CBr)，2.95(s，2H，CH)，3.78(t，J＝5Hz，2H，NCH2)，4.25(m，6H，OCH2C(4H)和OCH2CH2N(2H))，4.35(app q，8H，OCH2)，5.23(t，J＝1Hz，2H，CHOCH)，6.55(t，J＝1Hz，2H，CH＝CH)。
实施例20.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，2-羟乙酯引发剂的制备
使用1.39克的二异丙基碳二亚胺处理4.32克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基]甲基)丙酸和12.41克的乙二醇的50ml二氯甲烷溶液，以及883mg的DPTS，并将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，然后在150m l的乙酸乙酯和70ml的水之间分层。将有机层浓缩，并使残 留物进行使用20％-40％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生2.7克透明油状物形式的目标产物。NMR(CD3OD)：δ4.38(app q，4H，CCH2，J＝11.2，30.2Hz)，4.20(t，2H，CH2OH，J＝5.0Hz)，3.75(t，2H，CH2CH2OH，J＝5.0Hz)，1.90(s，12H，Br-CCH3)，1.36(s，3H，CH3)。
实施例21.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，3-羟基丙基酯引发剂的制备
使用1.0克的DPTS处理5.31克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸和4.68克的1，3-丙烷二醇的80ml二氯甲烷和20ml乙腈溶液，随后用3.0克的DCC处理，并将反应在室温下搅拌2小时。然后将反应过滤，浓缩并使残留物进行使用30％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生透明油状物，其不太纯。使用10％-15％丙酮的己烷在硅胶上再次层析产生透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ4.38(app q，4H，CCH2O，J＝11.2Hz)，4.31(t，2H，CH2CH2O，J＝6.3Hz)，3.71(q，2H，CH2OH，J＝5.9Hz)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.9(m，2H，CH2CH2CH2)，1.35(s，3H，CH3)。
实施例22.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，11-羟基-3，6，9-三氧杂十一酸 酯引发剂
使用1.15克的DCC处理1.86克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸和4.18克的四乙二醇的50ml的二氯甲烷溶液，以及250mg的 DPTS并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤并使用50ml的二氯甲烷稀释滤液，使用20ml的水洗涤。在硫酸钠上干燥有机物，过滤并浓缩以产生残留物，使其首先进行使用50％-70％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，过滤并浓缩以产生1.19克透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ4.38(app q，4H，CCH2O，J＝31.8，11.2Hz)，4.31(t，2H，CH2CH2OC＝O，J＝5.0Hz)，3.6-3.73(m，14H，CH2O)，2.46(t，1H，OH，J＝6.3Hz)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.35(s，3H，CH3)。
实施例23.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，11-羟基-3，6，9-三氧杂十一酸 酯，NHS碳酸酯引发剂的制备
使用610mg的DMAP处理630克上述羟基化合物和1.28克的二琥珀酰亚胺基碳酸酯的3ml的干燥乙腈溶液，并将反应在室温下搅拌。反应仍为非均相的，因此加入4ml的干燥THF，并在2小时后反应变为黄色，并变为均相的，但在tlc上(硅胶，50％的乙酸乙酯的己烷)包含若干点。将反应浓缩以产生残留物，使其进行使用50％-60％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将两部分分离，并将具有较低rf的部分浓缩以产生260mg透明油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ4.47(m，2H，CH2O(C＝O)O)，4.37(app q，4H，CCH2O，J＝11.2，31.6Hz)，4.30(m，2H，CH2CH2O(C＝O)C)，3.79(m，2H，CH2CH2O(C＝O)C)，3.71(t，2H，CH2CH2O(C＝O)O，J＝5.0Hz)，3.67(s，4H，CH2O)，3.65(s，4H，CH2O)，2.84(s，4H，CH2C＝O)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.35(s，3H，CH3)。
实施例24.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，丙酮缩甘油酯引发剂的制备
使用2.15克的DCC处理918mg的丙酮缩甘油和3.0克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸溶液，以及200mg的DPTS并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤以产生残留物，使其进行使用10％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生1.85克透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ4.38(app q，4H，CCH2O)，4.32(m，1H，OCH)，4.19(m，2H，CHCH2OC＝O)，4.07(d of d，1H，OCH2CH，J＝6.7，8.6Hz)，3.76(d of d，1H，OCH2CH，J＝5.7，8.6Hz)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.43(s，3H，(CH3)2CO)，1.36(s，3H，CH3)，1.35(s，3H，(CH3)2CO)。
实施例25.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，2，3-二羟基丙基酯引发剂的制 备
使用750mg的Dowex 50Wx8-100处理1.0克的前述缩酮的50ml的甲醇溶液并将反应搅拌过夜。然后，将反应过滤、浓缩，并使残留物进行使用20％-40％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生630mg透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3+D2O)：δ4.40(app q d，4H，CCH2O，J＝2.8，11.5，30.2Hz)，4.24(app q d，2H，CHCH2OC＝O，J＝4.5，6.6，11.5Hz)，3.96(m，1H，CH)，3.66(app q of d，2H，HOCH2CH，J＝3.8，5.6，11.5，37.9Hz)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.37(s，3H，CH3)。
实施例26.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，2-(2，3-二羟基丙氧基)乙酯引 发剂的制备
向1.5克的2-[(2-溴异丁酰氧基)甲基]-2-羟基甲基丙酸、2-(烯丙基氧基)乙酯的15ml的水和15ml的叔丁醇溶液加入2.86克(3eq)的铁氰化钾、1.20克(3eq)的碳酸钾、7.5mg的脱水锇酸钾、11mg的奎宁环和276mg(1eq)的甲烷磺酰胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC(硅胶，50％的乙酸乙酯的己烷)反应显示完成，因此将反应倾入100ml的水，然后使用100ml的二氯甲烷萃取。在硫酸钠上干燥合并的有机物，过滤并浓缩以产生油状残留物，使其进行使用30％-40％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，使用脱色碳处理，过滤并浓缩以产生850mg接近无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ4.39(app q d，4H、CCH2O，J＝4.1，11.1，3.0，37.6Hz)，4.31(t，2H，OCH2CH2OC＝O，J＝4.7Hz)，3.87(m，1H，CH-OH)，3.54-3.77(m，2H，CH2-OH)，3.72(m，2H，OCH2CH)，3.58(app t，2H，OCH2CH2OC＝O)，2.68(d，1H，CH-OH，J＝5.1Hz)，2.15(app t，1H，CH2-OH，J＝6.1Hz)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.36(s，3H，CH3)。
实施例27.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，12-(烯丙基氧基)-3，6，9，12-四 氧杂十二酸酯引发剂
向1.60g的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸和870mg的12-(烯丙基氧基)-3，6，9，12-四氧杂十二烷的30ml的干燥乙腈溶液，以及218mg的DPTS和362mg的DMAP加入917mg的DCC并将反应在室温下搅拌过夜。然后，将混合物过滤并浓缩，并首先使残留物进行使用 50％-60％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析，并将包含产物的部分合并，并且浓缩以产生1.35克透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ5.87-5.97(m，1H，CH2CH＝CH2)，5.28(dq，1H， H-CH＝CH)，5.18(dq，1H，H-CH＝CH)，4.37(app q、CH2OC＝O)，4.30(dd，2H，CH2CH2OC＝O)，4.02(d，2H，CH2＝CHCH2)，3.60-3.72(m，14H，CH2CH2OCH2)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.35(s，3H，CH3)。
实施例28.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，12-(2，3-二羟基丙氧基)-3，6， 9，12-四氧杂十二烷基酯引发剂的制备
向1.29克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸、12-(烯丙基氧基)-3，6，9，12-四氧杂十二烷基酯的15ml水和15ml叔丁醇的混合物加入1.98克(3eq)的铁氰化钾、829mg(3eq)的碳酸钾、8mg的脱水锇酸钾、11mg的奎宁环和190mg(1eq)的甲烷磺酰胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC(硅胶，50％的乙酸乙酯的己烷)反应显示完成，因此将反应倾入50ml的水，然后使用100ml的二氯甲烷萃取。在硫酸钠上干燥合并的有机物，过滤并浓缩以产生油状残留物，使其进行使用5％的甲醇的二氯甲烷的硅胶上的快速柱层析。将包含产物的部分合并并使用两小铲活性碳处理两次，在处理之间过滤。过滤并浓缩产生包含少量固体的浅灰色油状物，因此将其在乙酸乙酯中处理并过滤，然后浓缩以产生1.06克浅灰色油状物形式的目标产物，仍包含少量固体。NMR(CDCl3)：δ4.38(app q，4H，CCH2OC＝O)，4.30(t，2H，CH2CH2OC＝O，J＝5.0Hz)，3.85(p，1H，CHOH，J＝5Hz)，3.71(t，2H，OCH2CHOH，J＝4.8Hz)，3.72-3.55(m，16H，OCH2CH2O和CH2OH)，3.12(s，1H，CHOH)，2.37(s，1H，CH2OH)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.35(s，3H，CH3)。
实施例29.2，2，5-三甲基-1，3-二噁烷-5-羧酸，2-(烯丙基氧基)乙酯的制备
使用500mg的4-二甲基氨基吡啶对甲苯磺酸(DPTS)和1.44克的二甲基氨基吡啶(DMAP)处理1.4克的乙二醇单烯丙基醚和2.35克的2，2，5-三甲基-1，3-二噁烷-5-羧酸的25ml的无水THF溶液，随后添加3.38克的二环己基碳二亚胺，并将反应在室温下搅拌3天。将反应混合物过滤并浓缩以产生半固体残留物，使其进行使用20％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将包含产物的部分合并，浓缩并过滤以产生2.83克包含少量固体的透明油状物(81％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.23(s，3H，C＝OCCH3)，1.39(s，3H，CH3)，1.43(s，3H，CH3)，3.66(m，4H)，4.02(dd，2H，CH2＝CHCH2)，4.20(d，2H)，4.31(t，2H，C＝OOCH2)，5.18(dd，1H，＝CH)，5.28(dd，1H，＝CH)，5.89(m，＝CHCH2)。
实施例30.2，2-双(羟基甲基)丙酸，2-(烯丙基氧基)乙酯
使用1.0克的Dowex 50W-X8树脂(H+形式)处理2.72克的2，2，5-三甲基-1，3-二噁烷-5-羧酸、2-(烯丙基氧基)乙酯的50ml甲醇溶液并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤，并将滤液浓缩以产生油状物，时期进行使用5％的甲醇的二氯甲烷的硅胶上的快速柱层析。将包含产物的部分合并，并且浓缩以产生2.23克透明、浅黄色油状物形式的产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝5.84-5.94(ddt，1H，H2C＝CHCH2)，5.28(dq，1H，HHC＝CHCH2)，5.22(dq，1H，HHC＝CHCH2)，4.36(app t，2H，OCH2CH2)，4.02(dt，2H，H2C＝CHCH2)，3.86(dd，2H，CH2OH)，3.74(dd，2H，CH2OH)，3.68(app t，2H，OCH2CH2)，2.90(br d，2H，OH)，1.11(s、CH- 3)。
实施例31.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸，2-(烯丙基氧基)乙酯引发剂的 制备
当以少量二氯甲烷溶液的形式加入2.86克的DCC时，在室温下搅拌1.2克的烯丙基氧基乙醇、5.0克的2，2-双(2-溴异丁酰氧基甲基)丙酸和690mg的DPTS的100ml二氯甲烷溶液。将反应在室温下搅拌过夜，然后过滤并浓缩以产生油状物。使其进行使用10％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生透明油状物，其不够纯。使该油状物再次进行使用3％-4％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速层析。将包含产物的部分合并，并且浓缩以产生2.78克透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ5.89(m，1H，CH2CH＝CH2)，5.28(d ofq，1H，H-CH＝CH，J＝17.2，1.7Hz)，5.20(d of q，1H，H-CH＝CH，J＝10.5，1.5Hz)，4.38(app q，4H，CH2OC＝O)，4.31(t，2H，OCH2，J＝4.7Hz)，4.01(d of t，2H，OCH2，J＝5.6，1.5Hz)，3.65(t，2H，OCH2，J＝4.7Hz)，1.91(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.35(s，3H，CH3)。
实施例32.2，2-双-[2，2-双(2-溴异丁酰氧基甲基)丙酰基氧基甲基]丙酸，2-(烯 丙基氧基)乙酯引发剂
使用1.03克的DCC处理2.42克的2-[(2-溴异丁酰氧基)甲基]-2-羟基甲基丙酸、2-(烯丙基氧基)乙酯和1.73克的2，2-[双-(2-溴异丁酰氧 基)甲基]丙酸的25ml干燥乙腈溶液，以及200mg的DPTS和580mg的DMAP，并将反应在室温下搅拌过夜。通过TLC(硅胶，30％的乙酸乙酯的己烷)显示反应未完成，因此加入另外812mg的2，2-[双-(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸和400mg的DCC，将反应再次在室温下搅拌过夜。将反应混合物过滤并浓缩，并首先使用20％，然后使用30％的乙酸乙酯的己烷使残留物进行硅胶上的快速柱层析。将包含产物的部分合并，并且浓缩以产生1.27克透明、无色油状物形式的目标化合物。NMR(CDCl3)：δ5.88(m，1H，CH2CH＝CH2)，5.28(d of q，1H，H-CH＝CH，J＝17.4，1.6Hz)，5.20(d of q，1H，H-CH＝CH，J＝10.3，1.3Hz)，4.24-4.44(m，14H，CH2OC＝O)，4.01(d，2H，CH2＝CHCH2，J＝5.6)，3.65(t，2H，CH2CH2OCH2，J＝4.7Hz)，1.91(s，24H，Br-C(CH3)2)，1.33(s，6H，CH3)，1.30(s，3H，CH3)。
实施例33.2，2-双-[2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)丙酰氧基甲基]丙酸]，2-[(2，3-二 羟基)丙氧基]乙酯引发剂的制备
向1.21克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸、2-(烯丙基氧基)乙酯的15ml水和15ml叔丁醇的混合物加入1.14克(3eq)的铁氰化钾、480mg(3eq)的碳酸钾、7.5mg的脱水锇酸钾、11mg的奎宁环和110mg(1eq)的甲烷磺酰胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过tlc(硅胶，50％的乙酸乙酯的己烷)显示反应完成，因此将反应倾入50ml的水，然后使用100ml的二氯甲烷萃取，随后是另外50ml的二氯甲烷。在硫酸钠上干燥合并的有机物，过滤并浓缩以产生油状残留物，使其进行使用50％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析，并将包 含产物的部分合并，并且浓缩以产生620mg透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ4.28-4.41(m，14H，CCH2OC＝O)，3.86(m，1H，CH2CHOHCH2)，3.69-3.75(m，3H)，3.56-3.65(m，3H)，2.78(dd，1H，OH)，2.23(app t，1H，OH)，1.92(s，24H，CH3CBr)，1.34(s，6H，CH3)，1.31(s，3H，CH3)。
实施例34.2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸.(2-叠氮基乙氧基)乙酯引发剂 的制备
向3.30克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基)甲基]丙酸和1.0克的2-(2-叠氮基乙氧基)乙醇的20mL的干燥乙腈溶液，以及225mg的DPTS加入1.89克的DCC并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤并浓缩以产生残留物，使其进行使用10％-15％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生2.06克透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ4.39(appq，4H，CCH2O，J＝11.1，33.8Hz)，4.31(t，2H，OCH2CH2OC＝O，J＝5Hz)，3.72(t，2H，CH2N3，J＝5Hz)，3.67(t，2H，CH2CH2N3，J＝5Hz)，3.38(t，2H，OCH2CH2OC＝O，J＝5Hz)，1.92(s，12H，Br-C(CH3)2)，1.36(s，3H，CH3)。
实施例35.3，5-双-(2-溴异丁酰氧基)苯甲醛的制备
使用冰水浴冷却1.0克的3，5-二羟基苯甲醛和4.0ml(4eq)的三乙胺的20ml的二氯甲烷溶液，并当大量固体形成时在数分钟内滴加3.35 克的2-溴异丁酰溴的5ml二氯甲烷溶液。将反应在室温下搅拌1.5小时，此时通过TLC(硅胶，30％的乙酸乙酯的己烷)显示反应完成。使用25ml的水洗涤反应，然后浓缩以产生残留物，使其进行使用10％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，使用少量脱色碳处理，过滤并浓缩以产生2.2克的油状物，其在冰箱中结晶以产生白色固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.08(s，12H，CH3)，7.29(t，1H，J＝2.4Hz，ArH)，7.61(d，J＝2.4Hz，2H，ArH)，10.0(s，1H，CHO)。
实施例36.7-(13-烯丙基氧基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基)-2，4，9-三苯基-1，3， 5-三氮杂三环[3.3.1.13，7]癸烷的制备
使用410mg的氢化钠(60％的油)处理870mg的11-烯丙基氧基-3，6，9-三氧杂十一烷-1-醇甲烷磺酸和1.01克的2，4，9-三苯基-1，3，5-三氮杂三环[3.3.1.13，7]癸烷-7-甲醇(WO2000/037658)的10ml的干燥THF溶液并将反应在80℃下加热20小时。然后，通过添加几毫升水将反应小心淬灭，倾入20ml的饱和NaCl，然后使用3×10ml的二氯甲烷萃取。在硫酸钠上干燥有机物，过滤并浓缩以产生残留物，使其进行使用25％-35％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生920mg无色油状物形式的目标产物。NMR(DMSO-d6)：δ7.70-7.82(m，6H，PhH)，7.26-7.51(m，9H，PhH)，3.69-3.75(m，3H)，3.56-3.65(m，3H)，2.78(dd，1H，OH)，2.23(app t，1H，OH)，1.92(s，24H，CH3CBr)，1.34(s，6H，CH3)，1.31(s，3H，CH3)。
实施例37.1-氨基-15-烯丙基氧基-2，2-双(氨基甲基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷 三盐酸盐的制备
在20ml的乙醇和4ml的乙醚中处理来自前述反应的三氮杂金刚烷化合物，然后使用2ml的浓盐酸处理。将反应混合，然后在4℃下保持1.5小时。然后加入30ml的乙醚并将混合物再次冷却另外30分钟。然后，加入100ml的乙醚并通过过滤回收固体产物，使用乙醚洗涤并真空下干燥以产生564mg白色固体形式的产物。NMR(DMSO-d6)：δ7.75(m，6H，CCH)，7.44(m，6H，CCHCH)，7.30(m，3H，CCHCHCH)，5.86(m，1H，CH2＝CH)，5.70(s，1H，NCH(赤道))，5.250(s，2H，NCH(轴))，5.23(d of q，1H，CH2＝CH)，5.11(d q，1H，CH2＝CH)，3.93(d t，2H，CH-CH2-O)，3.55-3.25(m，16H，OCH2CH2O)，3.26(m，2H，NCH2)，3.19(d，2H，NCH2)，2.88(s，2H，NCH2)，2.719(s，2H，CCH2O)。
实施例38.N-(2-溴-2-甲基丙酰基)-1-氨基-15-烯丙基氧基-2，2-双[N-(2-溴-2- 甲基丙酰基)氨基甲基]-4，7，10，13-四氧杂十五烷引发剂的制备
在25ml的二氯甲烷中处理来自前述步骤的三胺盐酸盐，使用冰水浴冷却溶液，并使用1.35ml的三乙胺处理，随后添加0.46ml的2-溴异丁酰溴。然后将反应搅拌，同时使其在2小时内升至室温。然后，使用3×10ml的1N HCl、2×10mL的饱和NaHCO3、10ml的饱和NaCl洗涤反应混合物，并在硫酸镁上干燥。将溶液过滤并浓缩以产生残留物，使用乙酸乙酯将其冲洗通过硅胶塞。浓缩产生989mg粘稠油状物形式的目标产物。NMR(DMSO-d6)：δ8.004(t，3H，NH)，5.87(m，1H，CH)，5.23(d q，1H，CH2＝CH)，5.12(d q，1H，CH2＝CH)，3.93(d t，2H，CH2-CH)，3.6-3.45(m，16H，OCH2CH2O)，3.289(s，2H，CCH2O)，3.12(d，6H，CCH2N)，1.907(s，18H，CH3)。
实施例39.N-(2-溴-2-甲基丙酰基)-1-氨基-15-(2，3-二羟基丙基)-2，2-双[N- (2-溴-2-甲基丙酰基)氨基甲基]-4，7，10，13-四氧杂十五烷引发剂的制备
向350mg来自前述步骤的烯烃的5ml叔丁醇和5ml水的混合物加入433mg(3eq)的铁氰化钾、182mg(3eq)的碳酸钾、42mg(1eq)的甲烷磺酰胺、7.5mg的奎宁环和4mg的锇酸钾二水合物，并将溶液在室温下搅拌过夜。通过TLC(硅胶，5％的甲醇的二氯甲烷)反应显示完成，因此加入50ml的水并使用50ml的二氯甲烷萃取溶液，随后是另外2×25ml的二氯甲烷。在硫酸钠上干燥合并的萃取物，浓缩，并使黑灰色残留物进行使用2％-5％的甲醇的二氯甲烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生310mg浅灰色油状物形式的目标二羟基化合物。NMR(CDCl3)：δ7.91(t，3H，NH)，3.88(m，1H，HOCH2CHOHCH2)，3.55-3.72(复杂m，21H)，3.35(s，1H，OCH2C(CH2)3)，3.19(d，6H，J＝6.4Hz，CH2NH)，1.99(s，18H，CH3)。
实施例40.7-(7-叠氮基-2，5-二氧杂庚基)-2，4，9-三苯基-1，3，5-三氮杂三环 [3.3.1.13，7]癸烷的制备
向1.1克的2，4，9-三苯基-1，3，5-三氮杂三环[3.3.1.13，7]癸烷-7-甲醇(WO2000/037658)和585mg的2-(2-叠氮基乙氧基)乙基甲烷磺酸酯的15ml无水THF溶液加入224mg的NaH(60％的油)，并将溶液在70℃下加热过夜。加入另外245mg的NaH和600mg的2-(2-叠氮基乙氧基)乙基甲烷磺酸酯，并再次加热持续过夜。将反应混合物冷却，使用25ml的水稀释，并使用50ml的二氯甲烷萃取。使用饱和NaCl洗涤 有机层，在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩以产生残留物。使该物质进行使用10％-25％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生1.15克油状物形式的目标产物，其不完全纯，但用于下一反应而不需进一步纯化。NMR(DMSO)非常复杂。
实施例41.1-氨基-9-叠氮基-2，2-双(氨基甲基)-4，7-二氧杂壬烷三盐酸盐的制 备
使用冰水浴冷却1.15克来自前述步骤的三氮杂金刚烷化合物的20ml乙醇和4ml乙醚溶液，加入3ml的浓HCl。固体产物立即形成，并使反应在冷却条件下保持10分钟。加入另外30ml的乙醚，并将反应冷冻过夜。使用另外100ml的乙醚稀释反应混合物，并通过过滤分离固体产物，使用更多乙醚洗涤并真空下干燥以产生800mg白色固体形式的产物。
实施例42.N-(2-溴-2-甲基丙酰基)-1-氨基-9-叠氮基-2，2-双[N-(2-溴-2-甲基 丙酰基)氨基甲基]-4，7-二氧杂壬烷引发剂的制备
使用冰水浴冷却800mg来自前述步骤的三盐酸盐的25ml的二氯甲烷溶液，然后使用3.5ml的三乙胺处理。向该混合物滴加1.07ml的2-溴异丁酰溴，并搅拌反应同时在2小时内升至室温。然后，使用3×10ml的1N HCl、2×10ml的饱和NaHCO3并使用10ml的饱和NaCl洗涤混合物，然后在硫酸镁上干燥。过滤并浓缩产生残留物，使其进行使用20％-30％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生630mg油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ7.76(t，3H，NH，J＝6.3Hz)，3.68(m，4H，OCH2CH2O)， 3.63(m，2H，N3CH2CH2O)，3.40(t，2H，N3CH2，J＝5.0Hz)，3.37(s，2H，CCH2O)，3.19(d，6H，CCH2N，J＝6.8Hz)，1.99(s，18H，CH3)。
实施例43.13-烯丙基氧基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基6-臂引发剂
向0.9克的1-氨基-15-烯丙基氧基-2，2-双(氨基甲基)-4，7，10，13-四氧杂十五烷三盐酸盐和3.89克的2，2-双[(2-溴异丁酰氧基]甲基)丙酸的25ml二氯甲烷溶液以及530mg的DPTS和890mg的DMAP加入2.7克的DCC并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤并浓缩，并使残留物进行使用50％-70％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生1.9克粘稠油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ7.78(t，3H，NH，J＝6.5Hz)，5.91(m，1H，CH)，5.27(d of q，1H，CH2＝CH，J＝17.4，1.6Hz)，5.18(d ofq，1H，CH2＝CH，J＝10.4，1.4Hz)，4.38(app q，12H，CH2OC＝O)，4.01(d of t，2H，CH-CH2，J＝5.7，1.4Hz)，3.61(二m，16H，OCH2CH2O)，3.30(s，2H，CCH2O)，3.14(d，6H，CH2N，J＝6.1Hz)，1.92(d，36H，BrC(CH3)2，J＝1.2Hz)，1.38(s，9H，CH3)。
实施例44.13-(2，3-二羟基丙基)-2，5，8，11-四氧杂十三烷基6-臂引发剂
向1.0克来自前述步骤的烯烃的10ml水和10ml叔丁醇的混合物加入638mg(3eq)的铁氰化钾、268mg(3eq)的碳酸钾、10mg的脱水锇酸钾、12mg的奎宁环和61mg(1eq)的甲烷磺酰胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应倾入50ml的水中，然后使用50ml的二氯甲烷萃取，随后是另外25ml的二氯甲烷。在硫酸钠上干燥合并的有机物，过滤并浓缩以产生油状残留物，使其进行使用2％-4％的甲醇的二氯甲烷的硅胶上的快速柱层析，并将包含产物的部分合并，并且浓缩以产生417mg粘稠油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ7.78(t，3H，NH，J＝6.0Hz)，4.39(app q，12H，CH2OC＝O)，3.86(宽s，1H，OH-CH)，3.62(m，20H，OCH2CH2O和OHCHCH2O和OH-CH2)，3.27(s，2H，CCH2O)，3.13(s，6H，NCH2)，2.40(s，2H，OH)，1.92(s，36H，BrC(CH3)2)，1.38(s，9H，CH3)。
实施例45.具有9-叠氮基-4，7-二氧杂壬酸的六谷氨酸酰胺的制备9-羟基-4，7-二 氧杂壬酸酯甲烷磺酸叔丁酯的制备
使用冰水浴冷却3.0克的9-羟基-4，7-二氧杂壬酸叔丁酯(Bioconjugate Chem，2004，15，1349)的50ml二氯甲烷溶液，使用2.5ml的三乙胺处理，随后添加1.60克的甲烷磺酰氯。将反应在冷却 条件下搅拌10分钟，然后使其搅拌同时在1小时内升至室温。使用50ml的二氯甲烷稀释反应，使用50ml的水洗涤并在硫酸钠上干燥。过滤并浓缩产生油状物，使其进行使用50％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生3.99克透明、无色油状物形式的产物。NMR(CDCl3)：δ4.38(m，2H)，3.76(m，2H)，3.70(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2)，3.61-3.66(m，4H)，3.08(s，3H，OSO2CH3)，2.49(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2CH2)，1.45(s，9H，CH3)。
9-叠氮基-4，7-二氧杂壬酸叔丁酯的制备
将2.0克来自前述步骤的甲磺酸酯的25ml DMF溶液以及1.25克(3eq)的叠氮化钠在85℃下加热过夜。将反应混合物倾入100ml的水，然后使用4×50ml的乙醚萃取。在硫酸钠上干燥合并的有机层，过滤并浓缩以产生透明油状物。使用200ml的50％的乙酸乙酯的己烷将该油状物冲洗通过硅胶塞，并将滤液浓缩以产生1.63克透明、无色油状物形式的产物。NMR(CDCl3)：δ3.73(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2)，3.63-3.69(m，6H)，3.39(app t，2H，CH2N3)，2.51(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2CH2)，1.45(s，9H，CH3)。
9-叠氮基-4，7-二氧杂壬酸的制备
将1.63克来自前述步骤的叠氮基酯的5ml的88％甲酸溶液在室温下搅拌过夜。使用50ml的水稀释反应混合物，然后使用4×25ml的乙醚萃取。在硫酸钠上干燥合并的有机物，过滤并浓缩以产生1.14克透明油状物形式的产物。NMR(CDCl3)：δ3.79(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2)，3.68(app t，2H)，3.67(s，4H)，3.39(app t，2H，CH2N3)，2.66(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2CH2)。
9-叠氮基-4，7-二氧杂壬酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备
使用1.4克的DCC处理1.14克来自前述步骤的酸和650mg的N-羟基琥珀酰亚胺的15ml的干燥乙腈溶液，以及150mg的DMAP，并将反应在室温下搅拌3小时。将反应过滤并浓缩以产生残留物，使其进行使用10％-30％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的部分合并，并且浓缩以产生960mg包含少量固体的透明油状物形式的产物。NMR(CDCl3)：δ3.87(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2)，3.68(app t，2H)，3.67(s，4H)，3.39(app t，2H，CH2N3)，2.91(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2CH2)，2.84(br s，4H，CH2CH2)。
具有9-叠氮基-4，7-二氧杂壬酸的六谷氨酸酰胺的制备
制备17mg的六谷氨酸的1ml的25mM HEPES缓冲液pH 7的混合物，添加350μL的DMF以提高溶解度。然后加入7mg上述NHS酯的DMF溶液，并检测pH，其为约5。加入总计240μL的0.5M的NaOH以使pH恢复至约7.5，并加入另外13mg的NHS酯。随后使用具有装备有Waters 2685双波长检测器的2695Alliance溶剂递送系统的Waters HPLC系统使反应进行反相HPLC。在1.2ml/分钟下使用作为0.08％TFA的水的泵A缓冲液和作为0.1％TFA的乙腈的泵B缓冲液使用得自Phenomenex的Jupitor C18HPLC柱(8×260mm)将样品层析25分钟。样品注射之后，将柱洗涤1分钟。使用等梯度100％A，然后在10分钟内增加至20％B。使用线性梯度随后在6分钟内线性增加至50％B。在使用等梯度100％A再生2分钟之前，使用95％B将柱洗脱2分钟。在OD 220nm下监测色谱。天然肽和叠氮化物修饰的肽分别在5.6分钟和9.6分钟下以尖峰形式洗脱。在过夜反应后，肽峰消失且产物峰处于其最大值。使用具有装备有Waters 2685双波长检测器的2695 Alliance溶剂递送系统的Waters HPLC系统，通过阴离子交 换色谱确认产物纯度。使用泵A缓冲液作为20mM Tris pH 7.5和泵B缓冲液作为包含0.5M NaCl的缓冲液A，在1ml/分钟下，使用得自Shodex的弱阴离子交换DEAE-825HPLC柱(8×75mm)将样品层析16分钟。在样品注射之后，将柱首先洗涤5分钟。使用等梯度30％B，然后在10分钟内增加至100％B。使用线性梯度，然后保持在100％B下2分钟。然后，在下次注射之前，使用等梯度30％B将柱再生3分钟。在OD 220nm下监测色谱。天然肽在10.1分钟下以单一尖峰形式洗脱，同时修饰的肽在10.6分钟下以单一尖峰形式洗脱。在旋转蒸发仪上使用真空泵将反应浓缩以去除所有溶剂，并使用100μL的2.5M HCl研磨残留物，产生白色固体。将该混合物涡流并在5000rpm下离心5分钟，并倾析上清液。使用2×100μL的2.5M HCl以类似方式将固体再次洗涤，然后真空下干燥以产生白色固体形式的目标产物。
实施例46.喜树碱PC-共聚物的制备
2-(2-叠氮基乙氧基)乙醇的合成
使用10.4克(2eq)的叠氮化钠处理10.0克的2-(2-氯乙氧基)乙醇的50ml的去离子水溶液，并将反应混合物在80℃下加热48小时。将溶液冷却至室温，使用氯化钠饱和并使用3×50ml的乙醚萃取。在无水硫酸钠上干燥合并的有机物，过滤并浓缩以产生7.25克(69％)透明、无色油状物形式的目标产物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝2.05(t，J＝6.4Hz，1H，OH)，3.42(t，J＝5Hz，2H)，3.63(dd，J＝4.4，5.6Hz)，3.71(dd，J＝4.4，4.8Hz，2H)，3.77(dt，J＝4.4，6Hz，2H)。
5-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]-4-氧代戊酸的合成
使用280mg的4-(二甲基氨基)吡啶和64ml(2eq)的三乙胺处理3.0克的2-(2-叠氮基乙氧基)乙醇的50ml二氯甲烷溶液，并使用冰浴冷却溶液。然后在几分钟内滴加2.61克(1.0 eq)的戊二酸酐的5ml二氯甲烷溶液。将反应搅拌，然后在温和的回流下加热过夜。将反应冷 却至室温，使用2×25ml的1N HCl和25ml的H2O洗涤，然后在硫酸钠上干燥。过滤并浓缩产生4.66克(83％)透明、无色油状物形式的目标产物。1SHNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝1.97(五重峰，J＝7.2Hz，2H)，2.45(t，J＝7.2Hz，4H)，3.39(t，J＝4.8Hz，2H)，3.66-3.72(m，4H)，4.26(app t，J＝4.6Hz，2H)。
喜树碱叠氮化物共轭物的合成
在冰水浴中冷却70mg的5-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]-4-氧代戊酸的10ml二氯甲烷溶液，并使用55mg的EDC处理，随后是35mg的DMAP和50mg的喜树碱。然后使反应升至室温并搅拌过夜，同时溶液缓慢变为均相的。然后，将反应混合物浓缩并应用于硅胶柱，首先使用1％-2％的甲醇的二氯甲烷将其洗脱。然后，将合适的部分浓缩以产生黄色固体形式的目标共轭物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝0.98(t，J＝7.6H)，1.98(五重峰，J＝7.2Hz，2H)，2.13-2.32(复杂m，2H)，2.45(t，J＝7.6Hz，2H)，2.51-2.65(复杂m，2H)，3.35(t，J＝5Hz，2H)，3.63-3.68(m，4H)，4.21-4.25(m，2H)，5.30(br s，2H)，5.41(d，J＝17.2Hz，1H)，5.68(d，J＝17.2Hz，1H)，7.21(s，1H)，7.68(t，J＝6.8Hz，1H)，7.84(app t，J＝8.4Hz，1H)，7.95(d，J＝8Hz，1H)，8.23(d，J＝8Hz，1H)，8.40(s，1H)。
甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和三甲基甲硅烷基(TMS)-保护的甲基丙烯酸炔丙 基酯共聚物的合成
首先将α-溴异丁酸乙酯(18.84mg，0.096mmol)、联吡啶(30.1mg，0.192mmol)和450mg的DMSO装载进入Schlenk管。将混合物小心脱气并使管充满氮气。然后在惰性条件下将CuBr加入管(13.8mg， 0.096mmol)。将反应混合物密封并在-78℃下冷却。将三甲基甲硅烷基-保护的甲基丙烯酸炔丙基酯(TMS-PgMA)(66mg，0.336mmol)和甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(0.9，3.04mmol)的混合物溶于4mL的脱气的纯乙醇(200proof ethanol)。在惰性条件下将溶液滴加至冷却的反应容器。在0℃下将混合物在真空下彻底脱气15分钟并充满惰性气体。使聚合进行15小时。
15小时后，发现反应混合物非常均匀而没有明显的交联。通过暴露于空气将反应淬灭并且混合物从黑褐色变为绿色。在使用聚环氧乙烷标准校准的Shodex柱(OH806)上进行纯化之前，粗样品的GPC分析表明窄分布的单一峰形式的聚合物的形成(峰Mp处的分子量为13200g/mol)。光散射分析显示Mn为22900g/mol，Mp为25000g/mol且PDi为1.14。使粗反应通过硅胶，浓缩并小心沉淀进入乙醚。通过过滤分离固体并使用乙醚洗涤数次。在50℃下的烘箱内将共聚物干燥过夜，产生0.9g的共聚物。1H NMR光谱分析显示没有TMS基团。作为预防步骤，通过100mg的四丁基氟化铵三水合物进一步处理0.5g的共聚物并通过沉淀纯化。
喜树碱叠氮化物共轭物在炔烃-功能化其聚物上的接枝
将CuBr(13mg)装载于脱气的Schlenk管内，随后添加15mg的N，N，N’，N”，N”-五甲基二亚乙基三胺。将240mg的共聚物溶于2g的脱气的纯乙醇并将50mg的喜树碱叠氮化物共轭物(CPT-L-N3)溶于1.5g 的DMF。在惰性条件下将CPT-L-N3的溶液滴加至Schlenk管同时搅拌，随后添加炔烃-功能化共聚物的溶液。通过三次循环真空-氮气将混合物脱气并使其在室温下反应3小时。
3小时后，从粗混合物中取出等分并在370nm下通过GPC分析，其显示游离喜树碱峰和相应于喜树碱共聚物共轭物的高分子量峰的消失。
将反应混合物暴露于空气，浓缩至其一半体积，通过硅胶以去除铜催化剂，然后小心沉淀进入乙醚中。使用过量乙醚洗涤聚合物。通过过滤分离固体并使用乙醚洗涤数次。将聚合物在50℃下的烘箱中干燥过夜并以浅褐色粉末形式分离。在喜树碱接枝共聚物(CD3OD)上进行1HNMR光谱分析显示7ppm-9ppm区域弱和宽的芳香族信号，来自合并的喜树碱的质子特征。
实施例47.来自喜树碱接枝共聚物的喜树碱释放研究
在Tris缓冲液中，pH＝8.0，在接近10mg/ml下制备喜树碱接枝共聚物样品。将来自兔子肝的肝酯酶(Sigma-Aldrich E0887-IKU，Lot#061K74451)加入至样品并将样品在37℃下孵化多达65小时。
使用由Waters Alliance 2995与Waters 2410折光率检测器、Waters2996光电二极管阵列检测器和Shodex蛋白质KW-803柱组成的HPLC系统进行样品的GPC分析。用于洗脱的流动相为包含10％无水乙醇的磷酸盐缓冲盐水。将流速设置为1ml/min并在370nm下监测喜树碱的存在。在各个时间点注射10mL样品。
时间(h) 释放的喜树碱(mg/ml) 0 0.059 1 0.079 2 0.132 3 0.130 4 0.128 17 0.208 26 0.251 41 0.335 65 0.427
实施例48.包含喜树碱的马来酰亚胺-功能化PC-共聚物的制备聚合
除了使用实施例5中描述的保护的马来酰亚胺功能化引发剂代替 α-溴异丁酸乙酯之外，下列聚合方案与实施例46中的描述基本相同。所使用试剂的量在下表中进行描述：
在-78℃下将聚合反应混合物彻底脱气并使反应在室温下进行17小时。经暴露于空气将聚合淬灭。将溶于1ml甲醇的100mg四丁基氟化铵溶液加入至反应混合物。将粗反应通过硅胶，浓缩并小心沉淀进入乙醚中。通过过滤分离固体并使用乙醚洗涤数次。在40℃下的烘箱内将聚合物干燥过夜。通过光散射分析显示Mn为73000g/mol，Mp为74000g/mol且PDi为1.15。通过1H NMR光谱分析显示没有TMS基团。
保护的马来酰亚胺官能团的脱保护
以薄层粉末的形式将来自前述步骤的聚合物喷涂在宽结晶皿的底部上。将结晶皿放置于在125℃下预热的真空烘箱中并应用真空。将在125℃下的加热进行1小时并且一旦温度达到室温时则将真空逐渐停止。将产生的固体/粉末收集在熔融/过滤装置中，使用乙醚洗涤数次并在室温下的真空烘箱中干燥。
1H NMR分析显示5.2ppm和6.6ppm下的信号(表示呋喃基团)消失并且6.95ppm下的新信号(表示来自马来酰亚胺的CH)出现。通过光散射分析显示Mn为77000g/mol，Mp为69000g/mol且PDi为1.1。
包含喜树碱的马来酰亚胺-功能化PC-共聚物的制备
喜树碱与来自前述步骤的马来酰亚胺功能化聚合物的连接基本上与实施例43中的描述相同。在Schlenk管中将170mg来自前述步骤的聚合物溶于0.5ml的纯乙醇。向该溶液加入50μL的PMDETA溶液的干燥DMF(5mg的50μL)，随后添加200μL的溶于DMF的喜树碱叠氮化物共轭物溶液(每毫升DMF 125mg的CPT-L-N3)。向该混合物加入另外210mg的干燥DMF以确保反应混合物的均相。将混合物短暂脱气并在惰性条件下加入4mg的CuBr。将混合物脱气并使反应在室温下进行过夜。将粗混合物溶于甲醇并通过硅胶短柱，通过沉淀纯化并在THF中洗涤。最后使用乙醚洗涤固体并在35℃-40℃下干燥过夜。通过光散射分析显示分子量(Mp)增加20％，Mn为95000g/mol， Mp为84000g/mol且PDi为1.14。产生的聚合物在CD3OD中的1H NMR分析显示7ppm-9ppm范围内的弱芳香族信号。基于8.4ppm下来自喜树碱的CH和4ppm-4.5ppm区域来自HEMA-PC的亚甲基的粗略估计产生1.5％-2％的喜树碱结合。
实施例49.喜树碱叠氮化物共轭物的连接后保护的马来酰亚胺功能化PC-共聚物 的脱保护
向100mg来自实施例46的保护的马来酰亚胺功能化共聚物的300μL的乙醇加入29.4μL的溶于DMF(10mg/ml)的PMDETA原液，随后添加117μL的喜树碱叠氮化物共轭物的DMF(30mg的240μL的DMF)原液，85μL的DMF和2.1mg的CuBr。将反应混合物彻底脱气并搅拌过夜。按照实施例48的描述进行马来酰亚胺官能团的脱保护。
实施例50.包含喜树碱和荧光素的马来酰亚胺-功能化PC-共聚物的制备
聚合
除了加入第三共聚用单体、荧光素甲基丙烯酸酯(FLMA)之外，下列聚合方案与实施例46中的描述基本相同：
所使用试剂的量在下表中进行描述：
在-78℃下将聚合反应混合物彻底脱气并使反应在室温下进行17小时。经暴露于空气将聚合淬灭。将溶于1ml甲醇的100mg四丁基氟化铵溶液加入至反应混合物。将粗反应通过硅胶，浓缩并小心沉淀进入乙醚中。通过过滤分离固体并使用乙醚洗涤数次。在40℃下的烘箱内将共聚物干燥过夜。通过光散射分析显示Mn为69000g/mol，Mp为70000g/mol且PDi为1.15。干燥聚合物的1H NMR光谱显示没有TMS基团。
保护的马来酰亚胺官能团的脱保护
使用实施例46中详述的方案将来自前述步骤的聚合物的保护的马来酰亚胺官能团脱保护。1H NMR分析显示5.2ppm和6.6ppm下的信号(表示呋喃基团)消失且6.95ppm下的新信号(表示来自马来酰亚胺的CH)出现。通过光散射分析显示Mn为72,200g/mol，Mp为63,700g/mol且PDi为1.1。
包含喜树碱和荧光素的马来酰亚胺-功能化PC-共聚物的制备
喜树碱与来自前述步骤的马来酰亚胺功能化聚合物的连接与实施例46中的描述基本相同。在Schlenk管中将170mg来自前述步骤的聚合物溶于0.5ml的纯乙醇。向该溶液加入50μL的PMDETA溶液的干燥DMF(5mg的50μL)，随后添加200μL的溶于DMF的喜树碱叠氮化物共轭物溶液(每毫升DMF 125mg的CPT-L-N3)。向该混合物加入另外210mg的干燥DMF以确保反应混合物的均相。将混合物短暂脱气并在惰性条件下加入4mg的CuBr。将混合物脱气并使反应在室温下进行过夜。将粗混合物溶于甲醇并通过硅胶短柱，通过沉淀纯化并在THF中洗涤。最后使用乙醚洗涤固体并在35℃-40℃下干燥过夜。 通过光散射分析显示分子量(Mp)增加20％，Mn为107，100g/mol，Mp为98100g/mol且PDi为1.14。产生的聚合物在CD3OD中的1H NMR分析显示7ppm-9ppm范围内的弱芳香族信号。基于8.4ppm下来自喜树碱的CH和4ppm-4.5ppm区域来自HEMA-PC的亚甲基的粗略估计产生2.5％-5％的喜树碱结合。
实施例51.喜树碱叠氮化物共轭物的连接后保护的马来酰亚胺功能化荧光素PC- 共聚物的脱保护
向100mg来自实施例50的保护的马来酰亚胺功能化共聚物的300μL乙醇加入29.4μL的溶于DMF(10mg/ml)的PMDETA原液，随后添加117μL的喜树碱叠氮化物共轭物的DMF(30mg的240μL DMF)原液，85μL的DMF和2.1mg的CuBr。将反应混合物彻底脱气并搅拌过夜。按照实施例43的描述进行马来酰亚胺官能团的脱保护。
实施例52.4-臂马来酰亚胺功能化HEMA-PC胆碱嵌段共聚物的制备4-臂保护的马 来酰亚胺功能化PC-聚合物的制备
将来自实施例11的4-臂保护的马来酰亚胺功能化引发剂和配体2，2’-联吡啶引入至Schenk管中。滴加引入二甲基甲酰胺使得引发剂和配体的重量百分比接近20％。使用干冰/丙酮混合物将产生的溶液冷却至-78℃，并在真空下脱气10分钟。将管在氮气下重新充满，并保持在氮气下将催化剂CuBr引入至Schlenck管(溴/催化剂/配体的摩尔比保持为1/1/2)。溶液立即变为黑褐色。将Schlenk管密封并保持在-78℃下。通过应用真空/氮气循环三次吹扫溶液。使用脱气的纯乙醇，保持在氮气下，通过混合确定量的单体制备HEMA-PC溶液。将单体溶液滴加至Schlenk管中并通过轻搅拌均质化。将温度保持在-78℃。将彻底的真空应用于反应混合物至少10分钟至15分钟直至来自溶液的鼓泡停止。然后，将管重新充满氮气并升至室温。将溶液搅拌，并当聚合进行时，溶液变粘稠。38小时后，通过直接暴露于空气以将Cu(I)氧化为Cu(II)而将反应淬灭，混合物的颜色变为蓝绿色，并使其通过硅胶，浓缩并小心沉淀进入乙醚中。通过过滤分离固体并使用乙醚洗涤数次。在40℃下的烘箱内将聚合物干燥过夜。所使用试剂的量在下表中进行描述：
通过光散射分析显示Mn为550,000g/mol，Mp为640,000g/mol 且PDi为1.18。
4-臂马来酰亚胺功能化HEMA-PC胆碱嵌段共聚物的制备
其中嵌段共聚物具有通式：
在惰性条件下，向300mg来自前述步骤的聚合物的0.7ml乙醇混合物加入1mg溶于42mg DMF的PMDETA，随后加入1mg的CuBr。将反应混合物立即冷却至-78℃并彻底脱气。将水溶液(72％w/w)形式的2(甲基丙烯酰基氧基)乙基三甲基氯化铵(MC)初步通过短柱以去除稳定剂。将177mg的溶液加入至反应混合物，并在-78℃下将混合物彻底脱气30分钟直至看不见气泡。使反应混合物重新充满氮气并使反应在室温下进行44小时。通过1H NMR估算的转化表明15％的MC转化为聚合物。通过透析纯化粗混合物以去除任何低分子量的杂质(MWCO 15kDa)，随后冻干。1H NMR分析显示紧邻来自磷酰胆碱(4ppm至4.5ppm)的三组峰的来自胆碱基团的4.5ppm区域(CH2O)的新峰。最终聚合物在CD3OD中的1H NMR分析显示5％-10％的MC与HEMA-PC的摩尔比。按照实施例43中的描述通过脱保护产生马来酰 亚胺官能团。在HEMA-PC聚合结束时加入MC的情况下，在一步方法中观察到类似的链延长。
实施例53.3-臂二醇功能化HEMA-PC荧光素嵌段共聚物的制备
聚合
将4.66mg的2，2’联吡啶加入至Schlenk管，随后加入41.3μL的来自实施例37的引发剂的DMF(10mg/100mL的DMF)原液以及83.4μL的CuBr2的DMF(10mg/ml的DMF)原液。在-78℃下，将混合物在真空下脱气。在惰性条件下，向反应混合物加入1.6mg的CuBr，随后滴加2g溶于3.75ml的纯乙醇的HEMA-PC。将容器密封并在真空下在-78℃下脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使反应在室温下进行48小时。通过1HNMR估算的转化率大于98％。通过光散射分析显示Mp为457kDa，Mn为407kDa且PDi为1.13。
将粗混合物通过硅胶塞并通过沉淀进入THF纯化，随后使用THF洗涤，然后使用乙醚最后洗涤。
3-臂二醇功能化HEMA-PC荧光素嵌段共聚物的制备
将1.409g来自前述步骤的聚合物溶于4ml的纯乙醇。向反应混合物加入溶于182mg的DMF的14mg的FLMA溶液，510mg的DMF和3mg的2，2’联吡啶。在添加1.34mg的CuBr和1mg的Cu(0)之前，将反应混合物彻底脱气。将反应混合物彻底脱气并使其在室温下进行8小时。将粗混合物通过硅胶塞并通过在THF中沉淀纯化，随后使用THF洗涤并使用乙醚另外洗涤。将最终的聚合物分离，其为黄色粉末形式。通过甲醇中的1H NMR和370nm下的吸收证实荧光素的存在。通过光散射而在聚合物上进行的分子量分析表明分子量增加至Mp为501kDa且PDi为1.28。
实施例54.包含炔烃基团的醛功能化PC共聚物的制备
聚合
所使用试剂的量在下表中进行描述：
使用来自实施例39的引发剂。在-78℃下将聚合反应混合物彻底脱气并使其在室温下进行64小时。经暴露于空气将反应淬灭。将溶于1ml的甲醇的100mg的四丁基氟化铵溶液加入至反应混合物。将粗反应混合物通过硅胶，浓缩并小心沉淀进入乙醚中。通过过滤分离固体并使用乙醚洗涤数次。将聚合物在40℃下的烘箱中干燥过夜。通过光散射分析显示Mn为71,000g/mol，Mp为64000g/mol且PDi为1.15。干燥聚合物的1H NMR光谱显示没有TMS基团。
通过高碘酸盐氧化产生醛官能团
向二醇功能化聚合物的蒸馏水(10wt.％)溶液引入溶于蒸馏水的大量过量的高碘酸钠。在黑暗条件下，使反应在室温下进行90分钟。使用丙三醇水溶液(1.5X vs.NaIO4)淬灭反应以去除任何未反应的高碘酸钠。将混合物在室温下搅拌15分钟，并放入透析袋(MWCO 14至25kDa)中用于在室温下纯化一天。通过冻干去除水并以干燥粉末形式收集聚合物。
实施例55.包含环氧化物基团的二醇功能化PC共聚物的制备
将9.13mg的2，2’联吡啶加入至Schlenk管，随后是80μL来自实施例26的引发剂的DMF原液(10mg/100ml的DMF)。在-78℃下，将混合物在真空下脱气。在惰性条件下，向该反应混合物加入4.2mg的CuBr，随后通过滴加添加1g的HEMA-PC和23μL溶于2ml的纯乙醇的纯化甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)(通过稳定剂去除器以去除MEHQ稳定剂)的混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行3小时。将粗混合物通过硅胶塞并通过沉淀进入THF中纯化，随后使用THF洗涤，然后使用乙醚最后洗涤。通过光散射分析显示Mp为92kDa，Mn为83kDa且PDi为1.1。
实施例56.包含环氧化物基团的保护的马来酰亚胺功能化PC共聚物的制备
将13.55mg的2，2’联吡啶加入至Schlenk管，随后是13.52mg来自实施例26的引发剂。将固体溶于142mg的DMSO。在-78℃下，将混合物在真空下脱气。在惰性条件下，向该反应混合物加入6.22mg的CuBr，随后通过滴加添加1g的HEMA-PC和78μL溶于2ml的200纯乙醇的纯化GMA(通过稳定剂去除器以去除MEHQ稳定剂)的混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行3小时。将粗混合物通过硅胶塞并通过沉淀进入THF中纯化，随后使用THF洗涤，然后使用乙醚最后洗涤。通过光散射分析显示Mp为71kDa，Mn为65kDa且PDi为1.13。
实施例57.包含乙酰乙酸酯基团的保护的马来酰亚胺功能化PC共聚物的制备
将13.55mg的2，2’联吡啶加入至Schlenk管，随后加入13.52mg来自实施例26的引发剂。将固体溶于142mg的DMSO。在-78℃下，将混合物在真空下脱气。在惰性条件下，向该反应混合物加入6.22mg的CuBr，随后通过滴加添加1g的HEMA-PC和110μL溶于2ml的纯乙醇的纯化2-甲基丙烯酸2-(乙酰乙酸基)乙酯(MEA)(通过稳定剂去除器以去除MEHQ稳定剂)的混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行3小时。将粗混合物通过硅胶塞并通过沉淀进入THF中纯化，随后使用THF洗涤，然后使用乙醚最后洗涤。通过光散射分析显示Mp为85kDa，Mn为79kDa且PDi为1.15。
实施例58.包含炔烃和乙酰乙酸酯基团的保护的马来酰亚胺功能化PC共聚物的制 备
将13.55mg的2，2’联吡啶加入至Schlenk管，随后是13.52mg来自实施例26的引发剂。将固体溶于142mg的DMSO。在-78℃下，将混合物在真空下脱气。在惰性条件下，向该反应混合物加入6.22mg的CuBr，随后通过滴加添加1g的HEMA-PC、56.3mg的TMS-PgMA和55μL溶于2ml的纯乙醇的纯化MEA(通过稳定剂去除器以去除MEHQ稳定剂)的混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行3小时。将粗混合物通过硅胶塞并通过沉淀进入THF中纯化，随后使用THF洗涤，然后使用乙醚最后洗涤。通过光散射分析显示Mp为78kDa，Mn为72kDa且PDi为1.13。
实施例59.包含炔烃基团的二醇功能化PC共聚物的制备
所使用试剂的量在下表中进行描述：
使用来自实施例26的引发剂。在-78℃下将聚合反应混合物彻底脱气并使其在室温下进行14小时。经暴露于空气将反应淬灭。将100mg溶于1ml的甲醇的四丁基氟化铵溶液加入至反应混合物。将粗反应混合物通过硅胶，浓缩并小心沉淀进入乙醚。通过过滤分离固体并使用乙醚洗涤数次。在40℃下的烘箱中将聚合物干燥过夜。通过光散射分析显示Mn为222,000g/mol，Mp为277,000g/mol且PDi为1.2。干燥聚合物的1H NMR光谱显示没有TMS基团。
实施例60.具有9-叠氧基-4，7-二氧杂壬酸的六谷氨酸酰胺与包含炔烃基团的二 醇功能化PC共聚物的连接并随后产生来自二醇前体的醛官能团
将13.55mg的2，2’联吡啶加入至Schlenk管，随后加入13.52mg来自实施例26的引发剂。将固体溶于142mg的DMSO。在-78℃下，将混合物在真空下脱气。在惰性条件下，向该反应混合物加入6.22mg的CuBr，随后通过滴加添加1g的HEMA-PC、56.3mg的TMS-PgMA和55μL溶于2ml的200纯乙醇的纯化MEA(通过稳定剂去除器以去除MEHQ稳定剂)的混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行3小时。将粗混合物通过硅胶塞并通过沉淀进入THF中纯化，随后使用THF洗涤，然后使用乙醚最后洗涤。通过光散射分析显示Mp为78kDa，Mn为72kDa且PDi为1.13。
将45mg来自实施例59的具有炔烃基团的二醇功能化PC共聚物 溶于800mg-900mg的去离子水。在圆底烧瓶中，将13.5μL的PDMETA(来自10mg的100μL的DMF原液)加入至反应混合物。将7mg来自实施例45的具有9-叠氮基-4，7-二氧杂壬酸的六谷氨酸酰胺溶于70μL的DMF并连同2.1mg的CuBr加入至反应混合物。将混合物彻底脱气，放置在惰性条件下并在室温下搅拌过夜。
按照实施例45的描述，在OD 220nm下通过阴离子交换色谱监测反应效率。在时间零处注射显示存在流经的未反应的聚合物，并且在10.6min显示未反应的肽。在过夜反应后，聚合物峰消失，并且相应于聚合物修饰的肽的新峰在11.6min出现。该峰为宽的，表明存在多种聚合物-肽物质，因为各个聚合物具有多种炔烃基团以用于叠氮化物修饰的肽的潜在连接。
通过阴离子交换色谱纯化
基于分析阴离子交换色谱经验，使用得自GE Healthcare的Hitrap DEAE FF柱(5ml)，在Akta Prime Plus系统上使用阴离子交换色谱纯化聚合物修饰的肽。缓冲液A为20mM Tris pH 7.5，且缓冲液B为包含0.5M NaCl的缓冲液A。使用缓冲液A平衡柱，随后是三个柱体积的缓冲液B，然后使足够的缓冲液A返回柱洗脱液达到与缓冲液A相同的电导率。在缓冲液A中将700μg的粗聚合物修饰的肽装载在柱上，并使用足够的缓冲液A洗涤柱以返回柱洗脱液达到与缓冲液A相同的电导率。使用20％B、30％B、50％B、70％B和100％B以梯度方式进行洗脱。收集10ml馏分并将馏分17和18合并(20ml)以形成40％B合并池(pool)，并将馏分19和20合并以形成70％B合并池(20ml)。使用Amicon Ultra 30kDa MWCO浓缩器将两个合并池浓缩至体积为0.5ml-1ml。如上所述，使用来自实施例45的分析阴离子交换方法进行分析，这表明70％B合并池包含单一宽峰。40％B合并池也包含比70％B峰略早洗脱的单一宽峰，这表明存在肽修饰的聚合物，其中每个聚合物具有较少肽。在具有装备有Waters 2685双波长检测器的2695Alliance溶剂递送系统的Waters HPLC系统上，使用体积排阻色谱法进行进一步分析。在1ml/min，使用1×PBS pH 7.4下，使用来自GE Healthcare的Superdex 200柱(10×300mm)对样品进行色谱分析25分钟。在OD 220nm和OD 280nm下监测色谱图。来自阴离子交换纯化的两个40％B和70％B合并池在约9分钟的峰值保留时间下洗脱，这等于分子量为500kDa-600kDa。在220nm和280nm下峰为可见的，表明聚合物和肽的存在。未反应的聚合物在相似的位置洗脱，但仅在220nm为可见的，同时未反应的肽洗脱的保留时间为18分钟，但仅在280nm为可见的。
通过在六谷氨酸修饰的PC共聚物上的高碘酸盐氧化将末端二醇官能团转化为醛 官能团
按照实施例54的描述，使用高碘酸盐氧化将来自前述步骤的聚合物修饰的肽的阴离子交换纯化和浓缩的70％B洗脱合并池上的末端二醇官能团转化为醛官能团。
实施例61.碱性磷酸酶与包含六谷氨酸的醛功能化PC聚合物的结合
将碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich)缓冲交换进入25mM Hepes pH 7(共轭缓冲液)并浓缩至5mg/ml-8mg/ml。在40mM氰基硼氢化钠的存在下，在3-5×摩尔过量的来自实施例60的包含六谷氨酸的醛功能化PC共聚物下进行与蛋白质的结合反应，最终的蛋白质浓度为约1mg/ml。在室温下，在卷曲密封的玻璃小瓶中将所有反应进行过夜。将聚合物的二醇形式用作阴性对照。在1×PBS pH 7.4中，1rml/min下，在Superdex 200柱(10/300mm)上分离40μL的各个反应。收集1ml的馏分并如下测试碱性磷酸酶活性。使用20mM Tris pH 7.5将5μL的SEC馏分稀释5倍，并加入100μL的PNPP底物并在37℃下将样品孵化20分钟。使用来自Molecular Devices的SpectraMax Plus 384酶标仪检测OD 405nm。如所期望的，当使用二醇功能化聚合物时，没有观察到结合。然而，在醛功能化聚合物的情况下，在8分钟-10分钟保留时间范围内检测碱性磷酸酶活性，其相应于游离聚合物和较高分子量的物质，以及12分钟-13分钟范围内相应于游离碱性磷酸酶。
实施例62.人Fab与包含喜树碱的马来酰亚胺功能化PC共聚物的结合
通过全人IgG胃蛋白酶消化(Innovaive Research)制备人Fab以产生Fab2，随后使用TCEP随后还原以产生Fab。在4℃下，在0.1M醋酸钠pH 4.5中将IgG的胃蛋白酶消化进行过夜以获得超过90％的消化效率。然后，使用具有MacroCap SP柱的阳离子交换色谱进一步纯化Fab2片段。在pH 5下，使用100-200mM NaCl洗脱纯化的Fab2片段，同时在未结合的片段中洗脱游离胃蛋白酶和所有其它污染物。然后，在37℃下，使用2×摩尔比的TCEP将纯化的Fab2还原30分钟，并将凝胶过滤色谱用于纯化来自未还原的Fab2和游离TCEP的Fab。然后，将Fab片段合并且缓冲交换进入结合缓冲液。下文描述的结合实验用于将1mg的Fab与来自实施例48的13×摩尔过量的84kDa包含喜树碱的马来酰亚胺功能化PC共聚物结合。使用2mM EDTA，在10mM醋酸钠pH 5中进行结合反应。在溶于结合缓冲液的13×摩尔过量的聚合物的存在下和3×摩尔过量的TCEP作为还原剂，最终的Fab浓度为2.7mg/ml。在浓度为100mg/ml-300mg/ml下，将聚合物溶于结合缓冲液，随后添加TCEP和Fab。将反应混合物轻混合，并在室温下在黑暗中将结合进行过夜。
在非还原条件下，能使用SDS-PAGE监测结合状态，大于游离Fab的高MW物质的累积是结合结果的良好指标。这类高MW共轭物物质特征在于：(1)由于喜树碱的存在而产生UV照射下的荧光；(2)由于存在蛋白质，共轭物带应可通过考马斯蓝染色(聚合物不染色)；(3)高MW物质在还原条件下不移动，这是它们不是由于二硫化物介导的聚集的良好说明。
或者，在1×PBS pH 7.4中，在1ml/min下，能使用来自GE Healthcare的具有分析SEC的Superdex 200(10/300mm)柱监测结合情况。在这种运行条件下，游离Fab在15.3min下洗脱，并且游离聚合物在10.6min下洗脱。
如上所述，为进一步表征Fab-聚合物-喜树碱共轭物的存在，在pH 5下，使用来自GE Healthcare的1ml阳离子交换色谱(CEX)或MacroCap SP柱进一步分离反应混合物。将柱与装备有OD 280nm检 测器、电导仪和馏分收集器的AKTA Prime Plus色谱系统连接。缓冲液A为10mM醋酸钠pH 5且缓冲液B为包含0.5M NaCl的缓冲液A。使用SDS-PAGE进一步分析洗脱馏分。
当Fab在pH 5下质子化时，以及10mM NaCl下的低离子强度，Fab-共轭物和游离Fab与阳离子交换柱结合，同时未结合的聚合物不应与CEX相互作用，因此应保留在流过部分中。收集未结合的片段用于分析。在使用至少15柱体积(CV)的缓冲液A洗涤后，使用分别等于包含40mM、60mM、100mM、200mM和500mM NaCl的缓冲液A的8％、12％、20％、40％和100％缓冲液B梯度洗脱柱。在各个洗脱步骤中，使至少10CV的各个洗脱缓冲液通过柱并收集1.5ml的馏分并连续监测OD 280nm痕迹直至在开始更高的盐洗脱梯度之前基线降至至少5％的初始缓冲液背景。
使用具有10kDa分子量截留(MWCO)膜的Amicon Ultrafree浓缩器收集和浓缩各个步骤洗脱的峰馏分。使用1mm NuPAGE Novex4％-12％梯度凝胶，在非还原和还原条件下使用SDS-PAGE分析浓缩液，根据制造商的说明书(Invitrogen Corp)进行电泳。用于SDS-PAGE分析的样品包括初始反应混合物、MacroCap SP柱未结合片段、柱洗涤部分以及8％、12％、20％和40％洗脱合并池的浓缩部分。一旦电泳完成，就从盒中拆卸PAGE并放置在UV照明器上以检验由包含喜树碱的聚合物和共轭物产生的荧光。在使凝胶进行使用得自Invitrogen的SimplyBlue染色系统的考马斯蓝染色之前立即拍照以检验包含蛋白质的带。
基于SDS-PAGE分析的结果表示下列：
大量未结合MacroCap SP片段基于考马斯蓝染色不含蛋白质，但在孔的高分子量范围下(≥160kDa)表现出大量荧光信号。此外，当通过Bradford蛋白质检验分析片段时，其显示与MacroCap SP柱负载相比根本没有蛋白质信号；这是证实未结合片段缺乏包含Fab和Fab-聚合物共轭物的任何蛋白质的另外的证据。然而，其主要包含游离聚合物但没有游离喜树碱，因为喜树碱在该分子量范围下太小而不移动。
8％和12％B的馏分包含由考马斯蓝染色的两种主要物质，一种为 游离Fab且另一种为具有110kDa-260kDa分子量跨度的较高分子量的扩散带，仅后面的带显示荧光但没有游离Fab。基于前面不能通过考马斯蓝染色聚合物的证据和未结合馏分主要包含聚合物并且不显示考马斯蓝染色的事实，我们推断高分子量物质为包含Fab和具有喜树碱的聚合物二者的共轭物。
在20％和40％的洗脱馏分中观察到没有荧光，因为些相应于游离Fab和Fab2片段。这些两种馏分构成大部分洗脱的蛋白质(＞80％)，如所期望的，其为共轭物在低盐洗脱馏分中富集的良好说明(由于聚合物的期望的屏蔽效应)。
还使洗脱馏分合并池经历使用DTT的还原条件，并且Fab带向下移动至25kDa位置，其为由于内链二硫化物连接基团的还原产生的轻链和半重链分离的良好说明。如上所述，在这种条件下，高分子量下的荧光信号不移动并也通过考马斯蓝染色。该观察证实高分子量物质与聚合物共价连接而非通过二硫化物连接基团非共价缔合或连接。
除了SDS-PAGE分析之外，使MacroCap SP洗脱馏分进行使用来自GE Healthcare的Superdex 200(10×300mm)柱和具有二极管阵列检测器2669的2695 Alliance溶剂递送系统的Waters HPLC系统的分析SEC。在1ml/min的流速下，在1×PBS pH 7.4中进行分析。在OD220nm检测蛋白质、聚合物和喜树碱的情况下，使用OD 220nm、OD280nm和OD 355nm监测色谱图，OD 280nm仅检测蛋白质和喜树碱，且OD 355nm仅检测喜树碱。结果如下：
实施例63.人Fab与包含喜树碱和荧光素的马来酰亚胺功能化PC共聚物的结合
结合反应条件、纯化、分析和结论与实施例62基本相同，除了下 列之外：
使用来自实施例50的98kDa的包含喜树碱和荧光素的马来酰亚胺功能化PC共聚物。
对于MacroCap SP洗脱，另外的4％B洗脱在8％B洗脱之前。因此，在SDS-PAGE和SEC分析中均包含4％B洗脱合并池。4％B合并池也显示荧光，其为该馏分也包含共轭物的良好说明。
未结合MacroCap SP片段的SEC/MALS分析证实该片段仅由游离聚合物组成。
实施例64.Traut’s试剂修饰的人全IgG与包含喜树碱和荧光素的马来酰亚胺功能 化PC共聚物的结合
在该实施例中，在1×PBS pH 7.4中，首先使用3倍摩尔过量比的Traut’s试剂修饰全人IgG(Innovative Research)。反应设置包括1×PBS pH 7.4中的10mg/ml IgG和3mg/ml Traut’s试剂，反应体积为300μL且在搅拌下，在黑暗中将反应在室温下进行1小时。当反应完成时，使用10ml BioGel P30脱盐柱将反应混合物缓冲交换进入具有2mMEDTA的10mM醋酸钠pH 5。在pH 5下和EDTA的存在下，防止巯基基团氧化形成二硫化物连接基团。将柱与装备有OD 280nm检测器、电导仪和馏分收集器的AKTA Prime Plus连接。收集蛋白质馏分并浓缩至4.45mg/ml。现在，样品已准备好与聚合物结合。SDS-PAGE分析显示在这些条件下使用Traut’s试剂修饰IgG未导致蛋白质聚集。
在20倍聚合物摩尔过量下的10mM醋酸钠pH 5中进行Traut’s修饰的IgG与聚合物的结合。IgG和聚合物的最终浓度分别为3.8mg/ml和44mg/ml。将反应在室温下进行过夜。当反应完成时，按照实施例62的描述使结合反应进行阳离子交换色谱而不进行修饰。通过SDS-PAGE分析8％B、12％B、20％B和40％B下的洗脱馏分合并池并使其进行UV照明。结果显示仅8％B洗脱馏分包含大于IgG单体和游离聚合物的高分子量物质。此外，使用考马斯蓝染色并表现出荧光的带表明共轭物的存在。如实施例62和63描述的，在还原条件下，带不再向下移动，表明IgG-聚合物共轭物的存在。
实施例65.2-(丙烯酰氧基乙基-2’-(三甲基铵)磷酸乙酯，内盐的制备第1中间体
在氮气环境下，将11.6克的丙烯酸2-羟基乙酯和14.0ml的三乙胺的100ml的干燥乙腈溶液冷却至-20℃，在约30分钟内滴加14.2克的2-氯-2-氧代-1，3，2-二氧杂磷杂环戊烷的10ml的干燥乙腈溶液。将反应在冷却条件下搅拌30分钟，然后在氮气环境下过滤。使用10ml的冷乙腈洗涤沉淀，并将滤液直接用于下一步反应。
2-(丙烯酰氧基乙基-2’-(三甲基铵)磷酸乙酯，内盐
向来自前述步骤的溶液加入14.0ml的三甲胺(在氮气下使用干冰丙酮冷凝器冷凝)，将反应混合物密封放入压力容器，并在65℃下搅拌4小时。使反应混合物搅拌同时冷却至室温，并且当其达到约30℃时，固体开始形成。然后，将容器放置在4℃的冰箱中过夜。严格地在氮气环境下，通过过滤回收固体，使用20ml的冷却干燥的乙腈洗涤，然后在氮气流下干燥15分钟。然后，将固体在真空下干燥过夜以产生12.4克白色固体形式的产物。NMR(CDCl3)：δ6.41(dd，1H，J＝1.6，17.2Hz，乙烯基CH)，6.18(dd，1H，J＝10.6，17.2Hz，乙烯基CH)，5.90(dd，1H，J＝1.6，10.4Hz，乙烯基CH)，4.35(m，2H)，4.27(m，2H)，4.11(m，2H)，3.63(m，2H)，3.22(s，9H，N(CH3)3)。
实施例66.甲基丙烯酸3-三甲基甲硅烷基炔丙酯的制备
使用干冰/乙腈/乙二醇浴将3.0克的3-(三甲基甲硅烷基)炔丙基醇和4.2ml的三乙胺的50ml的乙醚溶液冷却至-10℃，并在30分钟内 滴加2.9克的甲基丙烯酰氯的25mL的乙醚溶液。将反应混合物搅拌同时在4小时内升至室温，然后过滤并浓缩以产生油状残留物，使其进行使用1％乙醚的己烷的硅胶上的快速柱层析。将包含产物的部分合并，浓缩，并如前所述使其进行第二次层析以产生2.46g透明、无色油状物形式的产物。NMR(CDCl3)：δ6.18(t，1H，CCH2，J＝1.2Hz)，5.62(p，1H，CCH2，J＝1.6Hz)，4.76(s，2H，CH2)，1.97(d of d，3H，CCH3，J＝1.0，1.6Hz)，0.187(s，9H，Si(CH3)3)。
实施例67.N-碘乙酰基炔丙基胺的制备
使用4.0ml的二异丙基乙基胺处理1.05克的炔丙基胺盐酸盐的20ml的干燥乙腈溶液，随后添加4.29克的碘代醋酸酐的20ml的干燥乙腈。将反应在室温下搅拌1.5小时，然后浓缩以产生残留物，将其在100ml的乙酸乙酯和100ml的水之间分层。使用50ml的饱和氯化钠洗涤有机相，然后在硫酸钠上干燥。浓缩产生黑色固体，使其进行使用30％-40％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将干净的包含产物的部分合并，并且浓缩以产生固体，使用少量己烷将其研磨并风干以产生940mg极浅黄色固体形式的产物。NMR(CDCl3)：δ6.25(s，1H，CH)，4.08(app d of d，2H，NCH2，J＝2.6，5.3)，3.72(s，2H，ICH2)，2.28(t，1H，NH，J＝2.6Hz)。
实施例68.4-戊炔-1-醇，NHS酯的制备
使用300mg的DPTS处理1.02克的4-戊炔酸和1.20克的N-羟基琥珀酰亚胺的20ml的干燥乙腈溶液，随后加入2.8克的DCC，并将反应在室温下搅拌过夜。将反应过滤并浓缩以产生残留物，使其进行使用30％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将包含产物的部分合并，并且浓缩以产生1.62克白色固体形式的目标产物。 NMR(CDCl3)： 2.89(d d，2H，CH2C＝O，J＝7.9，6.4Hz)，2.85(s，4H，O＝CCH2CH2C＝O)，2.62(app d d d，2H，CHCCH2，J＝8.6，6.9，2.7Hz)，2.06(t，1H，CH，J＝2.7Hz)。
实施例69.N-炔丙基马来酰亚胺的制备
使用冰水浴冷却1.08克的炔丙基胺盐酸盐的50ml的饱和碳酸氢钠溶液，并在几分钟内分批加入2.0克的N-乙酯基马来酰亚胺(N-carboethoxymaleimide)。将反应在冷却条件下搅拌30分钟，然后在25分钟内升至室温。然后，使用3×25ml的二氯甲烷萃取反应，将其在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。在10ml的乙酸乙酯中处理残留物并在50℃下加热两小时以完成环化。将反应浓缩并使残留物进行使用30％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。如前所述的第二色谱分析产生1.24g极浅的黄色油状物形式的产物。NMR(CDCl3)： 6.77(s，2H，CHC＝O)，4.30(d，2H，NCH2，J＝2.4Hz)，2.22(t，1H，CCH，J＝2.5Hz)。
实施例70.5-己炔-1-醛的制备
在室温下，使用3.0克的戴斯-马丁氧化剂处理694mg的5-己炔-1-醇的20ml二氯甲烷溶液，并将溶液在室温下搅拌2小时。将反应过滤并将滤液浓缩以产生残留物，使其进行使用乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。浓缩合适的馏分产生非常浅的黄色油状物形式的产物。NMR(CDCl3)： 9.81(t，1H，CH＝O，J＝2.6Hz)，2.61(t d，2H，CH2CH＝O，J＝7.1，1.2Hz)，2.28(t d，2H，CCH2，J＝7.1，2.6Hz)，1.99(t，1H，CCH，J＝2.6Hz)，1.86(p，2H，CCH2CH2，J＝7.0Hz)。
实施例71.重组人红细胞生成素与包含六谷氨酸的醛功能化PC聚合物的结合
将重组人红细胞生成素(R&D Systems)缓冲交换进入25mMHepes pH 7(共轭缓冲液)并浓缩至5mg/ml。在40mM氰基硼氢化钠的存在下，在3-5×摩尔过量的来自实施例60的包含六谷氨酸的醛功能化PC共聚物下进行与蛋白质的结合反应，最终的蛋白质浓度为约1mg/ml。在室温下，在卷曲密封的玻璃小瓶中将所有反应进行过夜。将聚合物的二醇形式用作阴性对照。在1×PBS pH 7.4中，1ml/min下，在Superdex 200柱(10/300mm)上分离40μL的各个反应。收集1ml的馏分并在OD 220nm和OD 280nm下分析。如所期望的，当使用二醇功能化聚合物时，没有观察到结合。然而，在醛功能化聚合物的情况下，观察到红细胞生成素-聚合物共轭物的存在，因为在游离聚合物和较高分子量物质洗脱的情况下，单独在8分钟-10分钟保留时间范围内OD 280nm∶OD 220nm比例远高于游离聚合物。游离红细胞生成素在14分钟-15分钟范围内洗脱。
实施例72.9-(甲基丙烯酰基氧基)-4，7-二氧杂壬酸，4-磺基-2，3，5，6-四氟苯基 酯，钠盐的制备
9-(甲基丙烯酰基氧基)-4，7-二氧杂壬酸，叔丁酯的制备
使用冰水浴冷却5.0克的4，7-二氧杂-9-羟基壬酸叔丁酯的100ml的乙醚溶液，以及5.9ml(2eq)的三乙胺，并在几分钟内滴加2.3克的甲基丙烯酰氯的5ml的乙醚溶液。将反应在冷却条件下搅拌30分钟，然后使其升至室温。通过TLC(硅胶，50％的乙酸乙酯的己烷)反应显示未完成，因此滴加另外1.0g的甲基丙烯酰氯。另外2小时后，反应显示完成，因此使用50ml的水洗涤反应混合物，然后在硫酸钠上干燥。过滤并浓缩产生油状残留物，使其进行使用20％-30％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的馏分合并，并且浓缩以产生4.07克透明，接近无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ6.13(br m，1H，C＝CHH)，5.57(br app t，1H，J＝1.6Hz，C＝CHH)，4.29(app t，2H，J＝4.8Hz，C＝OOCH2)，3.70-3.76(m，4H)，3.61-3.67(m，4H)，2.50(t，2H，J＝6.4Hz，C＝OCH2)，1.95(app t，3H，CH2＝CCH3)，1.45(s，9H，C(CH3)3)。
9-(甲基丙烯酰基氧基)-4，7-二氧杂壬酸的制备
将3.70克的9-(甲基丙烯酰基氧基)-4，7-二氧杂壬酸叔丁基酯的15ml的88％甲酸溶液在室温下搅拌5小时，此时通过TLC(硅胶，50％的乙酸乙酯的己烷)反应显示完成。浓缩产生油状物，将其在100ml的二氯甲烷和50ml的水之间分层，并在硫酸钠上干燥有机层。过滤并浓缩产生油状物，使其进行使用40％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的馏分合并，并且浓缩以产生2.01克透明、无色油状物形式的目标产物。NMR(CDCl3)：δ6.14(br m，1H，C＝CHH)，5.58(br app t，1H，J＝1.6Hz，C＝CHH)，4.31(app t，2H，J＝4.8Hz，C＝OOCH2)，3.73-3.80(重叠tm，4H，J＝6Hz)，3.66(m，4H)，2.65(t，2H，J＝6Hz，C＝OCH2)，1.95(app t，3H，CH2＝CCH3)。
9-(甲基丙烯酰基氧基)-4，7-二氧杂壬酸，4-磺基-2，3，5，6-四氟苯基酯，钠盐的 制备
使用1.06克的DCC处理970mg的9-(甲基丙烯酰基氧基)-4，7-二氧杂壬酸和1.06克的4-磺基-2，3，5，6-四氟苯基，钠盐的20ml的干燥乙腈的混合物，并将反应在室温下搅拌1.5小时。过滤并浓缩至接近干燥产生残留物，使其进行使用5％的甲醇的二氯甲烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的馏分合并，并且浓缩以产生固体，将其放置在真空下过夜以产生783mg轻微粘稠的固体形式的目标产物。NMR(1H，CD3OD)：δ6.10(h，1H，CH2，J＝0.9Hz)，5.61(p，1H，CH2，J＝1.6Hz)，4.27(m，2H，CH2OC＝O)，3.87(t，2H，CH2CH2C＝O，J＝6.0Hz)，3.75(m，2H， CH2CH2OC＝O)，3.67(s，4H，OCH2CH2O)，2.98(t，2H，CH2C＝O，J＝6.0Hz)，1.92(d of d，3H，CH3，J＝1.6，0.9Hz)。NMR(19F、CD3OD)：δ-140.92(m，2F，SCCF)，155.00(m，2F，OCCF)。
实施例73.(2-巯基乙基)甲基丙烯酸酯，S-硫酸盐的制备(2-溴乙基)甲基丙烯酸 酯的制备
使用冰水浴冷却6.25克的溴乙醇和8.36ml的三乙胺的50ml的二氯甲烷溶液，并滴加5.0克的甲基丙烯酰氯的5ml的二氯甲烷溶液。将反应在室温下搅拌4小时，然后加入另外50ml的二氯甲烷并使用2×25mL的水，然后使用25ml的饱和氯化钠洗涤反应。将有机物在硫酸钠上干燥，过滤并浓缩以产生橙色残留物，使其进行使用10％的乙酸乙酯的己烷的硅胶上的快速柱层析。将合适的馏分合并，并且浓缩以产生3.15克透明油状物形式的产物，其足够纯以直接用于下一步反应。NMR(CDCl3)：δ6.18(app p，1H，J＝1.1Hz，C＝CHH)，5.62(p，1H，C＝CHH，J＝1.6Hz)，4.46(t，2H，J＝6.0Hz，CH2OC＝O)，3.56(t，2H，CH2Br，J＝6.0Hz)，1.97(dd，3H，J＝1.4，1.1Hz，CH3C＝C)。
(2-巯基乙基)甲基丙烯酸酯，S-硫酸盐的制备
向5.25克的硫代硫酸钠五水合物和10mg的对苯二酚的45ml的水和30ml的异丙醇溶液加入3.0克的(2-溴乙基)甲基丙烯酸酯并将反应在室温下搅拌过夜。浓缩产生残留物，将其在20ml的乙醇和20ml的甲醇中处理。过滤并浓缩产生白色固体，使用45ml的异丙醇将其制浆。剧烈搅拌4小时后，通过过滤回收固体，使用少量异丙醇洗涤并在真空下干燥以产生940mg白色固体形式的目标产物。NMR(CD3OD)：δ6.11(h，1H，CH2，J＝0.9Hz)，5.62(p，1H，CH2，J＝1.6Hz)，4.47(t，2H，OCH2，J＝6.9Hz)，3.31(t，2H，SCH2，J＝6.9Hz)，1.93(d of d，3H，CH3，J＝1.5，1.0Hz)。
实施例74.包含三甲氧基硅烷官能团的PC共聚物的制备
将32.18mg的2，2’联吡啶放置在Schlenk管中，随后是20.1mg的引发剂α-溴异丁酸乙酯并溶于160mg的DMSO。将混合物在真空下脱气10分钟。在惰性条件下加入14.78mg的CuBr，并将反应混合物冷却至-78℃，脱气并重新充满惰性气体。将1.033g的HEMA-PC和46mg的甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯溶于4ml的纯乙醇并滴加至反应混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下彻底脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行2小时。通过光散射分析显示Mp为24kDa，Mn为22kDa且PDi为1.05。
实施例75.包含保护的硫醇官能团的PC共聚物的制备
将74.8mg的2，2’联吡啶放置在Schlenk管中，随后是46.58mg的引发剂α-溴异丁酸乙酯并溶于520mg的DMSO。将混合物在真空下脱气10分钟。在惰性条件下加入34.26mg的CuBr，并将反应混合物冷却至-78℃，脱气并重新充满惰性气体。将1.601g的HEMA-PC 和70.8mg的S-磺基-(2-硫乙基)甲基丙烯酸酯，钠盐(来自实施例73)溶于6.2ml的纯乙醇并滴加至反应混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下彻底脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行3小时。通过光散射分析显示Mp为17kDa，Mn为16kDa，且PDi为1.05。
实施例76.包含保护的硫醇官能团和四氟苯酚酯官能团的PC共聚物的制备
将64mg的2，2’联吡啶放置在Schlenk管中，随后加入40mg的引发剂α-溴异丁酸乙酯并溶于300mg的DMSO。将混合物在真空下脱气10分钟。在惰性条件下加入29.4mg的CuBr，并将反应混合物冷却至-78℃，脱气并重新充满惰性气体。将1.8g的HEMA-PC、6.77×10-4mol的S-磺基-(2-硫乙基)甲基丙烯酸酯，钠盐(来自实施例73)和6.77×10-4mol的4，7-二氧杂-9-(甲基丙烯酰基氧基)壬酸，4-磺基，2，3，5，6-四氟苯基酯，钠盐(来自实施例72)溶于7.5ml的纯乙醇并滴加至反应混合物。将容器密封并在真空下在-78℃下彻底脱气直至看不见气泡。将反应混合物放置在惰性条件下并使其在室温下进行2小时。通过光散射分析显示Mp为24kDa，Mn为25kDa且PDi为1.05。
尽管为了清晰理解的目的而通过图示和实施例详细地描述了上述发明，但本领域技术人员理解能在附加的权利要求范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的各个参考文献以其整体通过引用并入本 文，达到如同各个参考文献单独地通过引用并入的程度。