过山厥素在制备预防和改善肥胖症药物方面的应用.pdf

《过山厥素在制备预防和改善肥胖症药物方面的应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《过山厥素在制备预防和改善肥胖症药物方面的应用.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710274414.7 (22)申请日 2017.04.25 (71)申请人 河南大学 地址 475001 河南省开封市明伦街85号 (72)发明人 康文艺 魏金凤 马常阳 邢梅梅 崔丽丽 (74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 代理人 时立新 杨海霞 (51)Int.Cl. A61K 31/7048(2006.01) A61P 3/04(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (54)发明名称 过山厥素在制备预防和改善肥胖症药物。

2、方 面的应用 (57)摘要 本发明涉及过山厥素在制备预防和改善肥 胖症药物方面的新应用。 本发明通过试验发现了 过山厥素可以抑制前脂肪细胞分化， 可能成为治 疗肥胖的一种新型化合物。 因此， 可被用作制备 预防和改善肥胖症的药物和/或保健品。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 107137414 A 2017.09.08 CN 107137414 A 1.过山厥素在制备预防和改善肥胖症药物方面的应用。 2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述过山厥素在制备抑制前脂肪细胞分化的 药物和/或保健品方面的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107137414 A 2 。

3、过山厥素在制备预防和改善肥胖症药物方面的应用 技术领域 0001 本发明属于医药和/或保健品技术领域， 具体涉及一种过山厥素在制备预防和改 善肥胖症药物方面的新应用。 背景技术 0002 过山厥素， 化学名称山萘酚-3-O- -D-吡喃葡萄糖基-7-O- -L-鼠李糖苷， 具有抗 氧化、 扩张冠状动脉、 肠平滑肌、 阻断 -受体， 阻断 -受体的作用， 是一种已知的天然化合 物， 多从植物中提取分离获得。 0003 肥胖症是遗传、 环境等多种因素引起的体内脂肪堆积过多、 体重增加的慢性代谢 性疾病。 与2型糖尿病、 血脂异常密切相关。 摄入的能量超过消耗的能量会导致脂肪的堆积。 脂肪组织的增大。

4、是由脂肪细胞数量的增多和体积增大引起的。 脂肪组织的增殖、 分化失常 会引起脂肪组织的堆积。 体内脂肪组织过多堆积会分泌一系列的激素和脂肪细胞因子干扰 胰岛素在细胞内信号传导， 引发胰岛素抵抗， 胰岛素抵抗是指体内外周组织 （肌肉、 脂肪） 对 胰岛素的敏感性降低， 使得外周组织对葡萄糖的摄取减少， 导致血糖升高， 从而诱发2型糖 尿病。 肥胖症和2型糖尿病的发病率不断上升， 已成为全球性的健康问题。 开发预防和改善 治疗肥胖症的天然产物意义尤为深远。 发明内容 0004 本发明目的在于克服现有技术缺陷， 提供一种过山厥素在制备预防和改善肥胖症 药物方面的新应用。 0005 为实现上述目的， 。

5、本发明采用如下技术方案： 过山厥素在制备预防和和改善肥胖症药物方面的新应用， 即其具有潜在的减肥功效。 0006 上述的应用， 具体的可以是： 过山厥素在制备抑制前脂肪细胞分化的药物和/或保 健品方面的应用。 0007 和现有技术相比， 本发明通过试验发现了过山厥素可以抑制前脂肪细胞分化， 可 能成为治疗肥胖、 2型糖尿病的一种新型化合物。 因此， 可被用作制备制备预防和改善肥胖 症药物和/或保健品。 附图说明 0008 图 1为油红O染色试验结果， 图中， 上部为对照组油红分化形态图， 下部为过山厥 素油红分化染色图。 具体实施方式 0009 以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介。

6、绍， 但本发明的保护范围 并不局限于此。 0010 过山厥素是一种已知的天然化合物， 多从植物中提取分离获得。 本发明中过山厥 说 明 书 1/5 页 3 CN 107137414 A 3 素从植物女贞花 （于2015年6月采集于贵州省贵阳市花溪区湿地公园， 由贵州大学张前军教 授鉴定为女贞 （Ligustrum lucidum Ait. ） 的花） 中提取获得。 具体提取分离步骤如下： 1） 取475 g干燥女贞花， 添加石油醚至浸没女贞花， 然后加热回流提取2次， 每次回流提 取2h， 回流提取结束后， 过滤， 所得残渣挥干石油醚， 用70%乙醇室温下浸渍提取3次 （70%乙 醇添加量以浸。

7、没残渣为宜） ， 每次浸渍提取3天， 合并提取液并浓缩， 得到女贞花总浸膏； 2） 女贞花总浸膏用50%乙醇溶解后， 用D101型大孔树脂吸附分离， 依次用水、 20%乙醇、 40%乙醇、 60%乙醇、 95%乙醇梯度洗脱， 每个梯度洗脱五个柱体积， 每个柱体积2000 mL， 洗脱 液浓缩后， 分别得到水部位浸膏、 20%乙醇部位浸膏7g、 40%乙醇部位浸膏60g、 60%乙醇部位 浸膏24g、 95%乙醇部位16g； 3） 40%乙醇部位浸膏 （50 g） ， 经200-300目硅胶柱色谱进行分离， 二氯甲烷/甲醇 （V/V， 100:0、 50:1、 25:1、 20:1、 15:1、。

8、 5:1、 2:1） 进行洗脱， 分离得到2个组分。 其中的第1组分 （10 g） 经过硅胶H减压柱色谱， 二氯甲烷/甲醇 （V/V， 10:1、 7:1、 5:1、 3:1、 2:1、 1:1） 洗脱， 然后经 过Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化， 甲醇洗脱， 分离得到化合物1 （54 mg） ， 剩下的组分继续 用反相半制备高效液相色谱纯化， 用甲醇-水(0-40min, 40%甲醇-100%甲醇； 40-60min， 100%甲醇， tR=46min)洗脱， 分离得到化合物2 (71 mg)。 其中的第2组分 （5.6 g） 经过硅胶H 减压柱色谱和Sephadex LH-20。

9、凝胶柱色谱分离纯化得到化合物3 （547 mg） 。 化合物1、 化合 物2、 化合物3经鉴定分别为山奈苷、 10-羟基橄榄苦苷、 过山蕨素， 具体结构鉴定数据如下。 0011 化合物1： 黄色针晶 （甲醇） ， 分子量： 578， 分子式： C27H30O14， 1H-NMR (DMSO-d6 , 400MHz) :7.79 (2H, d, J = 8 Hz, H-2 , 6 ), 6.92 (2H, d, J = 8 Hz, H-3 , 5 ), 6.79 (1H, d, J = 4 Hz, H-8), 6.46 (1H, d, J = 4 Hz , H-6), 5.55 (1H, d, 。

10、7-O- Rha, H-1), 5.30 (1H, d, J = 4 Hz, 3-O-Rha, H-1), 1.13 (3H, d, J = 4 Hz, 7-O- Rha, H-6), 0.80 (3H, d, J = 8 Hz, 3-O-Rha, H-6). 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) : 177.97 (C-4), 161.73 (C-7), 160.96 (C-5), 160.26 (C-4 ), 157.84 (C-9), 156.14 (C-2) , 134.56 (C-3) , 130.76 (C-2 , 6 ), 120.38 (C-1 ), 115.4。

11、7 (C-3 , 5 ) , 105.82 (C-10) , 101.90 (7-O-Rha, C-1) , 99.51 (3-O-Rha, C-1) , 98.43 (C-6) , 94.63 (C-8), 71.62 (7-O-Rha, C-4), 71.13 (3-O-Rha, C-4), 70.73 (7-O-Rha, C- 3), 70.34 (3-O-Rha, C-3), 70.26 (7-O-Rha, C-2), 70.11 (3-O-Rha, C-2), 70.11 (7-O-Rha, C-5), 69.85 (3-O-Rha, C-5), 17.97 (7-O-Rha, C-。

12、6), 17.52 (3-O-Rha, C-6)。 以上数据和文献 （陈艳,邓虹珠,梁磊. 细梗胡枝子黄酮类成分的研究J. 南方医科 大学学报,2008,28(05):858-860. ） 中化合物比对， 数据基本一致， 故鉴定化合物1为山奈 苷。 0012 化合物2： 白色固体， 分子量： 556， 分子式： C25H32O14。 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) : 6.64 (1H, d, J = 8 Hz), 6.60 (1H, s), 6.47 (1H, d, J = 8 Hz)为苯环上的质子， 7.53 (1H,s), 6.00 (1H, t)为两个烯氢质子， 4。

13、.66 (1H, d, J = 8Hz)为葡萄糖端基质 子， 3.64 (1H, s, C-11-OCH3)。 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) :170.70 (C-7), 166.15 (C-11), 153.42 (C-3), 145.15 (C-3 ), 143.82 (C-4 ), 129.24 (C-1 ), 128.36 (C- 8), 128.26 (C-9), 119.54 (C-6 ), 116.22 (C-2 ), 115.59 (C-5 ), 107.61 (C-4), 99.14 (Glc-1 ), 92.66 (C-1), 77.42 (Glc-。

14、3 ), 76.63 (Glc-5 ), 73.32 (Glc-2 ), 69.95 (Glc-4 ), 65.16 (C- ), 61.13 (Glc-6 ), 57.28 (C-10), 51.34(C-11-OCH3), 说 明 书 2/5 页 4 CN 107137414 A 4 39.90 (C-6), 33.71(C- ), 30.69 (C-5)。 以上数据与文献 （冯雪松,许磊,高慧媛,吴立 军. 关东丁香化学成分的分离与鉴定J. 沈阳药科大学学报,2009,26(09):697-700） 中 化合物5 比对， 数据基本一致， 故鉴定化合物2 为10-羟基橄榄苦苷。 0013 。

15、化合物3： 黄色粉末 （甲醇） ， 分子量： 594， 分子式： C27H30O15， mp 243246, 1H- NMR (DMSO-d6, 400 MHz) :8.09 (2H, d, J = 8 Hz, H-2 , 6 ), 6.89 (2H, d, J = 8 Hz, H-3 , 5 ), 6.83 (1H, s, H-8),6.44 (1H, d, J = 4 Hz , H-6), 5.55 (1H, s, 3-O-Glu, H-1), 5.49 (1H, d, J = 8 Hz, 7-O-Rha, H-1), 1.12 (3H, d, J = 4 Hz, 7-O-Rha, H-6。

16、). 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) :177.70 (C-4), 161.62 (C-7), 160.92 (C-5), 160.17 (C-4 ), 156.80 (C-9), 156.03 (C-2), 133.51 (C-3), 130.07 (C-2 , 6 ), 120.82 (C-1 ), 115.20 (C-3 , 5 ), 105.71 (C-10), 100.77 (3-O-Glu, C-1), 99.44 (7-O-Rha, C-1), 98.41 (C-6), 94.54 (C-8), 77.62 (3-O-Glu, C-5), 76.45 (3-。

17、O-Glu, C-3), 74.26 (3-O-Glu, C-2), 71.64 (7-O-Rha, C-4), 70.28 (3-O-Glu, C-4), 70.12 (7-O-Rha, C-3), 69.95 (7-O-Rha, C-2), 69.87 (7-O-Rha, C-5), 60.89 (3-O-Glu, C-6), 17.98 (7-O-Rha, C-6)。 以上数据和文献 （袁琳,黄文忠,梁德强,马银 海,杜芝芝. 合柄铁线莲中黄酮苷类化学成分研究J. 中国药学杂志,2015,50(06):497- 501. ） 中化合物3比对， 数据基本一致， 故鉴定化合物3为过山蕨素 （。

18、山萘酚-3-O- -D-吡喃葡 萄糖基-7-O- -L-鼠李糖苷） 。 0014 应用试验1、 过山厥素对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响 仪器材料： 仪器： 制备型高效液相色谱仪 （Waters 2535Q） ； 旋转蒸发仪 （EYELA， 东京理 化器械株式会社） ； LC-3000高效液相制备柱色谱 （北京创新通恒科技有限公司） ； Am-400超 导核磁共振仪 （Bruker） ； 电子天平 （美国Mettler-Toledo公司） ； TGL-16gR高速台式冷冻离 心机 （上海安亭科学仪器厂） ； 双人单面净化工作台 （型号： SW-CJ-2FD型 厂家： 苏州净化设 备有限公司）。

19、 ； 二氧化碳培养箱 （型号： 3111型， 厂家： Thermo scientific） ； 倒置显微镜 （ckx31型， olympus） ； 全温振荡培养箱 （HZP型 上海精宏实验设备有限公司） ； 离心沉淀器 （800型 上海手术器械厂） ； 各种规格移液枪 （transferpette） ； 数码相机 （canon EOS450D） 倒置显微镜 （Nikon ECLiPSE TS100） ； GF 254硅胶薄层板 （烟台汇友硅胶开发有限公司） ； 40 80目硅胶、 200300目硅胶和硅胶H （烟台汇友硅胶开发有限公司） ； Sephadex LH-20 （瑞典 Pharmac。

20、ia公司） ； D101型大孔树脂 （天津海光化工有限公司） ； C-18 （德国Merk公司） ； 其余试 剂均为分析纯； 葡萄糖测定试剂盒 （上海荣盛生物药业有限公司， 20161105147） ； 葡萄糖标 准品 （上海荣盛生物药业有限公司， 批号： 20161001） ； 小鼠游离脂肪酸测定试剂盒 （南京森 贝伽生物科技有限公司， 批号： 201609） ； 胎牛血清 （浙江天航生物科技股份有限公司， 批号： 20160923） ； DMEM高糖培养液 （北京索莱宝科技公司， 批号： F08HV090） ； 青霉素链霉素混合液 （solarbio， 批号： 20161029） ； 胰酶。

21、细胞消化液 （碧云天， 编号： C0210） 二甲基亚砜 （sigma SHBC3313V）； 胰岛素 （sigma ）； 噻唑蓝 （上海华蓝科技有限公司）； 油红O （sigma SLBP5248V） ； 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 （sigma， BCBH1214V） ； 地塞米松 （sigma BCBM4557V） 。 罗格列酮片 （成都恒瑞制药有限公司）； 洛伐他汀胶囊 （扬子江药业集团有限公司， 20160109） ； 细胞株： 3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞购于中科院细胞库。 0015 实验方法： 细胞培养与冻存： 说 明 书 3/5 页 5 CN 107137414 A 5 3T。

22、3-L1前脂肪细胞， 用含15%胎牛血清的DMEM高糖培养液 （青霉素： 10U/mL、 链霉素10 g/mL） 在37、 5% CO2饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养， 2 d换液一次， 当细胞融合至80% 后， 弃培养瓶中培养液， 加入0.25%胰蛋白酶液1mL， 作用1min左右， 加入2倍体积培养液终止 消化， 用吹打管将贴壁细胞吹打入培养液。 将细胞悬液移入无菌离心管， 1000 rpm离心5 min， 弃上清。 细胞传代： 1个培养瓶收集的细胞沉淀用1mL新培养液吹散， 按1： 2比例传代。 细 胞冻存： 2个培养瓶收集的细胞沉淀用1.2 mL冻存液 （含10%DMSO的胎牛血清） 。

23、吹散转入冻存 管放入程序降温盒， 然后放入-80冰箱过夜， 取出冻存管放入液氮罐中保存。 0016 细胞毒活性检测： 收集对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞， 调整细胞悬液浓度， 以每孔2105的密度接种 于96孔培养板， 每孔加入100 L细胞悬液。 将细胞置于37、 5% CO2及饱和湿度的二氧化碳 培养箱中培养24 h， 待细胞融合至60%-70%， 加入浓度梯度的药物， 每个板设正常对照组、 溶 媒对照组 （0.1% DMSO） 、 给药组， 设6个复孔， 继续培养48 h后， 每孔加入10 L MTT溶液 （5 g/L） ， 继续培养4 h。 小心吸去孔内培养液， 每孔加入100 L。

24、 DMSO置震荡培养箱 （100 r/ min） 中震荡10 min， 使结晶物充分溶解。 在酶标仪570 nm波长处测量各孔的吸光度值 （OD 值） 。 0017 表1： 过山厥素对3T3-L1前脂肪细胞细胞毒活性的影响 （n=6） 由表1可知， 正常对照组和溶媒对照组吸光度值相比， 差异没有统计学意义， 说明溶媒 对细胞活力不产生影响。 过山蕨素300 M剂量组吸光度值低于正常对照组， 差异具有统计 学意义 （P0.001） 。 说明过山蕨素在300 M时具有细胞毒性， 不能作为给药剂量。 过山蕨素 100、 33和11 M剂量组与正常对照组相比， 差异没有统计学意义， 说明过山蕨素在10。

25、0、 33和 11 M剂量时均没有细胞毒作用。 即过山蕨素100 M剂量范围以下均可设为给药剂量。 0018 应用试验2、 过山厥素对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响 以3T3-L1前脂肪细胞为细胞模型， 在诱导分化过程中加入过山厥素， 油红O染色鉴定 3T3-L1前脂肪细胞分化程度。 0019 取对数生长期的3T3-L1前脂肪细胞传代培养， 按1.5105的密度接种到96孔板 中， 细胞完全融合后， 接触抑制48 h， 然后更换含分化诱导剂A （0.5 mM IBMX 、 1 M DeX、 10 g/mL Insulin） 的DMEM高糖培养液， 同时加药 （分为空白组， 模型组、 洛伐他汀。

26、组 （50 M） ， 给药组） 。 3 d后换成含诱导分化剂B （含有10 g/mL Insulin） 的DMEM高糖培养液 （含15%的 说 明 书 4/5 页 6 CN 107137414 A 6 胎牛血清） ， 2 d后换常规培养液， 此后隔天换液， 培养至12 d， 小心吸除培养液， 冰冷PBS洗2 次， 晾干， 每孔加入50 L 4%多聚甲醛固定40 min， PBS再洗2遍， 晾干， 加入油红O染色30 min， PBS洗2次， 超纯水洗2次， 倒置显微镜下数码相机拍照 （100） 。 每孔加入100 L异丙 醇， 40 min后使用酶标仪在495 nm波长下测定吸光度。 结果如下。

27、。 0020 数据处理： 结果采用均值SD值表示， 数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分 析法 （One-Way ANOVA） 比较其显著性差异。 0021 表2： 过山厥素对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响 （n=6） 由图1、 表2可知， 与模型组相比， 洛伐他汀组油红染色水平显著降低 （P0.05） ， 说明洛 伐他汀组能够抑制3T3-L1前脂肪细胞分化。 过山蕨素100、 33 M剂量组油红染色水平显著降 低 （P0.01） ， 说明过山蕨素100、 33 M剂量组能够抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化， 说明过山 厥素具有用于预防和改善肥胖症的潜质。 0022 结论： 过山厥素能够抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化， 说明其具有用于预防和改善 肥胖症的潜质。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107137414 A 7 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 107137414 A 8 。