WNT信号通路蛋白FRZB在制备抗肝癌药中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511030974.5 (22)申请日 2015.12.31 A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/04(2006.01) (71)申请人 中国科学院成都生物研究所 地址 610041 四川省成都市武侯区人民南路 四段 9 号 (72)发明人 唐亚雄 裴哲 曾中秋 (74)专利代理机构 成都赛恩斯知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 51212 代理人 高利丹 (54) 发明名称 Wnt 信号通路蛋白 Frzb 在制备抗肝癌药中的 应用 (57) 摘要 本发明涉及一种 Wn。

2、t 信号通路蛋白 Frzb 在 制备抗肝癌药物中的应用， 属于生物医药技术领 域。本发明首先通过蛋白质免疫印记以及免疫组 化技术明确了肝癌病人肝脏组织样本库和肝癌细 胞株中Frzb的表达量相对较低， 发现了Frzb在肝 癌病人肝脏组织中呈现出随病理分级的升高而逐 渐降低的表达特征 ； 通过裸鼠皮下异种移植和尾 静脉肺转移模型， 研究表明 Frzb 显著抑制裸鼠皮 下移植瘤生长与肺转移的形成， 其抑制率分别为 85.4与 68.6 (P0.01)。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 105617359 。

3、A 2016.06.01 CN 105617359 A 1.一种Wnt信号通路蛋白Frzb在制备抗肝癌药中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105617359 A 2 Wnt信号通路蛋白Frzb在制备抗肝癌药中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种Wnt信号通路蛋白的应用， 具体涉及一种Wnt信号通路蛋白Frzb在 制备抗肝癌药物中的应用， 属于生物医药技术领域。 背景技术 0002 肝癌严重威胁人类健康， 目前仍缺乏有效的治疗药物。 肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma， HCC)是我国高发恶性肿瘤， 每年约有13万人死于肝癌， 占全球肝癌死亡人数。

4、的 40。 尽管肝癌的治疗方法包括手术等多种方案， 但治疗效果迄今仍然十分有限， 尚未显著 延长病人的生存期， 而针对VEGFR、 RAF等多靶点的激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib)目前已 成为晚期肝癌病人的首个临床治疗药物， 再次表明针对肿瘤细胞特异信号转导网络调控的 靶向分子具有显著的临床疗效和研究价值。 0003 Wnt信号通路在胚胎发育、 干细胞、 免疫系统以及肿瘤发生等生理病理过程中发挥 重要作用。 作为生物医学领域前沿方向之一的Wnt信号通路与结肠癌、 肝癌、 肺癌、 前列腺 癌、 肾癌、 黑色素瘤等多种人类肿瘤的发生发展密切相关。 研究证实， Wnt信号通路在肝脏发 育、 。

5、肝脏正常生长、 肝细胞再生、 肝脏代谢等生理过程中发挥着重要作用， 该通路异常持续 激活与多种慢性肝病以及肝肿瘤的进展显著相关。 转基因小鼠肝癌模型及人体肝癌细胞组 织学研究已经证实肝癌癌变过程Wnt通路中 -catenin、 APC、 Axin1以及Axin2等基因突变， 而且Wnt与Frizzled受体元件失调可能也是肝癌早期现象之一。 此外， 乙型、 丙型肝炎病毒 与Wnt通路密切关联， 乙肝病毒HBV X蛋白能激活Wnt通路参与肝癌的形成， 丙型肝炎病毒 HCV核心蛋白能刺激肝细胞生长过程至少部分与Wnt-1的介入密切相关， 丙型肝炎病毒致癌 过程中 -catenin突变机会与频率比乙。

6、肝更高。 因此， 抑制或者阻断Wnt信号通路的蛋白拮 抗剂或化学小分子可为肝癌的防治提供新的分子靶向策略。 0004 分泌性的frizzleds相关蛋白(secreted frizzled-related protein,sFrp)是 Wnt信号通路的天然拮抗剂， Frzb(也被称为sFrp3)作为Wnt信号通路中分泌型卷曲相关蛋 白sFRP家族第一个成员于1996年被分离克隆定位于人类染色体2q31-33区域， 但其在肝癌 中的防治功能还从未被报道过。 发明内容 0005 针对Wnt信号通路异常持续激活与多种慢性肝病以及肝肿瘤的发展存在的相关 性， 本发明提出了一种Wnt信号通路蛋白Frzb。

7、在制备抗肝癌药中的应用。 0006 本发明所述的Wnt信号通路蛋白Frzb可直接作为药物使用， 其余辅料为药物学上 可接受的、 对人和动物无毒和惰性的药用载体。 0007 本发明首先通过蛋白质免疫印记以及免疫组化技术明确了肝癌病人肝脏组织样 本库和肝癌细胞株中Frzb的表达量相对较低， 发现了Frzb在肝癌病人肝脏组织中呈现出随 病理分级的升高而逐渐降低的表达特征； 其次， 构建慢病毒重组表达质粒pLVX-Puro-Frzb， 获得Frzb重组慢病毒悬液， 经嘌呤霉素筛选成功获取稳定表达Frzb的肝癌细胞株； 再次， 说 明 书 1/8 页 3 CN 105617359 A 3 MTT实验表明。

8、Frzb不仅以时间依赖性方式降低肝癌细胞的增殖速率， 而且Frzb显著抑制 HepG2细胞迁移及伪足的形成； 最后， 通过裸鼠皮下异种移植和尾静脉肺转移模型， 研究表 明Frzb显著抑制裸鼠皮下移植瘤生长与肺转移的形成， 其抑制率分别为85.4与68.6(P 0.01)。 附图说明 0008 图1为Frzb在肝癌中低表达图； A展示了肝癌细胞系中Frzb蛋白质水平的表达量； B 展示了邻近非肿瘤肝组织中Frzb的表达量明显高于其肝癌组织中的表达量。 0009 图2为过表达Frzb后在体外可明显抑制肝癌细胞的增殖图； A展示了慢病毒转染 Frzb在肝癌细胞系HepG2中过表达后得到的HepG2/。

9、Frzb和HepG2/pLVX， A中示出了HepG2/ Frzb和HepG2/pLVX中Frzb蛋白的表达水平； B示出了MTT实验绘制肝癌细胞的生长曲线。 0010 图3为过表达Frzb可明显抑制肝癌细胞的侵袭运动能力图； A示出了24小时后在 100倍显微镜下观察到的HepG2/Frzb和HepG2/pLVX细胞穿过的数目； B示出了细胞划痕愈合 实验中划痕经过48小时后的愈合情况， C示出了采用罗丹明鬼笔环肽标记肝癌细胞的肌动 蛋白以观察细胞骨架形态。 0011 图4为过表达Frzb在体内可以明显抑制肝癌细胞的增殖和转移图； A示出了HepG2/ Frzb和HepG2/pLVX细胞注射。

10、到裸鼠皮下， 一个月后将裸鼠处死， 所得皮下瘤拍照体积； B示 出了A中HepG2/Frzb和HepG2/pLVX细胞所得到的肿瘤体积对比图； C示出了注射HepG2/Frzb 和HepG2/pLVX细胞后裸鼠所得到的肺组织转移结节形成情况。 具体实施方式 0012 下面结合附图对本发明的实施方式进行详细说明。 0013 实施例一 0014 1、 细胞培养 0015 1.1 细胞复苏 0016 所用肝癌细胞株来自美国菌种保藏中心(ATCC)。 细胞冻存管从液氮中迅速取出， 75酒精消毒后， 迅速置于37恒温水浴箱中， 上下轻轻摇动加速其融化。 在无菌条件下小 心打开冻存管， 将细胞悬液转入预先。

11、加入5mL的完全DMEM培养液的离心管中， 混合后 1000rpm， 离心5min， 弃上清， 加入含10小牛血清DMEM培养液上下吹打数次细胞后接种至 p100培养皿放入置于37、 含5CO2、 饱和湿度培养箱内培养， 次日更换一次培养液。 0017 1.2 细胞传代 0018 当细胞密度达到80-90时， 吸去培养液， 加入3mL含EDTA-0.25胰酶于37培 养箱内消化细胞2min后， 取出， 轻轻拍打细胞培养皿边缘直至细胞完全脱落下来， 再加入 3mL含10新生小牛血清的DMEM培养液终止消化， 用移液管吸去培养液反复吹打贴壁细胞， 使其分散， 转移至离心管， 1000rpm， 离心。

12、5min后弃上清液， 加入含10小牛血清DMEM培养液 上下吹打数次细胞后接种至p100培养皿放入置于37、 含5CO2、 饱和湿度培养箱内培养。 0019 1.3 细胞培养 0020 用添加了10(v/v)小牛/胎牛血清的DMEM高糖培养液， 培养于37无菌细胞培养 箱中， 维持以5CO2、 饱和湿度的空气。 说 明 书 2/8 页 4 CN 105617359 A 4 0021 1.4 细胞计数 0022 将细胞从CO2培养箱中取出， 加入3mL含EDTA的0.25胰酶消化后， 制成单细胞悬 液， 用20 L移液枪吸取少量细胞悬液， 加入细胞计数板， 在倒置显微镜下， 用40物镜观察 计数。

13、板四角16方格中的细胞数， 计算总和。 代入以下公式得细胞密度： 细胞数(个/mL)(总 和/4)104。 0023 1.5 细胞冻存 0024 当细胞长至80汇合度后， 吸去培养基， 以1mL PBS漂洗并吸去， 加入3mL胰酶消化 液， 37消化至细胞开始收缩变圆， 吸干胰酶， 加入2mL细胞冻存液， 悬浮细胞， 使细胞密度 不低于1106， 1mL/管分装于1.8mL冻存管中； 将冻存管于4放置30min， 转至-20放置 60min， 立即置于-80冰箱中短期存放， 隔夜后可以转入液氮中长期保存。 0025 2、 稳定表达细胞株的构建 0026 2.1 表达载体的构建 0027 所采用。

14、的牛源Frzb基因的cDNA核苷酸序列如SEQ NO.1所示， 相关分子生物学实验 技术按常规方法进行， 所构建的重组质粒经测序证实并命名为pLVX-puro-Frzb。 0028 正向引物： 5 -CTAGTCTAGACCGCGGCCCCAGAAGTCTTA-3 0029 反向引物： 5 -CTAGGTTTAAACTTACTTGTCATCGTCGTCCT-3 0030 2.2 重组慢病毒的制备 0031 重组慢病毒表达载体pLVX-puro-CRD-WD在脂质体介导下与包装质粒(pSPAX2)、 包 膜质粒(pMD 2G)共转染293T细胞， 培养48-72小时后收集上清培养液， 经浓缩获得。

15、重组的慢 病毒并测定其滴度， 随后该重组慢病毒用于宿主细胞的感染。 0032 2.3 稳定表达细胞株的构建 0033 将上述制备的重组慢病毒感染肝癌HepG2细胞， 48h后加入浓度为2 g/mL的嘌呤霉 素筛选， 经过两周的持续筛选， 获得阳性克隆细胞， 提取细胞总蛋白， 通过Western blot检 测融合蛋白的表达从而确定Frzb稳定表达的细胞株。 0034 3、 蛋白质免疫印迹 0035 3.1 细胞总蛋白提取 0036 取对数生长期细胞， 0.25的胰蛋白酶消化传代后， 置于培养皿中培养， 将培养皿 置于37， 5CO2细胞培养箱中培养24h。 用预冷1PBS洗涤细胞培养皿二次。 。

16、每个培养皿 加入含有罗氏cocktail蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液300 L， 使细胞裂解液和细胞充分 接触以使裂解完全， 冰上放置10min后， 用干净的细胞刮刀将细胞刮下， 然后用移液器上下 吹打细胞几十次使其裂解充分， 冰浴10min。 用1mL移液枪将样品转移到1.5mL无菌EP离心管 中， 4， 14000rpm离心30min。 用移液器吸取上清液， 小心转移到干净无菌EP离心管中， 做好 标记好后于-80冰箱保存备用。 0037 3.2 Bio-Rad DC Protein Assay检测蛋白浓度 0038 BSA标准蛋白的稀释： 取2mg/mL BSA分别加去离子水稀释， 。

17、使其终浓度依次为 0.0625、 0.125、 0.25、 0.5、 1.0、 2mg/ml； 待检测蛋白样品的稀释： 将待检测的蛋白用双蒸水 稀释10倍； 将DC Protein Assay中的试剂A： S50： 1的比例混匀； 根据样品数量， 向各个孔 内依次加入25 L A： S混合液后， 加入5 L BSA蛋白标准液或待检测浓度的蛋白稀释液， 双蒸 水用做空白对照， 最后加入200L试剂B， 避光室温孵育15min； 用Bio RAD iMarkTM 说 明 书 3/8 页 5 CN 105617359 A 5 microplate reader于750nm处测定各孔OD值， 绘制标准。

18、曲线并计算每个样品蛋白质浓度。 0039 3.3 Western blot 0040 实验前清洗玻璃制胶板、 10孔或15孔梳子以及电泳槽， 风干后备用。 待分离胶配好 混匀后迅速将其灌注于两块玻璃制胶板之间， 灌胶时沿一侧玻板壁灌注， 避免在胶体中产 生气泡， 并留出约2-3cm的灌注浓缩胶所需空间。 灌好胶后， 再吸取少量无菌双蒸水缓慢覆 盖于分离胶上， 以隔绝空气并压缩分离胶上缘使其水平； 待分离胶完全聚合后， 倒去上层双 蒸水。 浓缩胶配置完成后迅速灌注与已聚合的分离胶上， 灌满后立即缓慢插入已洗干净的 梳子， 约半小时后， 待凝胶完全聚合后备用。 将配置好的胶板放入电泳槽后， 加入1。

19、 Running Buffer至浸没胶板， 轻轻拔出梳子， 用移液器加样， 依次加入蛋白Marker 5 L或蛋 白样品80-100 g/每孔。 浓缩胶所加电压为恒压75V， 蛋白样品压平为一条线时， 将电压改为 100V。 分离胶所需电压为100V恒压， 直至溴酚蓝到达分离胶底部后， 电泳结束。 小心将凝胶 从玻璃板中取出， 根据蛋白Marker中的位置做好标记。 将滤纸、 7.58cm NC膜、 海绵浸泡于 1Transfer Buffer缓冲液中5min； 打开夹板， 黑色负极朝下， 依次放上海绵， 滤纸3张， 凝 胶、 NC膜， 再依次放置滤纸3张、 海绵， 注意不要在滤纸、 凝胶及膜。

20、之间形成气泡， 合上夹板形 成三明治结构后安装于电泳槽中； 黑色对着负极， 红色对着正极， 接通电源， 调电压至100V 恒压转膜60-90min(转膜时间视蛋白质分子量大小而定)。 转膜完成后， 取下NC膜， 用1 TBST液轻轻荡洗一次， 将膜放入5脱脂牛奶(1TBST配制)中封闭1h。 将一抗按说明比例 用5BSA稀释至2mL后， 将已稀释好的一抗液用移液枪转入塑料膜内， 然后将NC膜小心放 入， 使一抗稀释液体浸没NC膜， 用手指将气泡排除后， 然后用封口机高温压塑封膜， 4孵育 过夜。 一抗孵育结束后， 取出NC膜， 以适量TBST摇动洗涤3次， 每次10min。 用5脱脂牛奶将 合。

21、适来源的辣根过氧化物酶标记的二抗以1:5000比例稀释， 室温孵育1h。 洗膜， 二抗孵育结 束后， 取出NC膜， 以适量TBST摇动洗涤3次， 每次10min。 将NC膜在滤纸上适当沥干， 结合有蛋 白的一面朝上平铺。 根据NC膜的大小， 将适量ECL试剂A液、 B液等体积混匀， 滴加在NC膜上， 使液体覆盖到整张膜。 反应5min后， 将整张膜提起， 边缘接触滤纸， 将ECL反应液沥干， 夹在 两层干净的保鲜膜中放入暗盒， 并用胶带固定。 在暗室中进行X光片曝光根据膜上荧光信号 强度灵活掌握曝光时间。 X光片曝光后依次进行定影和显影， 再用自来水冲洗干净， 对目标 条带进行标记， 扫描仪扫。

22、描条带， Photoshop处理获得的图像数据。 0041 4、 MTT法测定细胞生长率 0042 取对数生长期细胞接种于24孔培养板内， 每孔2104个细胞， 3个复孔， 24h后， 每 孔加入1mg/mL MTT工作液500 L， 37孵育3h， 弃上清， 每孔加入0.4酸化异丙醇的500 L， 200rpm摇床震荡5min溶解结晶； 吸取200 L至96孔酶标板于全自动酶标仪检测570nm波长处 的各孔吸光度(OD值)。 0043 计算公式： 增殖抑制率()(1-实验孔A值/对照组A值)100 0044 生长活力()实验孔A值/对照组A值100。 0045 5、 Wound-Healin。

23、g分析 0046 将空的6孔板倒置横向放置， 沿着培养孔的中线画一条垂直的线， 然后再横向画4- 6条水平的直线， 与中间的垂线垂直相交。 细胞消化后离心， 用培养基重悬， 按照每孔1106 个细胞的密度接种到6孔板中， 小心摇晃使细胞均匀分布。 第二天， 用20 L的枪头在孔内的 细胞层上划一条与垂线平行的伤口， 使其边缘平直清晰。 划线用的枪头一定要选择形状规 说 明 书 4/8 页 6 CN 105617359 A 6 则， 边缘整齐的产品。 不同的孔， 尽量使用相同的力度， 使划出的伤口宽度大致相同。 去除培 养基， 用无菌的PBS漂洗细胞3次， 以去除脱落的细胞和细胞碎片。 细胞的增。

24、殖也会促进伤口 愈合速度， 为了降低细胞增殖速度， 使用含2FBS的DMEM培养基培养细胞。 选择0、 12、 24、 48h三个时间点进行拍照记录。 不同的拍照时间点， 应该根据画在培养皿底部的坐标进行定 位， 对同一个区域进行拍照。 0047 6、 Transwell细胞迁移分析 0048 使用无血清的培养基重悬细胞， 取2104个细胞， 用培养基将体积补充到400 L。 在24孔板中加入500 L完全培养基， 把transwell小室平放到孔中。 将细胞混匀加入到 transwell小室内部， 轻微晃动使其分布均匀， 放入培养箱中培养24h。 在一个新的孔中加入 500 L甲醇， 将tr。

25、answell小室从原孔中取出， 吸去上清之后放到装有甲醇的孔中， 然后在 transwell小室内再加入200 L以上的甲醇， 固定20-30min。 在另一个新的孔中加入500 L结 晶紫染色液， 将transwell小室从原来的孔中取出， 吸去甲醇之后放到有结晶紫染色液的孔 中， 然后在transwell小室内再加入200 L以上的结晶紫染色液， 染色30-60min。 在另一个新 的孔中加入500 L PBS， 将transwell小室从原来的孔中取出， 吸去染色液之后放入孔中， 然 后在transwell小室内再加入400 L PBS， 用镊子轻轻晃动进行洗涤， 此步骤重复三次。 将。

26、 transwell小室中的PBS去掉， 用医用棉签在内部轻轻将细胞层刮干净。 在另一个新的孔中 加入500 L PBS， 将清理之后的transwell小室放入孔内， 在transwell小室内部再加入200 L PBS。 用倒置显微镜对transwell小室进行拍照， 每个transwell小室随机选择三个视野各 自拍一张照片， 将拍得的照片用photoshop软件中的计数功能对照片中的细胞数量进行计 数。 进行2-3次独立实验， 然后对实验结果进行统计学分析。 0049 7、 免疫荧光染色 0050 将DMEM完全培养基倒掉， 1PBS洗三次。 在生长培养液中加入5BSA， 4多聚甲 醛。

27、， pH7.2-7.3， 细胞在4加入该固定液固定10min。 细胞加入0.1Triton X-100的1PBS 洗五次， 每次5min。 用含5BSA和0.1Triton X-100的PBS按照1:100的比例稀释FITC- phalloidin。 把配置好的染色工作液滴加到细胞上， 室温避光孵育60min。 1PBS洗五次， 每 次5min。 1PBS洗三次， 每次5min， 加入抗淬灭溶液后滴加DAPI， 加盖玻片后指甲油封片保 存。 激光共聚焦显微镜观察结果。 0051 8、 裸鼠体内实验 0052 8.1 制备细胞 0053 将细胞接种到p100培养皿中。 当细胞在培养皿中汇合度达到。

28、80-90时， 0.25 胰酶消化细胞， 加入含10FBS的DMEM培养基终止消化。 部分细胞用于Western blot检测蛋 白量， 收集剩余大部分细胞， 1500rpm离心5min， 弃上清。 用无FBS的DMEM培养基重悬细胞， 1500rpm离心5min， 弃上清。 用已灭菌的1PBS以同样方式清洗细胞三次， 洗掉残留的血清 和抗生素。 收集细胞， 用1PBS制备细胞悬液。 血球计数板计数。 将细胞浓度调整为5 107cells/mL。 0054 8.2 皮下异种移植模型 0055 选取雌性BALB/C裸鼠， 待其生长到6周进行肿瘤生成实验。 实验分为两组， 每组十 只。 取1mL注。

29、射器(褐色针头， 0.4516RW LB)在无菌条件下吸取制备好的细胞悬液(5 107cells/mL)， 每只裸鼠右颈部注射100 L细胞悬液(5106cells/mouse)。 标记每只裸鼠， 说 明 书 5/8 页 7 CN 105617359 A 7 在无菌条件下饲养。 每隔两天测量裸鼠肿瘤长轴及短轴的长度， 根据公式V0.5236L1 L22(L1为肿瘤长轴， L2为肿瘤短轴)计算肿瘤体积。 30天后安乐处死裸鼠， 剥离肿瘤， 称取肿 瘤重量。 肿瘤经PBS清洗后， 4甲醛固定过夜， 石蜡包埋， 切片和制备可以供显微镜观察的 载玻片。 组织切片进行苏木精伊红(H&E)染色和免疫组化。。

30、 0056 8.3 肿瘤肺部转移模型 0057 通过尾静脉注射建立肿瘤肺部转移模型。 选取雌性BALB/C裸鼠， 置于SPF级动物房 中饲养到6周龄。 取1mL注射器(0.33mm12.7mm)在无菌条件下吸取制备好的细胞悬液(5 107cells/mL)， 每只裸鼠尾静脉注射100 L细胞悬液(5106cells/mouse)。 标记每只裸鼠， 在无菌条件下饲养。 每隔两天观察一次裸鼠， 30天后将其安乐处死。 取裸鼠肝脏、 脾脏及肺， 肺经Bouin s solution固定过夜， 检查转移性结节拍照并计数。 肺经PBS清洗后， 4甲醛固 定过夜， 石蜡包埋， 切片和制备可以供显微镜观察的。

31、载玻片。 进行苏木精伊红(H&E)染色。 0058 9、 His-Frzb重组蛋白的表达、 纯化及抗肿瘤应用 0059 首先， 通过上述的分子生物学手段将Frzb亚克隆到原核表达载体pET28a上并转化 至大肠杆菌BL21(DE3)中， 当转化子生长至OD600值为0.5时， 加入终浓度为0.4mM的IPTG于 16条件下诱导目的蛋白Frzb的表达， 4,2000g离心15min收集细胞， 采用冰浴裂解缓 冲液(1PBS,300mmol/L NaCl,pH 7.4)重悬细胞， 经超声裂解后于4,10000g离心 30min收集上清可溶部分。 其次， 采用固定化金属亲和层析(IMAC)方法纯化F。

32、rzb重组蛋白。 取1mL镍-NTA琼脂糖凝胶FF预装柱， 用10mL平衡缓冲液平衡， 破碎上清10mL样品以0.5mL/ min上样， 2mL/管分管收集， 用含500mM咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白， 随后目的蛋白通过 Sephadex G15凝胶层析去除咪唑， 并将缓冲体系更换为20mM Tris-HCl， pH8.0。 最后， 将获 得的重组蛋白应用于小鼠抗肿瘤作用。 通过人肝癌细胞HepG2皮下注射4-6周龄的雌性裸鼠 构建移植瘤模型， 具体为每只裸鼠皮下接种5106个HepG2细胞， 7天后， 待肿瘤长至直径6- 7mm时， 将裸鼠随机分为三组， 分别为对照组(PBS阴性对照)， 小剂。

33、量组(5mg/kg)， 大剂量组 (20mg/kg)， 然后将纯化后的融合蛋白通过皮下注射的方式处理分组后的裸鼠， 间隔一天给 药， 给药10次， 每天监测肿瘤的生长情况， 待对照组的肿瘤体积达到2000mm3时， 将所有老鼠 处死， 解剖， 测定肿瘤体积和重量。 最终实验结果显示， 与对照组相比， 高低剂量组移植瘤的 生长均受到明显抑制， 其抑制率分别为83和62， 在实验治疗期间， 动物体重有所增加， 一般状况良好， 表明动物可耐受所给剂量。 因此， 重组蛋白Frzb可以明显抑制并杀伤肝癌细 胞。 0060 实施例二 0061 实施例一中关于Frzb蛋白的结果具体如下： 0062 1、 F。

34、rzb蛋白在肝癌细胞和肝癌组织中呈显著的低表达特征分别选取多种肝癌细 胞株， 提取蛋白， 通过蛋白质免疫印迹检测Frzb在这些细胞株中的表达情况， 参见图1A所 示， 发现在肝癌细胞株中Frzb呈显著的低表达特征。 然后， 为了进一步确定Frzb与肝癌病人 病理特征之间的关系， 从肝癌病人组织库样本中选取新鲜的肝癌病人组织及邻近非肝癌组 织， 利用免疫组化法检测Frzb在肝癌组织和邻近非肝癌组织之间的差异， 结果如图1B所示， 与邻近非肝癌组织相比， Frzb在肝癌组织中明显下调， 呈现出随病理分级的升高而逐渐降 低的表达特征。 上述结果表明， Frzb的表达水平与肝癌发生发展密切相关。 00。

35、63 2、 Frzb在体外显著降低肝癌细胞的生长及运动迁移能力 说 明 书 6/8 页 8 CN 105617359 A 8 0064 为了体内外研究Frzb在肝癌细胞中的抗癌活性。 首先分子克隆并构建pLVX-Frzb- puro慢病毒及相应的对照病毒。 然后将获得的重组慢病毒感染HepG2细胞， 并经嘌呤霉素 puromycin进行筛选， 从而获得能够在肝癌细胞中稳定表达Frzb的细胞株， 如图2A所示， 在 HepG2/Frzb细胞株明显检测到Frzb的超量表达(Flag标签)。 随后开展了一系列实验以确证 Frzb在肝癌细胞中的抑制作用。 细胞生长MTT实验表明， HepG2/Frzb。

36、的细胞生长速率明显低 于HepG2/pLVX对照的生长速率(图2B)。 表明Frzb能显著抑制肝癌细胞的增殖能力。 与此同 时， Transwell侵袭小室实验表明HepG2/Frzb的细胞侵袭能力明显低于HepG2/pLVX对照细 胞， 结果如图3A所示， 24小时后HepG2/Frzb细胞穿过小室的数目明显少于HepG2/pLVX对照 细胞， 而图3B中细胞划痕愈合实验则显示HepG2/Frzb细胞的愈合能力明显降低； 此外， 通过 罗丹明鬼笔环肽标记细胞的肌动蛋白的实验表明， 在400倍荧光显微镜下看到Frzb显著抑 制细胞伪足的形成(图3C)。 以上诸多结果表明Frzb显著降低肝癌细胞。

37、生长及运动侵袭能 力。 0065 3、 Frzb在小鼠动物体内显著抑制肿瘤的形成与肺转移 0066 为了进一步研究Frzb在体内的抗癌活性， 构建裸鼠肿瘤皮下异种移植模型与尾静 脉注射肿瘤肺部转移模型。 动物体内实验结果如图4A所示， HepG2/pLVX对照细胞形成的肿 瘤体积显著高于HepG2/Frzb细胞所形成的皮下瘤体积， 体内肿瘤生长曲线清晰地表明Frzb 在体内能显著抑制肝癌细胞的成瘤性(图4B)。 与此同时， HepG2/pLVX对照细胞荷瘤小鼠的 肺组织转移性结节数明显多于HepG2/Frzb细胞转移结节数， 表明Frzb在体内能抑制肝癌细 胞的侵袭转移能力。 统计学数据表明， Frzb显著抑制裸鼠皮下移植瘤生长与肺转移的形成， 其抑制率分别为85.4与68.6(P0.01)。 说 明 书 7/8 页 9 CN 105617359 A 9 0067 说 明 书 8/8 页 10 CN 105617359 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 11 CN 105617359 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 12 CN 105617359 A 12 。