技术领域
本发明属于分子免疫学和生物医药技术领域；更具体地，本发明涉及一种 细胞自身表达的能够调节固有免疫信号通路的蛋白质分子或其调节剂在抗病 毒方面的新用途。
背景技术
病毒感染一直是威胁人类健康的重大病原体，不仅能够引发艾滋病、禽流 感、肝炎等传染性疾患，还能够导致细胞变异，诱使癌变。目前已经临床使用 的药物中，抑制细菌的特效抗生素种类较多，但抑制病毒的特效药物很少。这 很大程度上是因为病毒结构简单，没有复杂的细胞器，通常使用宿主细胞的基 因转录、蛋白质翻译系统完成自身的生命周期。
在长期的对抗过程中，病毒与宿主之间产生了协同进化，宿主细胞(特别是 哺乳动物细胞)获得了固有免疫系统，这一系统是宿主对抗病毒感染的第一道重 要防线。所谓固有免疫系统，是相对获得性免疫系统(Adapt Immune System)而 言。在细胞的外膜、胞浆内、内膜等部位分布着大量的受体(Pathogen Recognition Receptor；简称PRR)，例如Toll分子样受体(Toll-Like Receptor； 简称为TLR)，RIG-I，Mda-5等。与此对应，病毒的核酸以及蛋白分子上都有 一些能够被受体识别的固有分子模式(Pathogen Associated Molecular Pattern； 简称PAMP)。细胞的PRR识别病毒的PAMP以后，感应到病毒的入侵，激活 下游信号转导通路，诱导产生干扰素、白介素等细胞因子以及其它一些效应分 子，建立抗病毒状态，最终清除病毒或者自我凋亡，从而达到对抗病毒的目的。 从识别病原体感染把入侵信号向下游传递，到激活效应基因的转录产生清除病 原体的效果，再到通过一系列的调控与反馈使细胞回复到正常状态，参与这一 个过程的细胞组分都属于固有免疫系统。
病毒有多种逃避宿主清除的方法，其中很重要的一种就是直接干扰宿主的 固有免疫反应信号通路。通过模拟、拮抗、修饰、降解等多种策略对信号通路 中的重要调控节点进行作用，阻断固有免疫反应的正常运行。例如，丙肝病毒 (HCV)编码一种蛋白酶，可以降解固有免疫信号通路一个关键节点蛋白 MAVS，造成病毒入侵信号不能向下游传递，也就不能激活干扰素-β (Interferon-β)的表达；高致病性甲型流感依赖自身编码的NS 1蛋白抑制宿主细 胞对病毒入侵的识别并同时干扰多个下游效应分子的关键性功能阻止细胞产 生抗病毒反应。
近年病毒学以及分子免疫学的快速发展显示：可以通过人为干预固有免疫 信号通路的方法，达到对抗病毒的目的，例如基因重组的干扰素药物已经广泛 用作高效抗病毒药物，用于对抗乙肝病毒等感染。但外源注射的重组蛋白药物 和自身的同源蛋白在序列上，翻译后修饰上仍然有一些差异，长期使用可能产 生针对药物的免疫反应，引发药效下降、过敏等。
机体的固有免疫调控通常有严格的时序性以及强度性，是一种灵敏而精细 的调控，因此如何充分利用固有免疫反应信号通路自身的一些关键分子来调控 抗病毒反应，是未来生物医药开发的方向。因此，本领域需要基于干预固有免 疫信号通路筛选抗病毒药物的新途径、新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种类泛素修饰蛋白在抗病毒方面的新用途。
在本发明的第一方面，提供一种泛素连接酶HERC5或其促进剂或抑制剂 的用途，用于制备调节固有免疫反应信号转导通路(Innate Immunity Signal Transduction Pathway)的组合物。
在一个优选例中，所述的固有免疫反应信号转导通路包括：干扰素调节因 子3(IRF3)介导的信号转导通路。
在另一优选例中，所述的泛素连接酶HERC5或其促进剂用于制备促进固 有免疫反应信号转导通路的激活的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制病毒；较佳地，抑制病毒在宿 主细胞内复制和/或扩增。
在另一优选例中，所述的泛素连接酶HERC5包括：
(a)如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)将(a)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳的 1-10个，更佳的1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a) 所限定的蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)(a)限定的蛋白的保守性变异蛋白质或其活性片段。
较佳地，所述的泛素连接酶HERC5具有SEQ ID NO：2中第681-1024位 氨基酸序列(具有催化类泛素化分子(ISG15)修饰能力的完整HECT结构域)。
较佳地，所述的泛素连接酶HERC5或其衍生蛋白在对应于SEQ ID NO：2 中第994位的位置上是半胱氨酸(Cys)。
在另一优选例中，所述的组合物还用于提高干扰素β的表达。
在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制干扰素调节因子3的泛素化降 解(通过与干扰素调节因子3(IRF3)相互作用)。
在另一优选例中，所述的泛素连接酶HERC5的抑制剂用于制备抑制干扰 素调节因子3介导的信号转导通路的激活的组合物。
在另一优选例中，所述的泛素连接酶HERC5的抑制剂是特异性干扰泛素 连接酶HERC5基因表达(沉默泛素连接酶HERC5的mRNA)的干扰分子。
在另一优选例中，所述的干扰分子具有SEQ ID NO：3所示的序列。
在另一优选例中，所述的泛素连接酶HERC5的促进剂是一重组表达载体， 所述表达载体中含有编码泛素连接酶HERC5的基因。较佳的，所述编码泛素 连接酶HERC5的基因具有SEQ ID NO：1所示的序列。
在另一优选例中，所述的泛素连接酶HERC5的促进剂是假病毒或仙台病 毒，其在刺激细胞后促进细胞表达泛素连接酶HERC5。
在另一优选例中，所述的组合物还用于促进干扰素调节因子3的泛素化降 解。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节固有免疫反应信号转导通路的潜 在物质的方法，所述的方法包括：
(1)将候选物质与表达泛素连接酶HERC5的体系接触；
(2)检测候选物质对泛素连接酶HERC5的影响；
若所述候选物质提高泛素连接酶HERC5的表达或活性，则表明该候选物 质是促进固有免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质；
若所述候选物质抑制泛素连接酶HERC5的表达或活性，则表明该候选物 质是抑制固有免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达泛素 连接酶HERC5的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中泛素连接酶HERC5的表达或活性，并 与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达泛素连接酶 HERC5的体系；
如果测试组中泛素连接酶HERC5的表达或活性在统计学上高于(优选显 著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就 表明该候选物质是促进固有免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质；
如果测试组中泛素连接酶HERC5的表达或活性在统计学上低于(优选显 著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就 表明该候选物质是抑制固有免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述体系中还表达干扰素调节因子3，且所 述的泛素连接酶HERC5与干扰素调节因子3相互作用(相互结合)；以及
步骤(2)包括：检测候选物质对泛素连接酶HERC5与干扰素调节因子3 相互作用的影响；
若所述候选物质促进泛素连接酶HERC5与干扰素调节因子3相互作用， 则表明该候选物质是促进固有免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质；
若所述候选物质抑制泛素连接酶HERC5与干扰素调节因子3相互作用， 则表明该候选物质是抑制固有免疫反应信号转导通路的激活的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达泛 素连接酶HERC5和干扰素调节因子3的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中泛素连接酶HERC5与干扰素调节因子 3的相互作用，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的 表达泛素连接酶HERC5和干扰素调节因子3的体系；
如果测试组中泛素连接酶HERC5与干扰素调节因子3的相互作用在统计 学上强于(优选显著强于，如强20％以上，较佳的强50％以上；更佳的强80％ 以上)对照组，就表明该候选物质是促进固有免疫反应信号转导通路的激活的 潜在物质；如果测试组中泛素连接酶HERC5与干扰素调节因子3的相互作用 在统计学上弱于(优选显著弱于，如弱20％以上，较佳的弱50％以上；更佳的 弱80％以上)对照组，就表明该候选物质是抑制固有免疫反应信号转导通路的 激活的潜在物质。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、 组织体系、器官体系或动物体系。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
附图说明
图1.人HERC5蛋白质的cDNA编码序列(SEQ ID NO：1)。来源于人细胞 总mRNA反转录后得到的目标序列测序结果。其中，蛋白编码区位于第 154-3228位。
图2.人HERC5基因的SiRNA序列(SiRNA-HERC5，SEQ ID NO：3)。
图3.人HERC5基因编码的蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。为所获得的cDNA 序列按照真核细胞使用的密码子进行翻译的序列。
图4.HERC5影响IRF3信号通路的报告基因试验柱形图。
INFβ-luc(序列及方法参考Yang et al.J Immunol.182(6)：3782-92)为干扰素 -β的特异性报告基因质粒，它上面有多个转录因子的结合位点，其中主要有 IRF3、AP1以及NF-κB的结合位点；PRDIII-I-luc(序列及方法参考Yang et al.J Immunol.182(6)：3782-92)为IRF3转录因子的特异性报告基因质粒；κB-luc(序列 及方法参考Yang et al.J Immunol.182(6)：3782-92)为NF-κB的特异性报告基因 质粒；本图显示：HERC5通过影响IRF3信号通路而影响到下游的干扰素-β的 表达，而不是NF-κB信号通路。
图5.HERC5对IRF3泛素化降解的影响。
使用SiRNA-HERC5序列以及它的负对照SiRNA-NC(序列是 5’-UUCUCCGAAGGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO：8))分别处理被仙台病毒(SeV) 感染的细胞，结果SiRNA-HERC5能够降低细胞内源的HERC5的表达水平， 但是SiRNA-NC却不能；同时HERC5的表达水平的降低造成了IRF3被泛素化 的程度增高，降解加速。
图6.HERC5对细胞抗病毒能力的促进作用。
在293T细胞中分别转染质粒以及SiRNA序列调节细胞内的HERC5的表 达量，培养一段时间以后，再使用NDV病毒感染细胞，再培养一段时间让病 毒扩增。使用荧光显微镜观察空斑的形成，空斑多代表病毒浓度高。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，首次揭示HERC5蛋白是一种对于调节固有免 疫反应信号转导通路有用的物质。其通过与干扰素调节因子3(IRF3)相互作 用，催化ISG15修饰IRF3的多个残基位点(包括Lys193，Lys360，Lys366)， 抑制IRF3的泛素化，促进细胞分泌干扰素，再进一步通过干扰素下游通路固 有免疫的直接效应分子(包括PKR，OAS，RNase L等)。因此，HERC5蛋白及 其促进剂是对于抑制病毒(特别是高致病性甲型流感等新发病毒)有效的物质； 同时，HERC5蛋白本身或HERC5蛋白与IRF3蛋白的相互作用可以作为筛选 抑制病原体药物的靶点。
如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主 要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由...... 构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或 “包括”的下位概念。
如本文所用，所述的“病毒”包括在病毒学专业领域中，被列入DNA病 毒、RNA病毒和逆转录病毒所属的各种病毒，只要所述病毒在侵入后能够被机 体的固有免疫反应信号转导通路(如：IRF3介导的信号转导通路)的激活所抑制。 所述的病毒还包括所有能够被干扰素(特别是干扰素β)抑制的病毒。例如， 所述的病毒选自：仙台病毒，NDV病毒等。
HERC5蛋白及其用途
HERC5蛋白是HECT蛋白家族的成员之一。HERC5家族在哺乳动物细胞 中已经有多个同源物，例如HERC3、HERC4、HERC6等。HERC家族拥有一 个HECT结构域，能够催化细胞内的一些蛋白分子发生泛素化(Ubquitination)， 因此被称为泛素连接酶(E3 ligase)，在细胞的生理过程中扮演各种各样不同的角 色，目前还没有关于HERC5在抗病毒作用方面的直接报道。本发明人第一次 证实了HERC5参与了IRF3介导的信号转导通路，并且是一个可抑制病毒扩增 的蛋白。它通过和IRF3相互作用，催化IRF3发生类泛素化修饰，影响脯氨酸 顺反异构酶Pin蛋白对磷酸化激活的IRF3进行构象改变，减慢IRF3的泛素化 降解，维持IRF3信号通路的持续激活，促进细胞分泌干扰素。因此，HERC5 是抗病毒药物设计的新靶点。
HERC5蛋白在兽亚纲哺乳动物中是较为保守的，不同哺乳动物中其氨基酸 序列的同源性很高；并且，存在相同且高度保守的结构域，在蛋白高级结构上 非常接近，因此本发明所述的HERC5蛋白是来源于哺乳动物(如人、鼠、猴、 羊、牛等)的任何一种HERC5蛋白。
在本发明中，所用的HERC5蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或 纯化自哺乳动物。此外，所述的HERC5蛋白也可以是人工制备的，比如可以 根据常规的基因工程重组技术来生产重组HERC5蛋白。任何适合的HERC5蛋 白均可用于本发明。所述HERC5蛋白包括全长的HERC5蛋白或其生物活性片 段。优选的，所述HERC5蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2所示的序列 基本上相同，其编码序列例如可以与SEQ ID NO：1所示的序列基本上相同。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的HERC5蛋白的 氨基酸序列也包括在本发明中。HERC5蛋白或其生物活性片段包括一部分保守 氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分 的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施 并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来 说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见 Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
任何一种HERC5蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里， HERC5蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的 HERC5蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持 50％的全长HERC5蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全 长HERC5蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
较佳地，所述的HERC5蛋白的生物活性片段具有SEQ ID NO：2中第 681-1024位氨基酸序列，该序列包含有催化类泛素化分子(ISG15)修饰能力的完 整HECT结构域。较佳地，所述的HERC5蛋白中相对于SEQ ID NO：2中第994 位的位置是半胱氨酸(Cys)。
本发明也可采用经修饰或改良的HERC5蛋白，比如，可采用为了促进其 半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的HERC5蛋白。所 述经过修饰或改良的HERC5蛋白可以是与天然存在的HERC5蛋白具有较小的 共同点，但也能调节哺乳动物的固有免疫反应信号转导通路，且不会带来其它 不良影响或毒性。也就是说，任何不影响HERC5蛋白的生物活性的变化形式 都可用于本发明中。
基于本发明人的新发现，本发明提供了HERC5蛋白的用途，用于制备调 节固有免疫反应信号转导通路的组合物；或用于筛选调节固有免疫反应信号转 导通路的物质。例如，所述的HERC5用于促进固有免疫反应信号转导通路的 激活，与IRF3相互作用，减缓IRF3的泛素化，促进IRF3信号转导通路的激 活，促进细胞分泌干扰素。所述的HERC5蛋白通过调控细胞对外界病原体感 染的应激反应强度，达到抗感染，特别是抗病毒感染的目的。
干扰素调节因子3
干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor 3；简称IRF3)是固有免疫 反应信号转导通路中关键性的节点分子。它是一个转录因子，负责一系列下游 效应靶基因的激活，因此发生在IRF3上的微小变化，会造成下游效应的巨大 变化。细胞进化出多种调控IRF3转录激活活性的手段。静息状态下，IRF3呈 自抑制状态，主要分布在胞质中。在病毒感染激活上游信号通路以后，IRF3的 多个残基位置发生磷酸化，分子构象发生改变并转变成二聚体，进入细胞核内 结合到DNA上，启动基因的转录。完成使命以后，又会很快地被一个叫做Pin1 的脯氨酸异构酶改变构象，再被一个尚未鉴定的泛素连接酶(E3)泛素化，转 运到蛋白酶体中降解。
作为本发明的优选方式，所述的IRF3蛋白的氨基酸序列可以与GenBank 登录号NP_001562.1所示(或SEQ ID NO：7所示)的序列基本上相同，其核苷酸 序列可以与GenBank登录号NM_001571.4所示的序列基本上相同。此外，可 与HERC5蛋白发生相互作用的IRF3蛋白的生物活性片段或衍生蛋白也可用于 本发明。
HERC5的促进剂或抑制剂及其用途
如本文所用，所述的HERC5的促进剂包括了上调剂、激活剂、激动剂等。 任何可提高HERC5蛋白的活性、维持HERC5蛋白的稳定性、促进HERC5蛋 白的表达、延长HERC5蛋白有效作用时间、或促进HERC5基因的转录和翻译 的物质均可用于本发明，作为可用于促进固有免疫反应信号转导通路的激活的 有效物质。
如本文所用，所述的HERC5的抑制剂包括了下调剂、阻滞剂、阻断剂、 拮抗剂等。任何可降低HERC5蛋白的活性、降低HERC5蛋白的稳定性、抑制 HERC5蛋白的表达、减少HERC5蛋白有效作用时间、或抑制HERC5基因的 转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于抑制固有免疫反应信号转导通 路的激活的有效物质。
作为本发明的优选方式，所述的HERC5的促进剂例如是一表达载体，所 述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码HERC5的基因及与之操作 性相连的表达调控序列。所述表达载体在转入细胞后表达(或过表达)HERC5 蛋白。更优选地，所述的表达载体是pCMV-HERC5载体。
作为本发明的优选方式，所述的HERC5的抑制剂是(但不限于)：特异性抗 HERC5的抗体，所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，只要其对于 HERC5具有特异性结合能力，且能够通过与HERC5的结合而抑制HERC5的 活性；或特异性抑制HERC5编码基因的转录或翻译的干扰分子或反义核苷酸。 针对已知蛋白或已知基因的干扰分子或反义核苷酸的制备方法是本领域人员 熟知的。更优选地，所述的干扰分子是小干扰RNA，具有SEQ ID NO：3所示 的序列；或其它天然以及化学合成的小分子，具有抑制HERC5的类泛素化催 化功能。
本发明还提供了HERC5蛋白的促进剂的用途。所述的HERC5的促进剂用 于制备调节固有免疫反应信号转导通路的组合物。例如，所述的HERC5的促 进剂通过促进HERC5的表达或活性，促进固有免疫反应信号转导通路的激活， 减缓IRF3的泛素化，促进IRF3信号转导通路的激活，促进细胞分泌干扰素， 进而发挥抑制病毒的作用。
本发明还提供了HERC5蛋白的抑制剂的用途。所述的HERC5的抑制剂用 于制备调节固有免疫反应信号转导通路的组合物。例如，所述的HERC5的抑 制剂通过抑制HERC5的表达或活性，抑制固有免疫反应信号转导通路的激活， 促进IRF3的泛素化，抑制IRF3信号转导通路的激活。
筛选调节固有免疫反应信号转导通路的潜在物质
在得知了所述的HERC5蛋白对于调节固有免疫反应信号转导通路的用途 后，可以基于该特征来筛选通过调节HERC5的活性或表达调节固有免疫反应 信号转导通路的物质。
因此，本发明提供一种筛选可用于调节固有免疫反应信号转导通路的潜在 物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达HERC5蛋白的体系接触； 和检测候选物质对HERC5蛋白的影响；若所述候选物质可提高HERC5蛋白的 表达或活性，则表明该候选物质是可用于促进固有免疫反应信号转导通路的潜 在物质；若所述候选物质可降低HERC5的表达或活性，则表明该候选物质是 可用于抑制固有免疫反应信号转导通路的潜在物质。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到HERC5蛋白 的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选 物质的表达HERC5的体系。
本发明还提供一种调节固有免疫反应信号转导通路相关的复合体，所述的 复合体含有HERC5蛋白和IRF3蛋白，两种蛋白相互结合。本发明人通过免疫 共沉淀技术证明，HERC5蛋白和IRF3蛋白能够相互结合，形成复合体。本发 明人的发现提示HERC5通过与IRF3的相互作用，调节IRF3相关的信号转导 通路。可利用所述的复合体筛选调节HERC5与IRF3相互作用的物质，该物质 通过影响HERC5与IRF3相互作用调节IRF3相关的信号转导通路。
基于以上新发现，本发明还提供了一种筛选调节固有免疫反应信号转导通 路的潜在物质的方法，所述方法包括：向HERC5蛋白和IRF3蛋白相互作用(相 互结合)的反应体系中添加待筛选的候选物质，并检测HERC5蛋白和IRF3蛋 白相互作用情况；如果HERC5蛋白和IRF3蛋白的相互作用在统计学上减弱， 就表明该候选物质是抑制固有免疫反应信号转导通路的潜在物质；如果HERC5 蛋白和IRF3蛋白的相互作用在统计学上增强，就表明该候选物质是促进固有 免疫反应信号转导通路的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时， 为了更易于观察到HERC5蛋白和IRF3蛋白相互作用的变化，还可设置对照组， 所述的对照组可以是不添加所述候选物质的、HERC5蛋白和IRF3蛋白相互作 用的反应体系。
在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多 种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双 杂交系统或免疫共沉淀技术。在本发明的一个优选例中，采用了免疫共沉淀技 术来鉴定HERC5蛋白和IRF3蛋白的相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理 是：在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特 异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特 性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。 此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其 它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一 步的细胞试验或动物试验，以进一步选择和确定对于调节固有免疫反应信号转 导通路有用的物质。
本发明所述的体系包括但不限于：细胞(包括原核细胞，真核细胞)或细胞 培养物体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节固有免疫 反应信号转导通路的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库。
组合物
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的 0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的HERC5蛋白，或其促进剂 或抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可直接用于调节固有免疫 反应信号转导通路。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过 度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物 质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂 和稀释剂。
本发明的组合物含有安全有效量的HERC5蛋白或其促进剂或抑制剂，以 及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、 水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药 物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水 溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成 分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的HERC5蛋白或其促进剂或抑制剂的有效量可随给药的模式 和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通 技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限 于：所述的HERC5蛋白或其促进剂或抑制剂的药代动力学参数例如生物利用 率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的 免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的HERC5蛋白或其生物活性片段 每天以约0.00001-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001-10mg/kg动物体重)的剂 量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予 若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明的主要优点在于：
首次证明HERC5蛋白是调控宿主细胞固有免疫反应信号转导通路的重要 分子，能够影响干扰素的表达，对抗病毒感染。可通过HERC5蛋白或其促进 剂或抑制剂来调控细胞对外界病原体感染的应激反应强度，达到抗感染，特别 是病毒感染的目的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如Sambrook等人：《分子克隆：实验室指南》(New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
Ⅰ.材料和方法
1.HERC5 cDNA的克隆
本发明的实施例中，使用Invitrogen公司Trizol试剂抽提293T细胞RNA， 使用Promega公司反转录试剂盒进行cDNA的合成，步骤如下：
A)选择生长良好的293T细胞(购自ATCC)，吸去培养基，无菌PBS冲 洗。使用PBS吹起悬浮以后，在血细胞计数板上计数。收集5×106个细胞于 1.5ml EP管中，加入1ml Trizol试剂后，用移液器将细胞吹散开，室温放置5 分钟，让细胞完全裂解。
B)在裂解液中加入0.2ml氯仿，于振荡器上剧烈震荡，使两相溶液充分混 合。室温放置3分钟后，4℃12000g高速离心15分钟，此时溶液呈两相，所 需RNA在上层无色水相中。
C)小心将水相转移到一个新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，震荡混匀后 放置室温15分钟，4℃12000g高速离心10分钟，此时RNA呈胶状沉淀在EP 管底部。
D)加入1.5ml 75％乙醇对沉淀的RNA进行震荡分散，4℃7500g离心5 分钟，小心吸去上清。重复清洗步骤一次。倒置EP管，让残留的乙醇自然挥 发，获得分离的RNA作为模板。
E)在完全干燥之前，向EP管中加入无RNA酶的水，轻吹分散，在55℃ 水浴中溶解10分钟，测定A260/280，确定数值在1.6左右，按照吸光度定量。
F)取一灭菌的无RNA酶的EP管，加入1μg RNA模板和0.5μg引物 (oligo-dT)。调整体积至15μl，70℃处理5分钟，冷却至室温，离心使溶液集中 在管底，再依次加入5×第一链缓冲液5μl、RNA酶抑制剂25U、M-MLV反转 录酶200U后，用H2O调至总体积25μl，震荡混匀。
G)离心将反应液集中在管底，在Eppendorf PCR仪上，42℃温浴1小时， 完成后取出置于冰上，获得HERC5 cDNA，其序列如图1(SEQ ID NO：1)，编 码如图3(SEQ ID NO：2)所示的蛋白序列。
2.HERC5原核表达载体的构建
得到HERC5 cDNA后，使用Toyobo公司高保真KOD PCR试剂盒扩增目 标基因。
A)取薄壁PCR管向其中依次加入：5μl 10×PCR缓冲液、4μl dNTP、1μl 酶、1μl cDNA模板、两端引物各1μl，并用去离子水调至总体积50μl。两条引 物序列为：
HERC5-5’：ACTGGAATTCATGGAGCGGAGGTCGCGGAG(SEQ ID NO： 4)；
HERC 5-3’：AGTCTCGAGTCAGCCAAATCCTCTGTTGTTG(SEQ ID NO： 5)。
B)震荡混合均匀后，离心收集反应液于PCR管底，使用下列程序进行目 标片段扩增：95℃5分钟，94℃20秒，55℃25秒，68℃4分钟，30个循环。
C)琼脂糖电泳检测PCR产物，选取条带大小正确，条带清晰的样品，进 行切胶纯化。
D)纯化产物使用EcoRI、XhoI双酶切，37℃反应2小时，琼脂糖电泳， 再次进行切胶纯化，用作外源片段。
E)使用EcoRI、XhoI对PGEX-6p-1(购自Amersham Pharmacia公司)以及 进行双酶切，37℃反应2小时，琼脂糖电泳，切胶纯化切出的线性片段，用做 载体大片段。
F)使用T4连接酶连接外源片段以及载体大片段，16℃放置过夜，转化 DH5α大肠杆菌感受态细胞。培养过夜，挑取单克隆送样测序。
G)测序正确的克隆，制备甘油菌，于-80℃长期保存。
3.外源DNA载体以及SiRNA的转染
本发明人设计了人HERC5基因的SiRNA序列(SiRNA-HERC5)，序列如图 2(SEQ ID NO：3)所示。
对于小量外源DNA以及SiRNA的转染使用Invitrogen公司的 Lipofectamine 2000试剂盒完成，这里所指出的“适量”或“适合”是参照 Invitrogen公司Lipofectamine 2000说明书确定。
A)在转染前一天，将健康生长细胞按照适合密度转接到新的12孔培养板 中，加入不含抗生素的DMEM培养基培养，培养过夜。
B)当细胞生长密度达到覆盖80％培养板底部时，开始转化。首先用不含 有血清的OPTi-DMEM将DNA和RNA干扰分子(siRNA)稀释到适当浓度，轻 轻地混合。再用不含有血清的OPTi-DMEM将适量Lipofectamine 2000脂质体 稀释到适当浓度，轻轻混匀。放置5分钟后，将两个溶液混合，再在室温放置 20分钟。
C)取适量加入到12孔细胞培养板中，放置二氧化碳培养箱中，37℃继续 培养适当时间，进行后续步骤。
Ⅱ.实施例
实施例1.通过免疫共沉淀(co-IP)研究HERC5与IRF3相互作用
先前已经知道，与IRF3拥有直接相互作用的蛋白质分子有多种。本发明 重点关注IRF3信号通路被病毒激活后，与IRF3拥有直接相互作用的蛋白质分 子，因为这类分子可能在宿主细胞抗病毒过程中起到重要作用。
首先使用普通仙台病毒(SeV：购自武汉病毒所)的方法(参见Yang et al.J Immunol.182(6)：3782-92)模拟病毒对293T细胞的IRF3信号通路的激活。收集 细胞后，进行裂解，离心取细胞裂解上清，再使用抗IRF3的单克隆抗体(购自 Abcam)进行co-IP试验。经过银染鉴定，发现有一个110kDa左右的条带在刺 激前后表达量有明显变化。对该条带切胶鉴定，质谱分析显示该条带是HERC5 蛋白。
使用抗HERC5的特异性抗体(购自AbMART)对该条带进行免疫杂交 (Western Blotting)，证实了质谱鉴定的结果。
实施例2.克隆HERC5的cDNA序列
HERC5是一个110kDa左右的蛋白，是HECT蛋白家族成员。这一家族蛋 白有一些共同特征：在蛋白质的C端有一个HECT结构域(在人的HERC5蛋白 (图3)上包括残基位：681-1024)，并且994残基位被半胱氨酸(Cys)占据。
使用RNA抽提试剂盒抽提293T细胞RNA以后，使用通用引物Oligo dT 进行反转录获得cDNA，再使用两端序列引物进行扩增。5’端带有EcoRI限制 性内切酶位点，3’端有XhoI限制性内切酶位点。扩增产物电泳以后，切下目标 条带，转入常规载体中测序，测序后拼接结果见图1。制备甘油菌，冻存于-80℃。
实施例3.原核表达HERC5以及真核表达HERC5
HERC5的DNA编码序列获得以后，使用EcoRI和XhoI双酶切，再转入 到大肠杆菌表达载体PGEX-6p-1的相应位点中。这种载体是原核表达载体，拥 有Lac操纵子，在大肠杆菌中受IPTG诱导而表达。PGEX-6p-1载体编码一个 谷胱甘肽转移酶(GST)，因此相应的HERC5表达产物是连接有GST的融合蛋 白，可以通过谷胱甘肽(GSH)树脂进行亲和纯化。同时GST-HERC5融合蛋白 上有一个蛋白酶的切点(LEVLF↓GP)，通过流感鼻病毒的3C蛋白酶可以在柱对 融合蛋白进行酶解，可以将HERC5与GST蛋白分离开来。
真核表达的方法与原核类似，使用EcoRI和XhoI双酶切后，将编码HERC 的基因序列接入pCMV真核表达载体(购自Clontech公司)中，转化大肠杆菌后， 挑单克隆扩增质粒。使用Invitrogen转染试剂Lipofectamine 2000转染293T等 细胞株，适当条件培养16小时，可以检测到细胞内的外源HERC5表达。表达 产物根据基因序列翻译后得到的蛋白质一级残基序列见图3。
实施例4.IFR3介导的细胞信号转导通路受到HERC5影响
早期已经知道HERC5是一个泛素连接酶E3，那么它对IRF3转录因子的 调控可能与它的E3活性有关系。本发明人首先使用表达HERC5的真核载体 pCMV转染293T细胞，再使用仙台病毒(SeV，购自武汉病毒所)刺激转染以 及未转染的细胞，报告基因实验(方法参考Yang et al.J Immunol.182(6)：3782-92) 结果显示：外源转入的HERC5(过表达HERC5)能够促进细胞分泌干扰素-β，而 过表达HERC5突变体(第994位由C突变为A)没有该作用，见图4。前面已经 介绍干扰素-β的分泌受到IRF3信号通路的调控，而干扰素-β的表达量提高能 够促进细胞对抗病毒的能力。
在过表达(Over-expression)实验之后，本发明还使用了RNA干扰 (Knock-down)的方法降低了细胞内的HERC5的表达量。此时，报告基因的结 果显示：细胞分泌干扰素-β的能力随着HERC5表达量的降低而降低。定量PCR 以及其它一些实验的结果也证实了HERC5通过与IRF3相互作用，影响IFR3 介导的细胞信号转导通路，调控细胞分泌干扰素。
上述结果显示，HERC5是一个干扰素正调控因子，能够帮助细胞分泌干扰 素。
实施例5.RNA干扰HERC5影响IRF3的泛素化降解
本发明人对IRF3的泛素化进行了深入研究。前面已经介绍了IRF3被磷酸 化激活以后，结合到受它调控的基因的启动子区域，诱导下游基因转录。完成 任务以后，IRF3首先被Pin1蛋白改变构象，再被一个未知的泛素连接酶E3泛 素化，转运到蛋白酶体中降解(参考Yang et al.J Immunol.182(6)：3782-92)。因 此，IRF3的泛素化程度越高，则说明细胞对IRF3的降解速度越快。在仙台病 毒刺激时，通过MG132抑制蛋白酶体降解，可以观测到IRF3的泛素化。如果 此时再对内源的HERC5进行RNA干扰，可以发现IRF3的泛素化降解明显快， 见图5。
在本发明中，本发明人还使用点突变的方法证实了HERC5通过类泛素化 (催化ISG15，序列参见SEQ ID NO：6，Gene Bank登录号：NP_005092)修饰 IRF3(序列参见SEQ ID NO：7，GeneBank登录号：NP_001562.1)的Lys193、 Lys360、Lys366(参考Yang et al.J Immunol.182(6)：3782-92)，影响了Pin1对IRF3 的构象转变作用。已经有报道Pin1对IRF3的构象转变作用发生在IRF3被泛素 化之前，因此可以理解HERC5与IRF3之间的相互作用能够影响IRF3的泛素 化降解。
实施例6.HERC5对细胞抗病毒能力的影响
如前所述，为了研究HERC5对细胞抗病毒能力的直接影响，本发明人使 用外源HERC5真核表达质粒以及HERC5的RNA干扰序列转染293T细胞，细 胞培养一段时间以后再使用仙台病毒刺激。感染后的细胞培养24小时后，收 集培养基上清，离心后一部分用作ELISA实验直接测定干扰素-β的含量，实验 结果表明：转染外源HERC5表达载体的细胞培养基离心上清中干扰素-β的含 量明显上升，而RNA干扰内源的HERC5使培养基离心上清中的干扰素-β的含 量显著降低。同时外转丧失连接酶活性的HERC5的C994A突变体则没有促进 干扰素-β表达上升的功能。
另外，SiRNA干扰处理的离心上清被直接用作抗病毒实验。把离心上清加 入293T细胞的培养基中，再使用NDV病毒(购自ATCC)感染，进行病毒空 斑试验。结果显示：与没有使用NC序列处理的对照组细胞相比，使用HERC5 RNA干扰后的上清处理的细胞形成的空斑增加，死亡率显著升高(图6)。该研 究结果证实转染外源HERC5能够增加细胞培养上清中干扰素-β的分泌量，促 进细胞对抗病毒感染。反之，转染HERC5的SiRNA序列，能够减弱培养细胞 分泌干扰素-β的能力，使得细胞易于被病毒感染。总之，HERC5在细胞抗病 毒过程中扮演重要角色，是抗病毒药物设计的关键靶点蛋白。
实施例7.筛选药物
使用前述293T细胞(含有IRF3信号通路)作为模型，在细胞内构建筛选体 系。
设置以下组：
测试组：用候选物质处理的293T细胞；
对照组：不用候选物质处理的293T细胞。
经过上述处理后，用裂解缓冲液裂解细胞，通过免疫杂交以及免疫共沉淀 的方法观察HERC5以及IRF3的表达量改变，同时观察两种蛋白的相互作用情 况以及IRF3被ISG15修饰的情况。
如果与对照组相比，测试组中的HERC5与IRF3蛋白表达量或者相互作用 显著增强，则说明该候选物质是潜在的促进固有免疫反应信号转导通路的激活 的物质；反之，如测试组中的HERC5与IRF3蛋白相互作用显著变弱，则说明 该候选物质是潜在的抑制固有免疫反应信号转导通路的激活的物质。
同样，使用ISG15抗体检查IRF3的修饰程度，如果ISG15化的程度提高， 说明该候选物质是潜在的促进固有免疫反应信号转导通路的激活的物质；反 之，如测试组中的IRF3蛋白的ISG15修饰显著变弱，则说明该候选物质是潜 在的抑制固有免疫反应信号转导通路的激活的物质。
总之，本发明使用分子生物学、细胞生物学、免疫学等技术手段证实了 HERC5能够与IRF3直接相互作用，阻断磷酸化激活的IRF3分子被Pin1作用， 进而抑制IRF3分子的泛素化降解。也指出了通过外源导入DNA或者SiRNA 的手段，能够改变细胞内HERC5的表达水平，进而影响细胞内IRF3介导的信 号转导通路。同时，由于IRF3介导的信号转导通路主要负责细胞对抗病毒感 染，因此HERC5分子是一个新的抗病毒药物设计靶点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>类泛素修饰蛋白在抗病毒方面的新用途
<130>102121
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3525
<212>DNA
<213>智人
<400>1
tcagtagctg aggctgcggt tccccgacgc cacgcagctg cgcgcagctg gttcccgctc 60
tgcagcgcaa cgcctgaggc agtgggcgcg ctcagtcccg ggaccaggcg ttctctcctc 120
tcgcctctgg gcctgggacc ccgcaaagcg gcgatggagc ggaggtcgcg gaggaagtcg 180
cggcgcaacg ggcgctcgac cgcgggcaag gccgccgcga cccagcccgc gaagtctccg 240
ggcgcacagc tctggctctt tcccagcgcc gcgggcctcc accgcgcgct gctccggagg 300
gtggaggtga cgcgccaact ctgctgctcg ccggggcgcc tcgcggtctt ggaacgcggc 360
ggggcgggcg tccaggttca ccagctgctc gccgggagcg gcggcgcccg gacgccgaaa 420
tgcattaaat taggaaaaaa catgaagata cattccgtgg accaaggagc agagcacatg 480
ctgattctct catcagatgg aaaaccattt gagtatgaca actatagcat gaaacatcta 540
aggtttgaaa gcattttaca agaaaaaaaa ataattcaga tcacatgtgg agattaccat 600
tctcttgcac tctcaaaagg tggtgagctt tttgcctggg gacagaacct gcatgggcag 660
cttggagttg gaaggaaatt tccctcaacc accacaccac agattgtgga gcacctcgca 720
ggagtaccct tggctcagat ttctgccgga gaagcccaca gcatggcctt atccatgtct 780
ggcaacattt attcatgggg aaaaaatgaa tgtggacaac taggcctggg ccacactgag 840
agtaaagatg atccatccct tattgaagga ctagacaatc agaaagttga atttgtcgct 900
tgtggtggct ctcacagtgc cctactcaca caggatgggc tgctgtttac tttcggtgct 960
ggaaaacatg ggcaacttgg tcataattca acacagaatg agctaagacc ctgtttggtg 1020
gctgagcttg ttgggtatag agtgactcag atagcatgtg gaaggtggca cacacttgcc 1080
tatgtttctg atttgggaaa ggtcttttcc tttggttctg gaaaagatgg acaactggga 1140
aatggtggaa cacgtgacca gctgatgccg cttccagtga aagtatcatc aagtgaagaa 1200
ctcaaacttg aaagccatac ctcagaaaag gagttaataa tgattgctgg agggaatcaa 1260
agcattttgc tctggataaa gaaagagaat tcatatgtta atctgaagag gacaattcct 1320
actctgaatg aagggactgt aaagagatgg attgctgatg tggagactaa acggtggcag 1380
agcacaaaaa gggaaatcca agagatattt tcatctcctg cttgtctaac tggaagtttt 1440
ttaaggaaaa gaagaactac agaaatgatg cctgtttatt tggacttaaa taaagcaaga 1500
aacatcttca aggagttaac ccaaaaggac tggattacta acatgataac cacctgcctc 1560
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ttcttccttc tcccagaatg tcctatgatg catatttcca acaactggga gagccttgtg 1680
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tattgggcaa ctctgcaaga atccactttc agcaaactgg tccagatgtt taaaacagcc 1800
gtcatatgcc agttggatta ctgggatgaa agtgctgagg agaatggtaa tgttcaagct 1860
ctcctagaaa tgttgaagaa gctgcacagg gtaaaccagg tgaaatgtca actacctgaa 1920
agtattttcc aagtagacga actcttgcac cgtctcaatt tttttgtaga agtatgcaga 1980
aggtacttgt ggaaaatgac tgtggacgct tcagaaaatg tacaatgctg cgtcatattc 2040
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cttttaaaaa tagagagtaa aaaacataaa gcttatctta ggtcggcagc aattgaggaa 2160
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tataacagtt cacatcccac catagtgatg ttttggaagg ctttccacaa attgactctg 3000
gaagaaaaga aaaaattcct tgtatttctt acaggaactg acagactaca aatgaaagat 3060
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tccaacagcc ttattttgtt gttgttatcg ttgttgttgt tgttgttgtt gttgtttctc 3300
tactttgttt tgttttaggc ttttagcagc ctgaagccat ggtttttcat ttctgtctct 3360
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tgtattctct cccttggata cccctatgcc tacatcatat tccttacctc ttttgggaaa 3480
tatttttcaa aaataaaata accgaaaaat taaaaaaaaa aaaaa 3525
<210>2
<211>1024
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Glu Arg Arg Ser Arg Arg Lys Ser Arg Arg Asn Gly Arg Ser Thr
1 5 10 15
Ala Gly Lys Ala Ala Ala Thr Gln Pro Ala Lys Ser Pro Gly Ala Gln
20 25 30
Leu Trp Leu Phe Pro Ser Ala Ala Gly Leu His Arg Ala Leu Leu Arg
35 40 45
Arg Val Glu Val Thr Arg Gln Leu Cys Cys Ser Pro Gly Arg Leu Ala
50 55 60
Val Leu Glu Arg Gly Gly Ala Gly Val Gln Val His Gln Leu Leu Ala
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Ala Arg Thr Pro Lys Cys Ile Lys Leu Gly Lys Asn
85 90 95
Met Lys Ile His Ser Val Asp Gln Gly Ala Glu His Met Leu Ile Leu
100 105 110
Ser Ser Asp Gly Lys Pro Phe Glu Tyr Asp Asn Tyr Ser Met Lys His
115 120 125
Leu Arg Phe Glu Ser Ile Leu Gln Glu Lys Lys Ile Ile Gln Ile Thr
130 135 140
Cys Gly Asp Tyr His Ser Leu Ala Leu Ser Lys Gly Gly Glu Leu Phe
145 150 155 160
Ala Trp Gly Gln Asn Leu His Gly Gln Leu Gly Val Gly Arg Lys Phe
165 170 175
Pro Ser Thr Thr Thr Pro Gln Ile Val Glu His Leu Ala Gly Val Pro
180 185 190
Leu Ala Gln Ile Ser Ala Gly Glu Ala His Ser Met Ala Leu Ser Met
195 200 205
Ser Gly Asn Ile Tyr Ser Trp Gly Lys Asn Glu Cys Gly Gln Leu Gly
210 215 220
Leu Gly His Thr Glu Ser Lys Asp Asp Pro Ser Leu Ile Glu Gly Leu
225 230 235 240
Asp Asn Gln Lys Val Glu Phe Val Ala Cys Gly Gly Ser His Ser Ala
245 250 255
Leu Leu Thr Gln Asp Gly Leu Leu Phe Thr Phe Gly Ala Gly Lys His
260 265 270
Gly Gln Leu Gly His Asn Ser Thr Gln Asn Glu Leu Arg Pro Cys Leu
275 280 285
Val Ala Glu Leu Val Gly Tyr Arg Val Thr Gln Ile Ala Cys Gly Arg
290 295 300
Trp His Thr Leu Ala Tyr Val Ser Asp Leu Gly Lys Val Phe Ser Phe
305 310 315 320
Gly Ser Gly Lys Asp Gly Gln Leu Gly Asn Gly Gly Thr Arg Asp Gln
325 330 335
Leu Met Pro Leu Pro Val Lys Val Ser Ser Ser Glu Glu Leu Lys Leu
340 345 350
Glu Ser His Thr Ser Glu Lys Glu Leu Ile Met Ile Ala Gly Gly Asn
355 360 365
Gln Ser Ile Leu Leu Trp Ile Lys Lys Glu Asn Ser Tyr Val Asn Leu
370 375 380
Lys Arg Thr Ile Pro Thr Leu Asn Glu Gly Thr Val Lys Arg Trp Ile
385 390 395 400
Ala Asp Val Glu Thr Lys Arg Trp Gln Ser Thr Lys Arg Glu Ile Gln
405 410 415
Glu Ile Phe Ser Ser Pro Ala Cys Leu Thr Gly Ser Phe Leu Arg Lys
420 425 430
Arg Arg Thr Thr Glu Met Met Pro Val Tyr Leu Asp Leu Asn Lys Ala
435 440 445
Arg Asn Ile Phe Lys Glu Leu Thr Gln Lys Asp Trp Ile Thr Asn Met
450 455 460
Ile Thr Thr Cys Leu Lys Asp Asn Leu Leu Lys Arg Leu Pro Phe His
465 470 475 480
Ser Pro Pro Gln Glu Ala Leu Glu Ile Phe Phe Leu Leu Pro Glu Cys
485 490 495
Pro Met Met His Ile Ser Asn Asn Trp Glu Ser Leu Val Val Pro Phe
500 505 510
Ala Lys Val Val Cys Lys Met Ser Asp Gln Ser Ser Leu Val Leu Glu
515 520 525
Glu Tyr Trp Ala Thr Leu Gln Glu Ser Thr Phe Ser Lys Leu Val Gln
530 535 540
Met Phe Lys Thr Ala Val Ile Cys Gln Leu Asp Tyr Trp Asp Glu Ser
545 550 555 560
Ala Glu Glu Asn Gly Asn Val Gln Ala Leu Leu Glu Met Leu Lys Lys
565 570 575
Leu His Arg Val Asn Gln Val Lys Cys Gln Leu Pro Glu Ser Ile Phe
580 585 590
Gln Val Asp Glu Leu Leu His Arg Leu Asn Phe Phe Val Glu Val Cys
595 600 605
Arg Arg Tyr Leu Trp Lys Met Thr Val Asp Ala Ser Glu Asn Val Gln
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Cys Cys Val Ile Phe Ser His Phe Pro Phe Ile Phe Asn Asn Leu Ser
625 630 635 640
Lys Ile Lys Leu Leu His Thr Asp Thr Leu Leu Lys Ile Glu Ser Lys
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Lys His Lys Ala Tyr Leu Arg Ser Ala Ala Ile Glu Glu Glu Arg Glu
660 665 670
Ser Glu Phe Ala Leu Arg Pro Thr Phe Asp Leu Thr Val Arg Arg Asn
675 680 685
His Leu Ile Glu Asp Val Leu Asn Gln Leu Ser Gln Phe Glu Asn Glu
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Asp Leu Arg Lys Glu Leu Trp Val Ser Phe Ser Gly Glu Ile Gly Tyr
705 710 715 720
Asp Leu Gly Gly Val Lys Lys Glu Phe Phe Tyr Cys Leu Phe Ala Glu
725 730 735
Met Ile Gln Pro Glu Tyr Gly Met Phe Met Tyr Pro Glu Gly Ala Ser
740 745 750
Cys Met Trp Phe Pro Val Lys Pro Lys Phe Glu Lys Lys Arg Tyr Phe
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Phe Phe Gly Val Leu Cys Gly Leu Ser Leu Phe Asn Cys Asn Val Ala
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Asn Leu Pro Phe Pro Leu Ala Leu Phe Lys Lys Leu Leu Asp Gln Met
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885 890 895
Ile Lys Leu Phe His Pro Glu Glu Leu Lys Asp Val Ile Val Gly Asn
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Gly
<210>3
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<212>RNA
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<221>misc_feature
<223>寡核苷酸
<400>3
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<210>4
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<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
actggaattc atggagcgga ggtcgcggag 30
<210>5
<211>31
<212>DNA
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<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
agtctcgagt cagccaaatc ctctgttgtt g 31
<210>6
<211>165
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Met Gly Trp Asp Leu Thr Val Lys Met Leu Ala Gly Asn Glu Phe Gln
1 5 10 15
Val Ser Leu Ser Ser Ser Met Ser Val Ser Glu Leu Lys Ala Gln Ile
20 25 30
Thr Gln Lys Ile Gly Val His Ala Phe Gln Gln Arg Leu Ala Val His
35 40 45
Pro Ser Gly Val Ala Leu Gln Asp Arg Val Pro Leu Ala Ser Gln Gly
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Leu Gly Pro Gly Ser Thr Val Leu Leu Val Val Asp Lys Cys Asp Glu
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Gly Leu Glu Gly Val Gln Asp Asp Leu Phe Trp Leu Thr Phe Glu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Glu Asp Gln Leu Pro Leu Gly Glu Tyr Gly Leu Lys Pro
130 135 140
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Pro Gly Gly Arg Ser
165
<210>7
<211>427
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Met Gly Thr Pro Lys Pro Arg Ile Leu Pro Trp Leu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Gln Leu Glu Gly Val Ala Trp Val Asn Lys Ser Arg Thr
20 25 30
Arg Phe Arg Ile Pro Trp Lys His Gly Leu Arg Gln Asp Ala Gln Gln
35 40 45
Glu Asp Phe Gly Ile Phe Gln Ala Trp Ala Glu Ala Thr Gly Ala Tyr
50 55 60
Val Pro Gly Arg Asp Lys Pro Asp Leu Pro Thr Trp Lys Arg Asn Phe
65 70 75 80
Arg Ser Ala Leu Asn Arg Lys Glu Gly Leu Arg Leu Ala Glu Asp Arg
85 90 95
Ser Lys Asp Pro His Asp Pro His Lys Ile Tyr Glu Phe Val Asn Ser
100 105 110
Gly Val Gly Asp Phe Ser Gln Pro Asp Thr Ser Pro Asp Thr Asn Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Thr Ser Asp Thr Gln Glu Asp Ile Leu Asp Glu Leu Leu
130 135 140
Gly Asn Met Val Leu Ala Pro Leu Pro Asp Pro Gly Pro Pro Ser Leu
145 150 155 160
Ala Val Ala Pro Glu Pro Cys Pro Gln Pro Leu Arg Ser Pro Ser Leu
165 170 175
Asp Asn Pro Thr Pro Phe Pro Asn Leu Gly Pro Ser Glu Asn Pro Leu
180 185 190
Lys Arg Leu Leu Val Pro Gly Glu Glu Trp Glu Phe Glu Val Thr Ala
195 200 205
Phe Tyr Arg Gly Arg Gln Val Phe Gln Gln Thr Ile Ser Cys Pro Glu
210 215 220
Gly Leu Arg Leu Val Gly Ser Glu Val Gly Asp Arg Thr Leu Pro Gly
225 230 235 240
Trp Pro Val Thr Leu Pro Asp Pro Gly Met Ser Leu Thr Asp Arg Gly
245 250 255
Val Met Ser Tyr Val Arg His Val Leu Ser Cys Leu Gly Gly Gly Leu
260 265 270
Ala Leu Trp Arg Ala Gly Gln Trp Leu Trp Ala Gln Arg Leu Gly His
275 280 285
Cys His Thr Tyr Trp Ala Val Ser Glu Glu Leu Leu Pro Asn Ser Gly
290 295 300
His Gly Pro Asp Gly Glu Val Pro Lys Asp Lys Glu Gly Gly Val Phe
305 310 315 320
Asp Leu Gly Pro Phe Ile Val Asp Leu Ile Thr Phe Thr Glu Gly Ser
325 330 335
Gly Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Leu Trp Phe Cys Val Gly Glu Ser Trp
340 345 350
Pro Gln Asp Gln Pro Trp Thr Lys Arg Leu Val Met Val Lys Val Val
355 360 365
Pro Thr Cys Leu Arg Ala Leu Val Glu Met Ala Arg Val Gly Gly Ala
370 375 380
Ser Ser Leu Glu Asn Thr Val Asp Leu His Ile Ser Asn Ser His Pro
385 390 395 400
Leu Ser Leu Thr Ser Asp Gln Tyr Lys Ala Tyr Leu Gln Asp Leu Val
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Glu Gly Met Asp Phe Gln Gly Pro Gly Glu Ser
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<212>RNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>寡核苷酸
<400>8
uucuccgaag gugucacgu 19