交叉引用相关申请
本申请要求申请于2008年12月22日的美国临时申请No.61/139,988的优先权，该申 请在本申请中全文参考并入，用于各种目的。
政府支持
本工作获得NIH的过敏与传染病国立研究所提供的公共卫生服务基金RO1AI46464的 支持。联邦政府在本发明中具有某些权利。
技术领域
本披露涉及针对细菌的抗体的杀菌活性的实验。
背景
奈瑟氏脑膜炎菌是一种共生生物，常见于健康青少年喉部，可侵入血流，导致脑膜炎 或快速致死性败血症，是严格的人类病原体。脑膜炎球菌疾病的可靠动物模型难以开发。 许多在人类中高度致病的有荚膜的奈瑟氏脑膜炎菌在如兔、小鼠和大鼠等常用实验动物的 血流中容易被清除。清除可能部分是由于细菌蛋白fH结合蛋白(fHbp)所导致，该蛋白 与下调补体激活的人补体因子H(fH)相结合。人fH与细菌的结合增强了生物体对补体 介导的细菌杀伤的耐受性，可能是使奈瑟氏脑膜炎菌绕过宿主天然防御的重要机制。对于 奈瑟氏淋球菌，fH的结合局限于人fH，这可能部分解释了天然淋球菌感染的种属特异性 限制((Ngampasutadol，J.等人(2008)J Immunol 180：3426-3435)。
相当多数据表明，血清中补体介导的杀菌抗体提供了针对脑膜炎球菌病的保护 (Goldschneider，I.等人(1969)J Exp Med 129：1307-1326；Goldschneider等人(1969)J Exp Med 129：1327-1348；Borrow，R.等人(2005)Vaccine 23：2222-2227；Balmer，P.等人(2004) Expert Rev Vaccines 3：77-87；Andrews，N等人(2003)Clin Diagn Lab Immunol 10：780-786； Borrow，R.等人(2001)Infect Immun 69：1568-1573)。例如，在一项开创性的研究中， Goldscheider等人在招募新兵中研究了血清中补体介导的杀菌性抗体对流行性C组脑膜炎 球菌病的抵抗能力(Goldschneider等人.1969，J Exp Med 129(6)：1307-26；Goldschneider 等人.1969，J Exp Med 129(6)：1327-48)。在超过14,000的受试者中，82％具有的针对流 行性菌株的血清杀菌滴度≥1∶4，但是随后患上脑膜炎球菌病的53人中有51人的血清杀菌 滴度＜1∶4。作者认为，≥1∶4的滴度能防御该病，但也指出估算的滴度＜1∶4的2600位招募 新兵中，许多人很可能暴露于流行性菌株中却没有发病。事实上，SBA滴度＜1∶4的一小组 招募新兵中，有超过半数都被发现在喉部携带有C组流行菌，但是却没有发病。因此，尽 管滴度≥1∶4能提供保护，但是滴度＜1∶4也未必就是疾病易感性的指标。
英国近期的一项研究报道指出，在1至10岁年龄段中，B组脑膜炎球菌病的发生率降 低，但却没有发现B组血清杀菌滴度≥1∶4的普遍性有相应的提高(Trotter等人，(2007)Clin Vaccine Immunol 14(7)：863-8)。该研究还发现在年轻人中血清抗菌活性滴度的普遍性(约 50％)比Goldschneider研究报道的(约80％至90％)低。在北美或欧洲其它国家的其它最 新研究也确认，成人中SBA滴度≥1∶4相对并不常见(取决于菌株，成人通常是10至25％) (Mitchell等人，1996，J Infect Dis 173(4)：1009-13；Jones等人.2000，J Infect Dis 181(3)： 1172-5；Welsch and Granoff，2004，Infect Immun 72(10)：5903-9；Amir等人.2005，Vaccine 23 (8)：977-83；Granoff等人.2005，Pediatr Infect Dis J 24(2)：132-136)。因此，尽管SBA 滴度≥1∶4在1960年代很普遍，但现在的普遍性低了很多，但是脑膜炎球菌病的发生率却 没有相应上升(从2000年以来美国的发病率是过去50年中最低的)。综上，这些血清流 行病学数据与防御脑膜炎球菌病需要血清杀菌滴度≥1∶4的假说不一致。另外的假说包括， 在血清稀释度＜1∶4时通过补体介导的杀菌抗体保护，和/或在缺乏SBA时通过调理素的活 性提供保护。
已经开发出了对A组和C组杀菌实验的一些标准操作方法，其补体来源使用幼兔血清 而不是人血清(Maslanka，S.E.等人.(1997)Clin Diagn Lab Immunol 4：156-167；Jodar，L. 等人.(2000)Biologicals 28：193-197)。为了标准化后更加方便，所以在这些操作方法中 选择了兔补体，但是多年以来已经公知，相比于人补体测得的滴度，兔补体会提高血清杀 菌滴度(Zollinger，W.D.等人.(1983)Infect Immun 40：257-264；Santos，G.F.等人.(2001) Clin Diagn Lab Immunol 8：616-623)。尽管用兔补体测得的血清杀菌滴度与在大量人群中进 行的脑膜炎球菌免疫的效力相关联(Borrow，R.等人.(2005)Vaccine 23：2222-2227；Balmer， P.等人1.(2004)Expert Rev Vaccines 3：77-87；Andrews and Borrow(2003)Clin Diagn Lab Immunol 10：780-786)，但是如果用人补体测试，许多这些血清将不具有杀菌活性。因此， 用兔补体观察到的关联性可能不能准确或完全反映出用疫苗诱导的抗体提供保护性的真 实机制。
全血杀菌实验(WBA)用来测试儿童(Ison et al.(1999)Microb Pathog 27(4)：207-14) 和成人(Findlow等人.(2006)Infect Immun 74(8)：4557-65)对脑膜炎球菌免疫的天 然获得性免疫(Ison等人.(2003)PediatrInfect Dis J 22(10)：868-73；Ison等人.(1995) Microb Pathog 18(2)：97-107)或抗体反应。该实验使用每个免疫个体在免疫之前和之后 获得的新鲜血液样品。正如Findlow等人(2006)指出的那样，用WBA测试疫苗反应并 不现实，因为每个实验中都需要新鲜血液，而且不能使用保存的血液或血清样品进行所描 述的实验。因此，使用临床实验的个体或病人的新鲜全血样品来评价疫苗产生的杀菌抗体 是不现实的或不可能的。例如，根本不可能在同样的实验条件下将个体新鲜全血中的免疫 前杀菌抗体与同一个体的新鲜全血中的免疫后杀菌抗体相比较，因为在能够获得免疫后样 品时，免疫前血液已不再“新鲜”。而且，在单独测试两份样品的滴度是否不同时，在不 同天分别测定比两者同时测定的准确性要低。
调理素的活性也被用于评价用血清杀菌活性实验不能测出的针对奈瑟氏脑膜炎菌的保 护性抗体(Ross等人.1987，J Infect Dis 155(6)：1266-75；Halstensen等人.1991，NIPH Ann 14(2)：157-65；讨论166-7；Lehmann等人.1991，Apmis 99(8)：769-72；Guttormsen等人.1993， J Infect Dis 167(6)：1314-9；Aase等人.1995，Infect Immun 63(9)：3531-6；Aase等人.1998， Scand J Immunol 47(4)：388-96；Lehmann等人.1999，Infect Immun 67(12)：6526-32；Naess 等人.1999，Vaccine 17(7-8)：754-64；Quakyi等人.1999，J Infect Dis 180(3)：747-54； Rosenqvist等人.1999，Infect Immun 67(3)：1267-76；Plested等人.2001，Infect Immun 69(5)： 3203-13；Martinez等人.2002，Clin Diagn Lab Immunol 9(2)：485-8；Borrow等人.2006， Vaccine 24(24)：5093-107；Romero-Steiner等人.2006，Clin Vaccine Immunol 13(2)：165-9； Plested等人.(2008)Clin Vaccine Immunol 15(5)：799-804)。该实验通常测试被加热 而去除内源补体活性的测试血清，其中加入外源兔或人血清作为补体来源，加入分级或未 分级的外周血单核白细胞或组织培养中生长的单核细胞系作为吞噬细胞性效应细胞。可以 在同一OPA实验中测试来自于一个个体的配对的免疫前和免疫后血清，或使用不同疫苗的 多人的多组血清，因此，用OPA要比用前面描述的WBA更能够确定免疫后滴度的变化， 或组间疫苗反应的差别。然而，OPA实验中通常用的反应混台物中含有作为补体来源的稀 释的非免疫血清(通常5％、10％或20％)。因此，检测OPA杀菌活性的结果可能没有WBA 的结果灵敏。
发明概述
本披露提供了测试生物样品中的杀菌抗体的方法，通过使用未免疫人的人新鲜全血作 为实验的反应媒介。在某些实施方式中，检测生物样品中杀菌抗体的方法包括在反应混合 物中混合：疑似含有杀菌抗体的生物样品、感兴趣的革兰氏阴性病原活菌和来源于未免疫 的人供体的新鲜人全血，其不含有可检测的、能有效针对感兴趣的病原菌杀菌抗体，其中 所述人生物样品取自的人不是未免疫的人供体，其中所述新鲜人全血含有不显著影响补体 激活或补体活性的抗凝剂，以及通过评价革兰氏阴性菌的存活，检测样品中是否存在或缺 乏杀菌抗体，其中在生物样品存在时，所述革兰氏阴性菌存活降低则表明所述样品中含有 杀菌性抗菌抗体。在某些情况下，所述生物样品是人血清。在特别的例子中，所述生物样 品是人血浆。在某些情况下，所述生物样品是抗体分泌细胞的上清。在其它实施方式中， 所述生物样品是小鼠血清。在特别实施方式中，所述反应混合物中的所述生物样品是免疫 前的生物样品，所述方法还包括在单独的反应混合物中混合：疑似含有杀菌抗体的免疫后 生物样品，其中所述免疫后样品和所述免疫前样品取自于同一个个体，且其中所述免疫后 样品在将免疫原性组合物给药于所述个体后获得；感兴趣的革兰氏阴性活菌；新鲜人全血， 其不含有可检测的、能有效针对感兴趣的细菌的杀菌抗体，其中所述新鲜人全血取自于未 免疫的人供体，其中所述人生物样品取自的人不是未免疫的人供体，且其中新鲜人全血含 有不显著影响补体激活或补体活性的抗凝剂；以及所述检测包括，通过评价样品中细菌的 存活，检测免疫前样品和免疫后样品中是否存在或缺乏杀菌抗体，其中与免疫前样品相比， 在免疫后样品中存在或缺乏杀菌抗体则表明给药于个体的免疫原性组合物引起针对革兰 氏阴性菌的杀菌抗体的能力。在示例的实施方式中，所述革兰氏阴性细菌是奈瑟氏细菌， 所述免疫原性组合物包括旨在引起抗奈瑟氏菌抗体的抗原。在特别的例子中，所述奈瑟氏 细菌是奈瑟氏脑膜炎球菌。在某些实施方式中，所述免疫前样品和所述免疫后样品分别是 免疫前血清样品和免疫后血清样品。在一些情况下，所述免疫前血清和免疫后血清在混合 前被热灭活。在一些例子中，所述个体是人。或者，所述个体是小鼠。
也提供了筛选候选疫苗的方法。方法包括在第一种反应混合物中混合：在对个体给药 含有免疫原性组合物的候选疫苗前，从个体中获得的免疫前生物样品；革兰氏阴性活细菌； 以及新鲜人全血，其不含有可检测的、能有效针对所述感兴趣的细菌的杀菌抗体，其中所 述新鲜人全血取自于未免疫的人供体，其中所述人免疫前样品取自的人不是所述候选疫苗 将给药的个体，且其中新鲜人全血含有不显著影响补体激活或补体活性的抗凝剂；在第二 种反应混合物中混合：在所述候选疫苗给药后，从所述个体获得的免疫后样品；所述新鲜 人全血；所述革兰氏阴性活细菌；以及通过评价细菌的存活，检测每一份所述免疫前和免 疫后样品中是否存在或缺乏杀菌性抗细菌抗体。在某些情况，所述免疫前和免疫后样品是 人血清样品。在典型示例中，所述革兰氏阴性细菌是奈瑟氏细菌。在同样的实施方式中， 所述奈瑟氏细菌是奈瑟氏脑膜炎球菌。
还提供了反应混合物，包括疑似含有杀菌抗体的生物样品；感兴趣的革兰氏阴性活细 菌；新鲜人全血，其不含有可检测的、能有效针对感兴趣的细菌的杀菌抗体，其中所述新 鲜人全血取自于未免疫的人供体，其中所述人生物样品取自的人不是所述未免疫的人供 体，且其中所述新鲜人全血含有不显著影响补体激活或补体活性的抗凝剂。
附图简要说明
图1，A部分显示了补体介导的血清杀菌实验的结果，血清来自用3次剂量的吸附有 氢氧化铝的3组分(5抗原)研究性重组蛋白免疫的36位健康成人(Giuliani等人，PNAS 2006)。图1，B部分显示了测试的两株菌株NZ98/254和S3032的相应OPA滴度≥1∶4的结 果，这两株菌株对免疫后的人血清的SBA相对不敏感。
图2A显示了四株代表性的奈瑟氏脑膜炎球菌株(3株B组，1株C组)与来自健康供 体的全血测试孵育时的存活与生长。数据表明供体没有针对这些菌株的杀菌性抗奈瑟氏菌 抗体。因此，该供体的血液适合在离体人脑膜炎球菌血症模型中用于测试外源测试抗体或 血清的被动保护活性。
图2B显示了离体被动保护杀菌实验(PPA)的结果，用健康未免疫供体的全血进行实 验，在上述全血中已加入SBA滴度＜1∶4的供体的热灭活血清。测试血清的最终稀释度是 1∶4。一份血清在PPA中没有杀菌活性(阴性对照)，而另一份血清来自用奈瑟氏菌OMV 疫苗免疫的个体，尽管该血清具有阴性的SBA滴度，但是在PPA测试中却具有杀菌作用 (阳性对照)。
图3显示了离体被动保护杀菌实验(PPA)的结果，实验使用未免疫供体的全血、保 存的免疫前和免疫后血清(与图1中用的36份血清组相同)、菌株NZ98/254(A部分)和 菌株S3032(B部分)。
图4显示了离体被动保护杀菌实验(PPA)在14位个体的免疫前和免疫后血清上对菌 株NZ98/254(A部分)和S3032(B部分)的重复性。标记1A、2A、3A等的血清代表免 疫前血清。标记1B、2B、3B的血清分别代表免疫后的血清。每个“X”代表一份独立实验 的结果(每份样品进行3次实验)。
图5A显示了PPA测试的结果，实验使用菌株NZ98/254，SBA滴度＜1∶4的血清和SBA 滴度≥1∶4的血清。对于每份血清，3个数据点是不同天进行的3次独立实验的结果。
图5B显示PPA测试的结果，如图5A说明中说述，实验使用SBA滴度＜1∶4的血清和 SBA滴度≥1∶4的血清，和菌株S3032。
图6显示用SBA、OPA和PPA分别测试的血清的结果的比较。
在描述本发明和发明的特定示例性实施方式之前，应理解本发明不限于所描述的特定 实施方式，因为这显然可以变化。还应理解本申请中所用的术语仅旨在描述特定实施方式， 而非意在限制，因为本发明的范围将仅被后附的权利要求所限制。
当提到一个数值范围时，应理解为本发明包括了范围的上限和下限之间的每一个中间 数值以及任何其他在所描述的范围内描述到的数值或者中间数值，所述中间数值小到下限 单位的十分之一，除非上下文内容另有明示。本发明还包括这些可能被独立包括在较小范 围之内的这些较小范围的上限和下限，在所描述到的范围中明确排除的端值除外。当所描 述到的范围包括一个或两个端值时，本发明的范围也包括排除了这些包含在内的端值后的 范围。
除非另有定义，本申请所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术 人员通常理解的含义相同。与本申请所述的相同或等同的方法或材料也可以用于本发明的 操作或测试，但本申请在此描述的为优选的方法和材料。本申请中提及的所有出版物都在 本申请中被参考并入，旨在公开和描述与被引用的出版物相关的方法和/或材料。如果这些 出版物提出的对某术语的定义与本公开中明确或隐含的定义相冲突，应以本公开的定义为 准。
必须注意的是，在本申请中和后附的权利要求中，单数形式“一”、“一个”和“所述” 包括复数对象，除非上下文另有明确指出。因此，例如，“一份样品”的描述包括多份样 品，“细菌”的描述包括一种或多种细菌，等等。
本申清中提供对出版物的讨论仅仅是为其在本申请的申请日之前的公开内容。本申请 中的任何内容不得解释为承认本发明不能通过发明在先的方式而早于这些出版物。而且， 提供的出版日可能与实际出版日不同，可能需要单独进行确认。
示例性实施方式的详细说明
本披露提供了用人新鲜全血作为实验的反应媒介来评估人血清样品中杀菌抗体的方 法。
定义
本申请所用的“杀菌抗体”指的是促进补体介导的杀菌作用的抗体。
术语“保护性免疫”的意思是，给药于哺乳动物的疫苗或免疫方案引发免疫反应，该免 疫反应能预防致病菌如奈瑟氏脑膜炎球菌等引起的疾病、延缓所述疾病进程、或降低所述 疾病的严重程度，或者减少或消除全部疾病症状。保护性免疫可能伴随有杀菌抗体的产生。 应该注意的是，在本领域内，针对奈瑟氏脑膜炎球菌的杀菌抗体的产生被公认为预示疫苗 在人体内产生了保护性效果(Goldschneider等人，1969，J.Exp.Med.129：1307；Borrow等人. 2001 Infect Immun.69：1568)。
“离体”是指在宿主体外，对自然条件改变极少的人工环境中在活组织内或活组织上进 行实验或测试。
“免疫前样品”或“暴露前样品”是指在个体有意暴露于抗原(例如通过将抗原给药于个 体)之前，从个体中获得的样品。
“免疫后样品”或“暴露后样品”是指在个体有意暴露于抗原(例如通过将抗原给药于个 体)之后，从个体中获得的样品。
“补体”是指一类血清蛋白，其能提供功能性补体级联反应，一种促进细菌死亡的生化 级联反应。因此，本申请所用的“补体”是指一类血清蛋白，其能介导与经典途径、旁路 途径或两者均相关的功能性补体级联反应，并且可以进一步包括可以介导甘露糖结合凝集 素途径的血清蛋白。
概述
本披露提供了杀菌活性的离体模型，采用未免疫人供体的新鲜全血，用于检测样品中 的杀菌抗体。因此，本披露提供了利用人全血组分来评价样品中抗体的杀菌活性的系统。 这些实验可以用于检测来自任何来源的杀菌抗体，例如在热灭活血清样品中的杀菌抗体。 特别优选应用本实验在平行实验中检查免疫前血清和免疫后血清中是否存在或缺乏杀菌 抗体。本实验也允许在相同对照的背景下，同时比较用不同疫苗免疫引起的杀菌性抗菌抗 体的滴度，因为所有实验均可用单一供体的血液进行。换句话说，本披露的实验允许在同 样的反应混合物环境中平行测试多个样品，并提供了由人补体系统和其它人血液组分介导 的杀菌活性的离体模型。因为本披露公开的实验可以用于提供样品从血液中清除细菌的能 力的相关信息，对细菌的清除通过补体介导的杀菌活性、调理素吞噬杀菌活性或者两种机 制相结合，因此全血PPA实验在本申请中有时也被称为“离体被动保护实验”。个体实验采 用未免疫的人供体的新鲜全血，其中用不显著影响补体激活或补体活性的抗凝剂处理血 液。这种类型的抗凝剂的例子包括特异性凝血酶抑制剂，如来匹卢定。
虽然本披露讨论了用于检测抗奈瑟氏菌的杀菌抗体的实验，但本申请中提供的方法也 可以用于检测针对任何感兴趣的革兰氏阴性致病菌的杀菌抗体，这些致病菌能被抗体和补 体和/或吞噬细胞杀死。所述细菌可以感染人类、牲畜(例如牛、猪、家禽或鱼等等)。示 例的目标细菌包括奈瑟氏菌、假单胞菌、志贺氏菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、嗜血杆菌、螺 旋体等等。尤其感兴趣的致病菌是那些一旦检测出针对其杀菌抗体的一个临界水平就可以 表明样品来源的个体中对该致病菌的保护性体液免疫反应情况。
检测杀菌性抗奈瑟氏菌抗体的实验方法
在某些实施方式中，本披露提供了检测样品中杀菌性抗奈瑟氏菌抗体的方法和组合物。
未免疫供体的新鲜人全血
本披露的实验采用了未免疫人供体的新鲜全血。在“新鲜人全血”中使用的“新鲜血液” 是指通常保存不超过约6小时、从个体获得后通常不超过约4小时的血液。通常新鲜血液 的保存使得其具有至少90％的原始溶血补体活性。新鲜血液可以在18℃至26℃保存，直 至在实验中使用。在示例的实施方式中，新鲜血液保存在环境温度(室温)中。
“新鲜血液”包括用与本申请中描述的实验兼容的方式处理的血液样品(比如，加入 抗凝剂，或除去IgG，例如通过与蛋白A或蛋白G偶联的小珠孵育，等等)。
如上所述，实验中采用的新鲜人血取自于未免疫的人供体。“未免疫”的供体是指针对 特定感兴趣的细菌没有任何可检测到的杀菌抗体的个体，其中感兴趣的细菌取决于测试样 品中待测试的杀菌抗体的靶细菌(细菌)，通过采用本申请所述的未免疫供体的全血来测 定。“未免疫供体”包括“未感染供体”，其中“未感染”供体是指已知没有被暴露于待测试的 细菌的人。通常，“未免疫供体”是指这样的供体，当其全血与靶细菌菌株在37℃孵育培养 90分钟至4小时的时间后，其血液不能显著杀菌(CFU/ml的降低低于10％)。在某些情况， 在全血实验中，“未免疫供体”的血液在90分钟至4小时孵育期间，CFU/ml血液增加2 个log10数量级、增加1个log10数量级或增加0.5个log10数量级。
未免疫供体的识别通常通过获得供体血液样品，并测试样品中是否存在针对于感兴趣 的细菌的杀菌抗体，例如奈瑟氏菌、奈瑟氏菌属的特定菌株(例如，疫苗的目标)等等。 例如，当被测试的疫苗是用于引发针对菌株A的杀菌抗体时，可以测试未免疫供体的血液 样品中是否存在或缺乏针对菌株A的可检测的杀菌抗体。已知含有针对菌株A的杀菌抗体 的样品可以用作阳性对照。通常，未免疫供体的血液允许感兴趣的细菌的存活或生长，因 为其缺乏针对细菌的可检测或显著的杀菌抗体。
供体样品可以用全血实验、血清杀菌实验、调理素吞噬实验或这些实验的组合或者本 领域所知的其它用于检测杀菌抗体的实验来测试。通常，用全血实验检测在候选未免疫供 体的全血中是否存在或缺乏杀菌抗体。
在某些实施方式中，可以找出与不同样品能产生相似结果的未免疫供体。因此，不同 未免疫个体供体的血液可以用于比较不同的测试样品。例如，在用被动保护实验比较个体 A的免疫前后样品与个体B的免疫前后样品中，第一位未免疫供体的血液可以用于测试个 体A的样品，第二位未免疫供体的血液可以用于测试个体B的样品。
样品
可以测试任何疑似含有杀菌抗体(例如，杀菌性抗奈瑟氏菌抗体)的样品，例如生物 样品，比如取自于个体的(比如，血液或血液组分(比如，血清)，粘膜分泌物等等)，取 自于细胞培养物的(比如，取自于抗体分泌细胞(比如杂交瘤细胞)的上清)。尤其优选 疑似含有杀菌抗体的血清样品。在示例的实施方式中，样品可以来自于用疫苗免疫过的动 物。例如，小鼠、兔、非人灵长动物等等。样品可以来自于感兴趣的个体，尤其优选人。
通常，当样品可能含有补体时(例如，像在血清样品中)，可以处理样品以灭活内源补 体，例如通过加热(例如，在56℃约30分钟)。在反应管中将不同体积(例如100μl、25μl、 10μg或5μl)未稀释的血清加入固定体积的全血中，以实现最终稀释度为1∶4、1∶8或1∶16 的测试血清。样品(例如血清样品)也可以用缓冲液稀释，例如Dulbecco缓冲液等，将固 定体积的稀释后的测试血清加至固定体积的血液中，以便样品以系列稀释进行测试，以帮 助评估抗体滴度。用于测试杀菌抗体的存在或缺失的样品在使用前可以是新鲜的或冷冻 的。当待评价的样品是用来确定疫苗引发杀菌抗体(例如，杀菌性抗奈瑟氏菌抗体)的效 力时，样品可以在个体免疫之前和之后获得，称为“免疫前”和“免疫后”样品。可以平行测 试这样的样品，以便在相同条件下测试这些免疫前和免疫后样品，例如在相同供体的相同 新鲜全血中。
靶细菌
本披露的实验可以用来评价针对任何感兴趣的革兰氏阴性致病菌的杀菌抗体。所述实 验特别适用于评价血清中的杀菌抗体，所述杀菌抗体在本领域中被公认为表明在血清样品 取自的人个体中有保护性免疫反应。特别优选奈瑟氏菌。
例如，当靶细菌是奈瑟氏菌时，任何合适的奈瑟氏菌，特别是表达表面fHbp的奈瑟氏 菌，可以在本申请描述的实验中作为用于检测杀菌抗体的靶细菌。这种奈瑟氏菌包括奈瑟 氏脑膜炎球菌和奈瑟氏淋球菌。可以根据待测试的杀菌抗体的特异性来选择靶细菌。例如， 当实验是用来检测杀菌性抗奈瑟氏脑膜炎球菌抗体时，靶细菌可以是任何合适的奈瑟氏脑 膜炎球菌，例如A组、B组、C组或W-135奈瑟氏脑膜炎球菌或者任何其它感兴趣的有荚 膜组的奈瑟氏脑膜炎球菌、表达特定感兴趣的抗原(例如v.1、v.2或v.3 fHbp，包括fHbp 亚变异体；PorA类型等等)的奈瑟氏脑膜炎球菌菌株。实验可以结合使用经遗传修饰以表 达感兴趣抗原的奈瑟氏菌。例如，可以挑选靶细菌以帮助分析疫苗免疫后杀菌性抗奈瑟氏 菌抗体的产生。
在用于测试前，靶细菌可能用本领域已知的方法培养，例如在液体培养基(例如， Mueller-Hinton液体培养基)中或在琼脂平板(例如，巧克力琼脂平板)上培养。优选在 实验中使用生长至早或中对数期的细菌。如果在琼脂平板上培养，则将细菌移出琼脂平板 并重悬。如果在液体培养基中培养，则将细菌离心并重悬。通常，可以提供需要数量的细 菌，并可以提供不同细胞数量的样品作为对照。例如，细菌被重悬至细菌密度约为105至 108菌落形成单位(CFU)/ml，通常为约5x107CFU/ml。可以选择重悬溶液以便与检测实 验的使用相兼容，例如，缓冲液，通常为加入了MgCl2和CaCl2并含有如牛血清白蛋白(BSA) 等蛋白的HBSS(Hanks基础盐溶液)或磷酸盐缓冲液(PBS)。
在用于实验前，细菌可以洗涤一次或多次以去除培养基的组分。例如，可以用缓冲液 (例如，含有BSA)和/或用热灭活血清(例如，去除IgG，例如以便不含有可检测的IgG) 洗涤细菌。洗涤通常包括将细菌在溶液中重悬，通过离心将细菌细胞沉淀以及将细菌重悬， 例如，用实验中使用的反应混合物缓冲液重悬。
反应混合物
通过以任何合适的顺序混合实验试剂(例如，含抗凝剂的新鲜全血)、测试血清以及奈 瑟氏菌，以制备实验的反应混合物。可以通过在任何合适容器中混合这些组分来制备反应 混合物，如在测试管、微孔板的孔或毛细管等。反应混合物的组分应该充分混合，这可以 用任何合适的方法(例如，通过搅拌)来完成。通常，实验中使用未稀释的热灭活测试血 清、未稀释的血液以及尽可能小体积的包含细菌悬浮物的生理可容性缓冲液，以达到所需 的CFU/ml。目的在于使产生的条件尽可能近似地模拟血清和血细胞各自在全血中浓度。 反应混合物的反应体积可以变化，通常在微升至毫升的级别(例如，50μl、100μl、500μl、 1ml等等)。例如，可以用供体的新鲜全血和测试样品进行实验，其中血液和测试样品的总 体积在微升范围内，比如，约25μl、50μl、75μl、100μl、500μl或1000μl等等。在某些实 施方式中，可以在微孔板中进行实验。在某些实施方式中，实验可以部分或完全自动化。 可以在反应混合物中提供不同的稀释度的测试样品，比如，1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8、1∶10、 1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24或更高等等，优选稀释度1∶64，以及更高。
反应混合物在适合补体介导的杀菌抗体活性的条件下孵育。例如，反应混合物可以孵 育足够长的时间(例如，从约15分钟至90分钟，约30分钟至90分钟等等)，以允许产 生补体介导的杀菌抗体活性，以及可以在合适的温度孵育(例如，环境温度或生理相关的 温度(例如，约37℃))。除了测试样品，还可以提供对照样品。这样的对照样品可以包括 阴性对照样品(例如，和测试样品条件平行，但未加入生物样品或加入没有可检测的杀菌 活性的抗体的样品，等等)和/或阳性对照(例如，和测试样品条件平行，但加入对靶细菌 具有已知杀菌活性的抗体的样品)。
反应混合物可以包含与本申请所描述的实验相兼容的其他组分。例如，可以在来自未 免疫供体的新鲜全血中加入不干抗补体功能的抗凝剂。本领域已知多种这样的抗凝剂，比 如水蛭素(例如，重组水蛭素)、来匹卢定以及本领域已知的其变异体(例如，其中天然 存在的氨基酸被删除、增加或取代的变异体)。因此，在某些实施方式中，本申请所述的 被动保护实验采用不显著影响补体激活或补体活性的抗凝剂，即，不显著抑制或激活补体 激活或补体活性。如肝素或乙二胺四乙酸等抗凝剂会影响补体激活或补体活性。例如，肝 素与多种补体蛋白结合，并因此影响经典和旁路放大途径。肝素能抑制细胞结合放大途径 的C3转换酶的产生，从而抑制一部分补体级联反应。它也通过干扰C3b上的B的结合位 点，而具有补体抑制剂的活性。而且，在C3b存在时它可以阻止D对B的消耗，再次表 明其对C3b有直接作用。因此，在优选的实施方式中，可以不采用例如肝素、EDTA等会 激活或干扰补体激活或补体活性的抗凝剂。
在实验中，可以将来自未免疫供体的新鲜全血、个体的免疫前样品以及靶细菌混合， 同时平行地在单独的样品收集区域(例如，微孔板的单独孔或单独容器)中，将来自同样 未免疫供体的新鲜全血、同样个体的免疫后样品以及靶细菌进行混合。在这样实验的背景 下所用的“平行”的意思包括，在同一时间，以及在未免疫供体的全血仍然新鲜的时间内 制备和测试这种反应混合物，例如，第一份反应混合物的制备可以比第二份混合物的制备 早1小时、2小时、4小时，直到6小时。
本披露的实验适用于测试在疫苗试验中获得的保存的样品。这些样品可以在实验期间 的不同时间点获得，例如，在第一份剂量的疫苗给药前，在第一份剂量给药后1个月、2 个月或3个月，第二份剂量之前和/或之后，等等。这些样品可以是已经被热灭活的血清样 品，样品中的补体被灭活。这样的样品可以是血液组分样品(例如血清或血浆)，其在适 当条件下保存(例如，冷冻的或冻干的)以保存可能存在的任何杀菌抗体。
本申请中公开用来自未免疫供体的新鲜全血进行的实验可以用于测试多个疫苗试验中 获得的样品。使用单一未免疫供体的全血可以提供恒定的背景，以比较一种疫苗和另一种 疫苗的效力。
检测
在与测试样品孵育后，通过评价反应混合物中奈瑟氏菌的存活，可以检测是否存在或 缺乏杀菌性抗奈瑟氏菌抗体。这步的实现可以通过例如，将反应混合物在合适培养基(例 如，琼脂平板)上铺涂，并评估菌落形成单位，将反应混合物在液体培养基中培养并通过 细菌密度、FACS(参见，例如，Mountzouros等人，2000，J.Clin.Microbiol.38：2878-2884) 等来评价细菌生长。杀菌滴度被定义为观察到活的奈瑟氏属菌减少的血清稀释度(例如， 每毫升CFU的减少)，通常是导致与对照相比，存活率降低50％，或0.5个log10数量级， 或1.0个log10数量级(90％降低)或2.0个log10数量级(99％的降低)的稀释度。结 果也可以表示为导致存活率与时间0点的阴性对照的存活率相比，降低50％的血清稀释度。
本领域普通技术人员能够理解，需要将对照反应与实验反应混合物平行进行。例如， 含有高、中和低滴度的已知杀菌抗体的样品可以作为阳性对照测试。另外，应该设置不加 样品的反应混合物，以及加入未免疫个体的血清的反应混合物。
疫苗开发
本申请公开的实验也可以用来筛选能够预防或改善细菌感染的候选疫苗。通常，“疫苗” 是一种试剂，在给药后能帮助宿主提高其针对目标病原体的免疫反应。引起的体液、细胞 或体液/细胞免疫反应可以帮助抑制由该开发疫苗针对的病原体引起的感染。特别优选的是 能引起抑制奈瑟氏菌(例如奈瑟氏脑膜炎球菌、奈瑟氏淋球菌以及类似菌)的感染和/或复 制的保护性免疫反应的预防性疫苗。还优选能对攻毒提供保护的治疗性疫苗，例如通过产 生杀菌性抗奈瑟氏菌抗体。
可以通过多种方式完成候选疫苗的筛选，例如，收集个体的免疫前样品，给药候选疫 苗以及收集个体的免疫后样品。候选疫苗可以通过一次单剂量给药(例如，腹腔内或肌肉 内注射，口服)，随后可任选地进行一次或多次加强免疫。可以通过检查抗体反应来评价 免疫反应的引发情况，例如，用传统实验和本申请所描述的实验。本申请中所述的离体被 动保护杀菌实验可以用来同时测定多个候选疫苗免疫前样品和免疫后样品中杀菌性抗菌 抗体的滴度。由于可以用小体积(在微升范围)的新鲜血液进行实验，可以使用单一供体 作为整个筛选的全血来源。使用单一供体可以为本实验提供更好的重现性以及恒定的背 景。而且，因为本实验可以仅用小体积完成，可以仅用相对小体积的单一未免疫供体的新 鲜全血(例如，0.2ml、1ml、10ml、50ml、100ml等等)来完成平行的多组实验。
实施例
下列提供的实施例是为了进一步展示本发明的优势和特点，而非意在限制本发明的范 围。尽管它们代表了那些可以使用的方案，但也可以选择使用本领域普通技术人员所知的 其它规程、方法或技术。
材料与方法
血清样品。保存的血清样品由Novartis Vaccines提供，来自于研究性3组分(五抗原) 重组疫苗(GNA 2091，fHbp变异体1，GNA 2132，GNA1030和NadA)(Chiron Vaccines， Emeryville CA(现为Novartis Vaccines，Cambridge MA)(Giuliani，M.M等人.2006，Proc NatlAcad Sci USA 103(29)：10834-9)的I期临床实验。这些血清来自于年龄为18至50 岁的36位个体。疫苗的剂量为每份剂量60μg的每种单个蛋白(总量为180μg)，用氢氧化 铝吸附(每份注射剂量的总量为1.65mg)。个体给予3份剂量，每份间隔1个月。在免疫 前(免疫前的血清)和第三份剂量后1个月(第三次免疫后的血清)获取血清样品。血清 在56℃加热30分钟，以灭活内源补体。在SBA、OPA和PPA中使用的最终血清稀释度 为1∶4。
奈瑟氏属脑膜炎球菌菌株。使用3株B组菌株H44/76-SL(B.15.P1.7，16，ST-32)、 NZ98/254(B：4；P1.7-2，4和ST 41/44复合型)以及S3032(B：19，7：P1.12，16，ST型，ST-6875)。 H44/76-SL菌株来源于挪威的一次疫情(Bjune等人.1991，NIPH Ann 14(2)：125-30； Fredriksen，等人.1991，NIPH Ann 14(2)：67-79)。该菌株H44/76-SL(菌种号)被称为H44/76。 NZ98/254(B：4；P1.7-2，4和ST 41/44复合型)来自新西兰最近的一次疫情(Dyet和Martin， 2006，Epidemiol Infect 134(2)：377-83)。S3032(B：19，7：P1.12，16，ST型，ST-6875)来自于 美国的一位住院病人(Frasch等人.1985，Rev Infect Dis 7(4)：504-10)。至于疫苗中的3 个主要抗原，H44/76测试菌株高表达变异体1组中的fHbp，其与疫苗中fHbp具有相同的 氨基酸序列，而NZ98/254菌株相对低表达fHbp v.1的亚变异体，其与疫苗中的相差少数 几个氨基酸(Welsch和Granoff，2004，Infect Immun 72(10)：5903-9；Welsch等人.2008，J Infect Dis 197(7)：1053-61)。第三株测试菌株S3032表达天然存在的变异体2和3组的 fHbp的嵌合体(Genbank登录号EU921901)。所有三株菌株都具有编码GNA2132的基因。 NZ98/254和H44/76菌株表达的GNA2132蛋白具有同源的63个氨基酸的肽，该片段也存 在于重组疫苗的抗原中，但不存在与于菌株S3032的GNA 2132中(Welsch和Moe，2003，J Infect Dis 188(11)：1730-40)。NZ98/254、H44/76和S3032的GNA2132的Genbank登录 号分别是AY315196、AF226436和AY315192。三株菌株都没有NadA基因。
血清杀菌实验(SBA)。本实验按照别处所述的方法进行，用早对数期、液体培养基生 长的奈瑟氏脑膜炎球菌和人补体进行(Plested和Granoff，2008，Clin Vaccine Immunol 15(5)： 799-804；Welsch等人.2008，J Infect Dis 197(7)：1053-61)。补体来源于健康成人的未免疫 血清，该健康成人具有正常总溶血补体活性，并且没有针对每株测试菌株的可检测的血清 杀菌抗体。通过插值提供50％存活率的稀释度来确定血清滴度。注意，与阴性对照血清和 补体孵育的细菌通常在60分钟的孵育期间内表现出CFU/ml百分之150至250的升高。
调理素吞噬杀菌实验(OPA)。用热灭活的测试血清、对数期活细菌(和与SBA同样 的方法制备)、新鲜纯化的人供体PMN(三个供体，不同的FcγRIIA受体，根据PCR测定) 以及外源人补体进行OPA实验。实验过程如前人描述(Plested和Granoff，2008，如前)，但 补体来源用C6-充足的血清而不是C6-去除的血清。阳性OPA滴度定义为，在反应混合物 中孵育1小时后，与阴性对照时间零点(0)相比CFU/ml减少50％。
离体被动保护实验(PPA)。用含有重组水蛭素(来匹卢定，27.8μg/ml终浓度)作为抗 凝剂的注射器获取健康成人的新鲜血液。血液供体的来源与SBA和OPA中人补体来源的 血清供体相同。在微孔板的每一孔中加入65μl血液、25μl测试血清以及10μl含有15％已 加热补体、1％牛血清白蛋白(Equitech)和约4000CFU的PBS缓冲液。阳性对照是相关 抗PorA单克隆抗体(NIBSC，P1.4或P1.12)和针对各个测试菌株具有高、中或低OPA 和SBA的人血清样品。阴性对照血清是补体供体的热灭活血清或仅缓冲液。微孔板在37℃， 5％CO2条件下孵育90分钟，同时在MS 3数字迷你振荡器(IK，Wilmington，NC)上以 500振幅/分钟震荡而完全混匀组分。将样品从孔中移出，在巧克力琼脂平板上在37℃， 5％CO2的条件下孵育进行定量培养。
接下来的一天确定CFU/ml，结果计算为在90分钟时的CFU/ml与阴性对照测试血清 在0时间点相比的log10数量级变化。根据不同天进行的重复实验的重现性(见结果)，我 们将阳性PP活性定义为相比于时间0点，CFU/ml降低了≥0.5个log10数量级的血清(即， CFU/ml降低约70％)。所有实验都做两个复孔，报告结果来源于至少3次进行的独立实验。
实施例1：SBA和OPA测定保存血清的杀菌活性
用SBA和OPA实验测试用3份剂量的3组分疫苗(五抗原疫苗，见材料与方法)免 疫的36位健康成人的保存的免疫前和免疫后血滴。OPA按照前人描述的方法进行(Plested 和Granoff，2008，Clin Vaccine Immunol 15(5)：799-804)，但是使用C6充足(也就是非去 除的)的补体而不是C6-去除的补体。图1，A部分显示用3组分(五抗原)疫苗免疫之 前和之后，具有保护性SBA滴度≥1∶4的个体的比例。测试了血清针对菌株H44/76、NZ98/254 和S3032的血清杀菌活性。图1，B部分显示用3组分(五抗原)疫苗免疫之前和之后， 具有保护性OPA滴度≥1∶4的个体的比例。测试了针对菌株NZ98/254和S3032的调理素吞 噬活性。
实施例2：鉴定未免疫个体
测试健康供体的血液中是否存在针对5株菌株：MC58、H44/76、4243、NZ98/254和 S3032的杀菌性抗奈瑟氏菌抗体。所用的供体就是在图1所示的SBA和OPA结果中血清 来源的供体。
图2A显示用新鲜全血和菌株MC58、H44/76、4243和NZ98/254进行的全血杀菌实验 (WBA)的结果。加入重组水蛭素作为抗凝剂。在接种测试菌株后，在0、1、2、3小时 取样接种血液的样品，并确定菌落形成单位(CFU)/ml。每一株菌株在全血中的生长表明， 该供体对于这些菌株是未免疫的或未感染的，因为供体缺乏针对这些菌株的杀菌抗体。取 决于测试的菌株，约13至60％的供体是未免疫的(Welsch和Granoff，2007，Clin Vaccine Immunol 14：1596-1602)。
图2B显示用新鲜全血和菌株NZ98/254和S3032进行的离体被动保护菌血症实验 (PPA)的结果。将重组水蛭素加入血液中作为抗凝剂。一份血清在PPA中没有杀菌活性 (阴性对照)，而另一份用奈瑟氏菌OMV疫苗免疫的个体的血清在PPA实验中具有细菌 杀伤作用(阳性对照)，虽然其SBA滴度为阴性。血清被热灭活并以1∶4的血清稀释度加 入全血中。在接种测试菌株后，在0和1.5小时从接种血液中取样，并确定CFU/ml。
实施例3：保存血清的离体被动保护菌血症实验(PPA)。
用本披露的示例的离体被动保护杀菌实验(PPA)，测试用3份剂量的3组分疫苗(五 抗原疫苗，见材料与方法)免疫的36位健康成人的保存的免疫前和免疫后血清。根据材 料和方法中的描述，测试这些血清针对菌株NZ98/254和S3032的杀菌活性。这些菌株对 血清杀菌活性和调理素吞噬活性相对不敏感。用来源于实施例2中鉴定的未免疫供体的全 血对每一份血清进行1∶4稀释。在含有未免疫供体的全血和测试血清的反应混合物中接种 测试菌株，在0和1.5小时取样，并确定CFU/ml。对于菌株NZ98/254，36份免疫前血清 的CFU/ml的平均log10数量级变化是-0.12个log10数量级，免疫后获得的对应血清则增 加至-1.0个log10数量级(P＜0.001)。菌株S3032的CFU/ml的相应log10数量级改变为， 免疫前-0.59至免疫后-1.69(P＜0.001)。
实施例4：离体被动保护杀菌实验(PPA)是可重复的。
36位个体中的14位的保存的免疫前和免疫后血清样品用PPA在1至3个月内的不同 时间点进行测试。全血来源于实施例2中鉴定的未免疫供体。每一份热灭活血清用新鲜全 血进行1∶4稀释。14位个体的血清从1标记到14，其中A表示免疫前血清而B表示免疫 后血清。阳性PPA定义为，在细菌接种后1.5小时，其CFU/ml与阴性对照在时间0点相 比降低0.5个log10数量级。图4，A部分和B部分显示菌株NZ98/254和S3032各自的PPA 结果。每份血清测3次。在三次独立条件下进行的三次独立实验中，除了血清1A针对菌 株S3032的实验之外，其他测试的血清的结果都是可重复的。
实施例5：3组分疫苗免疫的个体的血清的离体被动保护菌血症实验(PPA)。
用SBA和PPA对3组分疫苗免疫个体的血清在菌株NZ98/254上进行测试。在三次独 立条件下，进行三次独立的PPA实验。用PPA测试SBA滴度＜1∶4的个体。图5A，A部分 显示，PPA结果表明SBA滴度＜1∶4的某些个体具有针对菌株NZ98/254的杀菌性抗奈瑟氏 菌抗体。B部分显示，PPA结果表明SBA滴度＜1∶4的某些个体没有针对菌株NZ98/254的 杀菌性抗奈瑟氏菌抗体。C部分是用SBA滴度≥1∶4的血清进行PPA实验测得的杀菌活性。 A部分和C部分的比较显示，PPA能够测试SBA滴度＜1∶4的杀菌活性，也能测试SBA滴 度≥1∶4的杀菌活性，因为这两种SBA滴度的log10数量级改变的量级差不多。
用SBA和PPA对3组分疫苗免疫个体的血清在菌株S3032上进行测试(图5B)。在三 次独立实验中进行PPA实验。对于SBA滴度＜1∶4且呈阳性PPA的个体，其在全血测试中 CFU/ml的log10数量级改变与用SBA滴度≥1∶4的血清观察到的值在相同数量级(图5B， 将A部分与C部分比较)。
实施例6：SBA、OPA和PPA的比较
用SBA、OPA和PPA测试用3份剂量的3组分疫苗(五抗原疫苗，见材料与方法)免 疫的36位健康成人的保存的免疫前和免疫后血清。每次试验中血清以1∶4稀释。阳性SBA 或OPA滴度定义为，在与细菌培养1小时后的CFU/ml与时间0点相比降低50％。阳性 PPA定义为，在与细菌培养1.5小时后的CFU/ml与时间0点相比降低0.5个log10数量级。 如图6所示，PPA比SBA和OPA都更敏感。在免疫后血清中，针对两株测试菌株NZ98/254 和S3032的阳性PPA比SBA滴度≥1∶4的频率高2-3倍。同样，针对测试菌株NZ98/254和 S3032的阳性PPA比OPA滴度≥1∶4的频率分别高1.5-2倍。用人补体和人PMN检测到调 理素吞噬杀菌滴度≥1∶4的免疫后血清，比SBA滴度≥1∶4的血清多10％到50％。因此，对 于检测杀菌抗体，用调理素吞噬杀菌活性检测可能比用血清杀菌活性更敏感，但是调理素 吞噬实验的增量优势没有预期的大。