技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药组合物及其制备方法，和含有上述中药组合物的中药制剂。
背景技术
胰岛素抵抗(insulin resistance；IR)是指各种原因使胰岛素作用的靶组织(主要为肝、脂肪、骨骼肌、血管内皮细胞等)对胰岛素促进其摄取和利用的效率和作用降低，在早期，胰岛β细胞为使血糖仍维持正常而代偿分泌过多的胰岛素(即高胰岛素血症)。
胰岛素抵抗普遍存在于多种生理和病理状态中，在青年期、老年期、妊娠期，均可有不同程度的胰岛素敏感指数降低即IR。正常人群中仅有15％-20％存在IR，但体重增加、血糖增高、血压增高、血脂紊乱、高尿酸血症时，IR的发生率和程度均显著增加。
胰岛素抵抗是2型糖尿病的基本特征，是代谢综合征的中心环节，也是肥胖、血脂紊乱、血管内皮功能紊乱、心血管疾病和血液高黏状态的病理基础。
正常水平的胰岛素在体内有促进糖原、脂肪和蛋白质合成，促进葡萄糖利用和能量生成、抑制脂肪分解、加强细胞增殖和分化、维持内皮细胞功能、抑制脂肪酶从而抗脂解等多方面的作用。
发生胰岛素抵抗，胰岛素的生物学作用减弱，使得人体组织对一定量的胰岛素的生物学反应低于预计正常水平，最终导致肌肉及脂肪的糖利用减少，肝脏糖异生增加，脂肪细胞释放游离脂肪酸增加，从而出现血糖、血脂异常；高浓度的胰岛素长时间作用于血管内皮细胞，可导致舒张血管的物质减少，收缩血管的物质如内皮素(ET)等合成分泌增加，从而出现血压异常(陈临溪，秦旭平，黄秋林等，血管内皮细胞药理与临床，人民军医出版社，2012，P164-166.)；高水平的胰岛素使血浆组织型纤溶酶原激活物的抑制剂合成和释放增加，抑制纤维蛋白降解，从而促进血栓形成(杨生，徐晓光，岳桂英等，藻酸双酯钠对2型糖尿病患者血脂血流变及胰岛素抵抗的影响，中国实用内科杂志，2004,24(3)：183.)；长期的血液高胰岛素水平可导致血液粘滞度升高(龙建军，赵爱婷，骆秉铨等，高血压病胰岛素抵抗与微循环障碍关系的综合研究，中国血液流变学杂志，2001，11(2)：111-114.)。
出现胰岛素抵抗与相关基因的表达异常密切相关。胰岛素与其受体结合后，信号向细胞内传导并逐级放大，使胰岛素发挥代谢调节作用。胰岛素受体底物-1(IRS-1)和胰岛素受体底物-2(IRS-2)在胰岛素信号转导过程中起着重要作用，当IRS-1和IRS-2发生基因突变或表达异常时，可导致胰岛素信号在细胞内转导受阻而引起胰岛素抵抗；葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)存在于肌肉和脂肪细胞中，在胰岛素作用下IRS-1磷酸化，使GLUT4转位到细胞浆膜，加速葡萄糖的易化转运过程，使肌肉对葡萄糖摄取增加。GLUT4表达异常或转位受阻，可导致受体后胰岛素抵抗；葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)的数量减少或活性降低，可降低肝葡萄糖摄取，增加肝糖原的输出(胰岛素抵抗)(王吉耀，内科学，人民卫生出版社，2008，P974-975)。过氧化物酶增殖体活化受体γ(PPAR-γ)主要表达于脂肪组织，调节脂肪细胞的分化和增殖。PPAR-γ的活化能抑制脂肪组织分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)，阻断TNF-α在信号转导途径中对胰岛素受体及胰岛素受体底物磷酸化的抑制作用，有利于改善胰岛素抵抗。β3肾上腺素能受体(β3AR)主要调节机体的脂肪分解和产热过程，低表达的β3AR可导致脂肪组织产热减少，造成脂肪蓄积。脂质在细胞内滞留，引起内脏脂肪增加，造成内脏性肥胖，引起胰岛素抵抗(安雅莉，李光伟等，β3肾上腺素能受体基因多态性与胰岛素抵抗、肥胖，中日友好医院学报，2004，18(6)：366-368.)。
目前临床上治疗胰岛素抵抗主要应用胰岛素增敏剂。二甲双胍通过肝细胞膜G蛋白恢复胰岛素对腺苷酸环化酶的抑制，减少肝糖原异生及输出，促进无氧糖酵解，增加肌肉等外周组织对葡萄糖的摄取和利用，抑制或延缓葡萄糖在胃肠道的吸收等改善糖代谢。但服用二甲双胍可能会出现诸多副作用如胃肠道反应、过敏反应等，严重者可能诱发乳酸性酸中毒；对血清胰岛素水平显著升高者、有酮症酸中毒倾向者、严重缺氧、心衰、严重肝病、肾病者不适合用二甲双胍。噻唑烷二酮类药物可增加胰岛素在外周组织的敏感性，减轻胰岛素抵抗，是一种胰岛素增敏剂。噻唑烷二酮类药物不适用于胰岛素绝对缺乏、酮症酸中毒、严重和急性心衰患者；常见副作用有头痛、头晕、乏力、恶心、腹泻、轻中度贫血、水肿、体重增加、高胆固醇血症等，部分患者可能会出现肝损伤。
而且，目前临床在治疗以胰岛素抵抗为中心的疾病过程中，由于胰岛素抵抗的发生同时伴随多种相关疾病(如高胰岛素血症、糖尿病、高血压、高血脂、代谢综合征、高尿酸血症、血粘度增高等)，需要同时服用降压药、降糖药、降脂药、抗血栓药、甚至使用胰岛素等，服药种类繁多，用药量大，且多数为西药，毒副作用较多，尤其是胃肠道反应和肝肾功能损害。另外，现有药物需长期服用，治疗费用昂贵。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种毒副作用小、价格低的中药组合物，可以同时治疗胰岛素抵抗及其相关疾病，起到一药治疗多病的作用。
本发明所要解决的技术问题还在于，提供制备上述中药组合物的方法。
本发明所要解决的技术问题还在于，提供含有上述中药组合物的中药制剂。
为达到上述技术效果，本发明提供了一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药组合物，所述中药组合物主要由以下重量配比的中药原料制成：
山楂 100-300，
制何首乌 90-300，
白芍 120-360，
丹参 100-500。
作为上述方案的改进，所述中药组合物主要由以下重量配比的中药原料制成：
山楂 180-240，
制何首乌 180-240，
白芍 120-300，
丹参 120-360。
相应地，本发明还提供了一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药组合物的制备方法，包括：
A、按配方取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加以粉碎；
B、用甲醇、乙醇或丙酮进行提取并浓缩，得到第一提取液；
C、将提取后的药渣用水提取并浓缩，得到第二提取液；
D、将第一提取液、第二提取液合并。
作为上述方案的改进，所述步骤B包括：
加入6-10倍量、浓度为60-80％的甲醇、乙醇或丙酮浸泡20-40min；
回流提取1-3次，每次1-3h；
合并提取液并减压浓缩回收溶剂，得到第一提取液。
作为上述方案的改进，所述步骤B包括：
加入8倍量、浓度为70％的甲醇、乙醇或丙酮浸泡30min；
回流提取2次，每次2h；
合并提取液并减压浓缩回收溶剂，得到第一提取液。
作为上述方案的改进，所述步骤C包括：
将提取后的药渣用6-10倍量水浸泡20-40min；
水提1-3次，第一次45-75min，第二次30-60min；
合并提取液并减压浓缩，得到第二提取液。
作为上述方案的改进，所述步骤C包括：
将提取后的药渣用8倍量水浸泡30min；
水提2次，第一次60min，第二次45min；
合并提取液并减压浓缩，得到第二提取液。
相应地，本发明还提供了另一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药组合物的制备方法，包括：
A、按配方称取山楂、制何首乌、白芍、丹参；
B、加水没过药材，浸泡20-40min；
C、加热至水开，小火继续煎煮10-30min，过滤，得到第一药液；
D、继续加水没过药材，水开后小火继续煎煮10-30min，过滤，得到第二药液；
E、合并第一药液、第二药液。
相应地，本发明还提供一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药制剂，所述中药制剂含有上述任一项中药组合物。
作为上述方案的改进，所述中药制剂为汤剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂或丸剂。
实施本发明具有如下有益效果：
本发明中药组合物的成分为山楂、制何首乌、白芍、丹参等药物的活性成分，通过对该组合物的药效及作用机制研究发现，其可以同时治疗胰岛素抵抗及其相关疾病，起到一药治疗多病的作用，而且毒副作用小、价格低，具体如下：
一、本发明的组合物药效作用显著，对胰岛素抵抗及其相关疾病有较好的治疗作用。本发明作用机制明确，研究发现该组合物靶向作用于糖、脂代谢的相关通路，通过调控胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2基因的表达，提高机体对胰岛素的敏感性；通过上调葡萄糖转运蛋白GLUT2、GLUT4mRNA的表达，促进机体对葡萄糖的摄取，增加机体对葡萄糖的消耗；通过上调PPAR-γ、β3AR mRNA的表达，促进脂肪细胞的分解代谢；从基因水平起到防治胰岛素抵抗的作用。同时，该组合物还具有改善血液流变学，降低内皮素-1(ET-1)水平，起到防治血栓形成和保护血管内皮功能的作用。该组合物通过多个方面起到治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的作用。
二、本发明以改善胰岛素抵抗为中心，通过调节与胰岛素抵抗相关的信号通路，以治疗胰岛素抵抗为出发点，进而起到治疗与胰岛素抵抗相关的高胰岛素血症、糖尿病、高血压、高血脂、代谢综合征、高尿酸血症、血粘度增高等多种疾病，达到“一药多病”的效果，提高患者依从性，减轻患者的经济和生理负担。
三、本发明为中药制剂，药物组成简单，服用量小，并经药效实验验证对胰岛素抵抗及其相关疾病有明显的治疗作用，毒副作用小。
四、本发明是天然植物药材的提取物，原料药价格低廉，来源广泛，提取工艺简单，可实现大规模的工业化应用。
附图说明
图1是本发明中药组合物的制备方法一实施例的流程图；
图2是本发明中药组合物的制备方法另一实施例的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
本发明提供了一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药组合物，所述中药组合物主要由以下重量配比的中药原料制成：
山楂 100-300，
制何首乌 90-300，
白芍 120-360，
丹参 100-500。
其中，本发明所述的胰岛素抵抗相关疾病，是指由胰岛素抵抗引起的相关疾病，如高胰岛素血症、糖尿病、高血压、高血脂、代谢综合征、高尿酸血症、血粘度增高等。
优选地，所述中药组合物主要由以下重量配比的中药原料制成：
山楂 180-240，
制何首乌 180-240，
白芍 120-300，
丹参 120-360。
山楂，性温，味酸、甘，归脾、胃、肝经，功能健胃消食化滞、行气活血散瘀。现代药理研究发现，山楂主要含有黄酮类成分，包括金丝桃甙、槲皮素、黄酮聚合物；有机酸类，包括柠檬酸、山楂酸等，还含有内酯、糖类及甙类等。现代药理研究发现山楂具有促进脂肪消化、保护心脏、降压、降脂、抗氧化提高免疫力、抗菌、抗肿瘤等作用。
制何首乌，味苦、甘、涩，性温，归肝、心、肾经。功能补肝肾、益精血、乌须发，强筋骨。现代药理研究发现何首乌的主要成分有磷脂、蒽醌类、葡萄糖甙类、没食子酸及多种微量元素。具有调节内分泌功能、提高机体免疫力、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化保肝等作用。
白芍味苦、酸，性微寒。归肝、脾经。功能平肝止痛、养血调经、敛阴止汗。主要成分有芍药苷、牡丹酚、黄酮、单萜、三萜及其苷类化合物。现代药理研究发现具有保肝、镇痛、抗炎、调节免疫力、镇静、抗菌抗病毒等作用。
丹参，味苦，性微寒，归心、肝经。功能祛瘀止痛、活血通经、清心除烦。主要药理成分有丹参酸、丹酚酸、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮I、异丹参酮I等40余种现代药理学研究发现丹参具有抗血栓、改变血液流变性、抗心肌缺血、抗菌、抗炎抗肿瘤等作用。
在临床应用中，本发明中药组合物的用药剂量为0.4-3g·kg-1·d-1。优选的，中药组合物的用药剂量为0.6-2g·kg-1·d-1。
需要说明的是，本发明所述的中药原料可被具有相同或相似功能的中药所替代，并且这些药材均可按照《中国药典》或《中药大辞典》中方法炮制。
相应地，参见图1，本发明还提供了一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药组合物的制备方法，包括：
S101、按配方取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加以粉碎；
山楂、制何首乌、白芍、丹参组成的中药组合物以重量份计的配方如下：
山楂 100-300份，
制何首乌 90-300份，
白芍 120-360份，
丹参 100-500份。
优选地，山楂、制何首乌、白芍、丹参组成的中药组合物以重量份计的配方如下：
山楂 180-240份，
制何首乌 180-240份，
白芍 120-300份，
丹参 120-360份。
S102、用甲醇、乙醇或丙酮进行提取并浓缩，得到第一提取液；
作为步骤S102一优选的实施方式，包括：
加入6-10倍量、浓度为60-80％的甲醇、乙醇或丙酮浸泡20-40min；
回流提取1-3次，每次1-3h；
合并提取液并减压浓缩回收溶剂，得到第一提取液。
作为步骤S102更佳的实施方式，包括：
加入8倍量、浓度为70％的甲醇、乙醇或丙酮浸泡30min；
回流提取2次，每次2h；
合并提取液并减压浓缩回收溶剂，得到第一提取液。
作为步骤S102最佳的实施方式，包括：
加入8倍量、浓度为70％的乙醇浸泡30min；
回流提取2次，每次2h；
合并提取液并减压浓缩回收溶剂，得到第一提取液。
S103、将提取后的药渣用水提取并浓缩，得到第二提取液；
作为步骤S103一优选的实施方式，包括：
将提取后的药渣用6-10倍量水浸泡20-40min；
水提1-3次，第一次45-75min，第二次30-60min；
合并提取液并减压浓缩，得到第二提取液。
作为步骤S103更佳的实施方式，包括：
将提取后的药渣用8倍量水浸泡30min；
水提2次，第一次60min，第二次45min；
合并提取液并减压浓缩，得到第二提取液。
S104、将第一提取液、第二提取液合并。
优选的，将第一提取液、第二提取液合并浓缩至浸膏。
本发明是天然植物药材的提取物，原料药价格低廉，来源广泛，提取工艺简单，可实现大规模的工业化应用。
需要说明的是，图1所示的制备方法中所述的甲醇、乙醇或丙酮，是指甲醇、乙醇、丙酮或它们的水溶液。
相应地，参见图2，本发明还提供了另一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药组合物的制备方法，包括：
S201、按配方称取山楂、制何首乌、白芍、丹参。
山楂、制何首乌、白芍、丹参组成的中药组合物以重量份计的配方如下：
山楂 10-30份，
制何首乌 9-30份，
白芍 12-36份，
丹参 10-50份。
优选地，山楂、制何首乌、白芍、丹参组成的中药组合物以重量份计的配方如下：
山楂 12-24份，
制何首乌 12-24份，
白芍 18-30份，
丹参 15-36份。
S202、加水没过药材，浸泡20-40min；
优选地，加水没过药材，浸泡30min。
S203、加热至水开，小火继续煎煮10-30min，过滤，得到第一药液；
优选地，加热至水开，小火继续煎煮15min，过滤，得到第一药液。
S204、继续加水没过药材，水开后小火继续煎煮10-30min，过滤，得到第二药液；
优选地，继续加水没过药材，水开后小火继续煎煮15min，过滤，得到第二药液。
S205、合并第一药液、第二药液。
相应地，本发明还提供一种治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的中药制剂，所述中药制剂含有上述任一实施例的中药组合物。
所述中药制剂为汤剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂或丸剂。
为使上述剂型得以实现，需在制备过程中加入药物制剂中可以使用的辅料：如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂等。填充剂包括：淀粉、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、蔗糖、木糖醇等；崩解剂包括：淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素钠等；润滑剂包括：滑石粉、二氧化硅、十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、琼脂、羟甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿司帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、苯扎溴铵、醋酸氯已定、桉叶油、山梨酸及其盐类等。
需要说明的是，所述中药制剂所含有的中药组合物，以及该中药组合物的制备方法与前述一致，在此不再赘述。
下面以具体实施例进一步阐述本发明
实施例1
本发明药物胶囊剂的制备
配方：山楂200g、制何首乌180g、白芍240g、丹参300g
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入8倍量70％乙醇浸泡30min，回流提取2次，2h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用8倍量水浸泡30min，水提两次，第一次1h，第二次45min，合并提取液，将提取液合并，喷雾干燥，加入1％硬脂酸镁，装入胶囊制成1000粒胶囊。
实施例2
本发明药物片剂的制备
配方：山楂180g、制何首乌240g、白芍300g、丹参240
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入8倍量70％乙醇浸泡30min，回流提取2次，2h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用8倍量水浸泡30min，水提两次，第一次1h，第二次45min，合并提取液，将提取液合并，喷雾干燥，加入1％硬脂酸镁，压片制成1000片药片。
实施例3
本发明药物颗粒剂的制备
配方：山楂180g、制何首乌300g、白芍360g、丹参120
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入8倍量70％乙醇浸泡30min，回流提取2次，2h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用8倍量水浸泡30min，水提两次，第一次1h，第二次45min，合并提取液，将提取液合并，喷雾干燥，加入可溶性淀粉，制成颗粒剂。
实施例4
本发明药物浓缩丸的制备
配方：山楂240g、制何首乌240g、白芍180g、丹参360g
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入8倍量70％乙醇浸泡30min，回流提取2次，2h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用8倍量水浸泡30min，水提两次，第一次1h，第二次45min，合并提取液，将提取液合并，浓缩至浸膏，加入糊精，制成浓缩丸。
实施例5
本发明汤剂的制备
配方：山楂12g，制何首乌12g，白芍18g，丹参15g
制备方法：称取上述药材，加水没过药材，浸泡30min，加热至水开，小火继续煎煮15min，过滤，继续加水没过药材，水开后小火继续煎煮15min，合并药液即得。
实施例6
本发明药物胶囊剂的制备
配方：山楂100g、制何首乌90g、白芍120g、丹参100g
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入7倍量60％甲醇浸泡35min，回流提取2次，2h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用7倍量水浸泡25min，水提两次，第一次1h，第二次45min，合并提取液，将提取液合并，喷雾干燥，加入1％硬脂酸镁，装入胶囊制成1000粒胶囊。
实施例7
本发明药物片剂的制备
配方：山楂260g、制何首乌200g、白芍200g、丹参280
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入6倍量80％乙醇浸泡20min，回流提取2次，3h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用6倍量水浸泡20min，水提两次，第一次45min，第二次30min，合并提取液，将提取液合并，喷雾干燥，加入1％硬脂酸镁，压片制成1000片药片。
实施例8
本发明药物颗粒剂的制备
配方：山楂300g、制何首乌300g、白芍360g、丹参500
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入10倍量60％丙酮浸泡10min，回流提取3次，3h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用10倍量水浸泡40min，水提3次，第一次75min，第二次60min，合并提取液，将提取液合并，喷雾干燥，加入可溶性淀粉，制成颗粒剂。
实施例9
本发明药物浓缩丸的制备
配方：山楂250g、制何首乌220g、白芍200g、丹参320g
制备方法：称取山楂、制何首乌、白芍、丹参，加入8倍量70％乙醇浸泡30min，回流提取2次，2h/次，合并提取液并浓缩；将药渣用8倍量水浸泡30min，水提两次，第一次1h，第二次45min，合并提取液，将提取液合并，浓缩至浸膏，加入糊精，制成浓缩丸。
实施例10
本发明汤剂的制备
配方：山楂13g，制何首乌13g，白芍20g，丹参16g
制备方法：称取上述药材，加水没过药材，浸泡20min，加热至水开，小火继续煎煮10min，过滤，继续加水没过药材，水开后小火继续煎煮10min，合并药液即得。
实施例11
本发明汤剂的制备
配方：山楂15g，制何首乌15g，白芍25g，丹参20g
制备方法：称取上述药材，加水没过药材，浸泡40min，加热至水开，小火继续煎煮20min，过滤，继续加水没过药材，水开后小火继续煎煮20min，合并药液即得。
实施例12
本发明汤剂的制备
配方：山楂20g，制何首乌20g，白芍30g，丹参25g
制备方法：称取上述药材，加水没过药材，浸泡40min，加热至水开，小火继续煎煮20min，过滤，继续加水没过药材，水开后小火继续煎煮20min，合并药液即得。
下面结合实验数据对本发明做进一步阐述，本发明以山楂、制何首乌、白芍、丹参为原料药，并由上述制备方法制得，以下简称SHBD，其药效作用及研究实例如下：
Ⅰ、SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型的影响
一、实验材料
细胞：HepG2细胞株，中山大学附属肿瘤医院赠予。
动物：SD雄性大鼠，SPF级，体重180～220g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)0105817。
药物:中药组合物SHBD：山楂，康美药业股份有限公司(生产批号：120304861)；制何首乌，康美药业股份有限公司(生产批号：111203551)；白芍，康美药业股份有限公司(生产批号：120205421)，丹参，广州市岭南中药饮片有限公司(生产批号：091008)
盐酸二甲双胍片，中美上海施贵宝制药有限公司(生产批号：1204101)
辛伐他汀片片，杭州默沙东制药有限公司(生产批号：110593)。
试剂：RPMI 1640培养基，Hyclone；胎牛血清，GIBCO；0.25％的胰酶，Hyclone；胰岛素，Sigma；葡萄糖检测试剂盒，宁波美康生物科技有限公司；G6Pase ELISA试剂盒。
仪器：二氧化碳细胞培养箱，Thermo；IX71+DP72型倒置显微成像系统，Olympus；ST16R冷冻型通用台式离心机，Thermo；电热恒温水浴锅，上海百典仪器设备有限公司；酶标仪，Bio-Rad；超微量多功能自动生化分析仪，Trilogy；智能恒温数显电热套，河南爱博特科技发展有限公司；旋转蒸发仪，IKA；
二、实验方法
(一)药液提取及浓缩
药液：按本发明上述具体实施方式制得，定容至0.864g·ml-1。
二甲双胍片药液：蒸馏水溶解二甲双胍片，浓度为20mg·ml-1。
辛伐他汀片药液：蒸馏水溶解辛伐他汀片，浓度为1mg·ml-1。
(二)含药血清的制备
雄性SD大鼠，180-220g，按体重随机分为正常对照组、辛伐他汀组、二甲双胍组、SHBD组，分别给予生理盐水、辛伐他汀、二甲双胍和SHBD药液，按每100g体重1ml灌胃，每日2次给药，连续给药3天，最后1次给药1.5h后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，静置数分钟，离心，取血清，各组血清分别混合，56℃灭活30min，经0.22μm针头微孔滤器过滤除菌，从而制备出各组含药血清，-20℃冰箱保存，备用。
(三)HepG2胰岛素抵抗模型建立及药物干预处理
将处于对数生长期的HepG2细胞消化后，RPMI 1640培养基混悬细胞。培养细胞至细胞贴壁后，用含1×10-8mol·L-1胰岛素的培养基作用于HepG2细胞36h建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型。
实验分组为SHBD大、中、小剂量组(含药血清稀释为15％、10％、5％)，二甲双胍组(含药血清稀释为15％)，辛伐他汀组(含药血清稀释为15％)，正常组和模型组。HepG2胰岛素抵抗模型造模成功后，分别给予不同的含药血清干预24h。(四)3H-D-葡萄糖参入试验检测SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取率的影响
HepG2胰岛素抵抗模型造模成功后，分别给予不同的含药血清干预24h。加入3H-D-葡萄糖(1.3μCi·ml-1培养液中)孵育2h，加入4℃磷酸盐缓冲液快速洗涤细胞以终止反应。细胞用20％KOH 0.5ml裂解后，转移至试管中。取100μl的细胞裂解液，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。4℃乙醇溶液洗涤2次。室温3000r·min-1离心5min后弃去上清液，将沉淀物(糖原)倒置沉淀在直径2cm的滤纸片上(反复冲洗)，滤纸片用冷藏于4℃的乙醇搅拌洗涤4次，共3h。将滤纸片烘干后置于10ml闪烁液中测定放射性计数。根据3H-D-葡萄糖的比放射性，细胞裂解液的蛋白浓度及糖原的放射性，计算3H-D-葡萄糖的参入率，单位为mmol·gPro·h-1。公式为：葡萄糖的摄取率＝糖原的放射性计数(cpm)/[3H-D-葡萄糖的比放射性(Bq/mmol)×细胞裂解液的蛋白质浓度(g·l-1)×细胞裂解液体积(ml)×温育时间(h)]
(五)SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响
用含1×10-8mol·L-1胰岛素的培养基作用于HepG2细胞36h建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型，模型建立后，含药血清处理24h后，收集各组细胞培养基上清液，超微量多功能自动生化分析仪检测培养基上清的葡萄糖含量，并计算各组细胞的葡萄糖消耗量。
(六)SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型糖代谢相关因子IRS-1、IRS-2、GLUT2、GLUT4的表达调控
胰岛素抵抗细胞模型造模成功后，各含药血清作用24h，弃去培养基。
(1)细胞total RNA提取
PBS清洗2次，每10cm2生长的培养细胞中加入1ml的TRIZOL试剂用以裂解细胞，将内含细胞的裂解液转移至离心管中，移液枪反复吹吸，室温静置5min。加入氯仿，剧烈振荡15sec，待溶液充分乳化后，室温静置5min，后12,000g，4℃离心15min，吸取上清液转移至另一新的离心管中。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，15～30℃静置10min。后12,000g，4℃离心10min。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒，12,000g 4℃离心5min后小心弃去乙醇。室温干燥沉淀2～5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。紫外分光光度计检测RNA的吸光度值，计算总RNA的含量和纯度。
(2)反转录反应：
①基因组DNA的除去反应
室温5min，4℃。
②反转录反应(反应液配制在冰上进行)
37℃15min，85℃5sec，4℃。
(3)Real Time PCR反应
①引物序列
②PCR反应体系
反应条件：Stage 1：预变性，95℃，30sec，1Reps；Stage 2：PCR反应，95℃，5sec，60℃，34sec，40Reps。
PCR反应结束后，通过引物扩增曲线及溶解曲线验证引物的扩增效率及引物特异性，根据2-△△Ct来计算各基因的相对表达量，其中，△Ct等于目的基因组的Ct减去内参基因组的Ct，其中，β-actin为内参基因，-△△Ct等于含药血清组的△Ct减去对照组的△Ct，以模型组为对照，则模型组的2-△△Ct值为1。
(七)含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型脂代谢相关因子PPAR-γ和β3AR的表达调控
实验步骤同(六)，引物序列为：
(九)统计学分析
实验用不同批次细胞重复3次以上，进行单因素方差分析，实验数据用均数±标准差表示，以P＜0.05为有统计学意义。
三、实验结果
1.SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取率的影响
药物作用后胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖摄取率
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组相比，模型组葡萄糖摄取率显著降低(P<0.05)；经药物干预后，二甲双胍组、SHBD大剂量组和SHBD中剂量组葡萄糖摄取率显著升高，与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。
2.SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响
药物作用后胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗量
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组比较，模型组葡萄糖消耗量显著降低(P<0.05)；经药物干预后，二甲双胍组、SHBD大、中剂量组葡萄糖消耗量较模型组显著增加(P<0.05)。
3.SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2mRNA表达的影响
药物作用后胰岛素抵抗细胞模型IRS-1、IRS-2mRNA相对表达量
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组相比，模型组IRS-1、IRS-2mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)；经药物干预后，与模型组相比，二甲双胍组、SHBD大剂量组和SHBD中剂量组IRS-1、IRS-2mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)；辛伐他汀组IRS-2mRNA相对表达量与模型组相比较也有显著升高(P<0.05)，但较SHBD大剂量组显著降低(P<0.05)。
4.SHBD含药血清对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖转运蛋白GLUT2、GLUT4mRNA表达的影响
药物作用后胰岛素抵抗细胞模型GLUT2、GLUT4mRNA相对表达量
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组相比，模型组GLUT2、GLUT4mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)；经药物干预后，与模型组相比，二甲双胍组、SHBD大、中剂量组GLUT2、GLUT4mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。
四、实验结论
实验结果显示，SHBD含药血清能提高HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取率，增加胰岛素抵抗模型细胞对葡萄糖的消耗量；同时，SHBD含药血清能上调胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2和葡萄糖转运蛋白GLUT2、GLUT4mRNA的表达。结果表明，SHBD方含药血清通过调节胰岛素受体底物表达，增加细胞对胰岛素的敏感性；同时通过上调葡萄糖转运蛋白的表达，增加细胞对葡萄糖的摄取，从而起到增加胰岛素抵抗细胞对胰岛素的敏感性，提高胰岛素抵抗细胞对葡萄糖消耗的作用。
Ⅱ、SHBD方对胰岛素抵抗模型大鼠的影响
一、实验材料
实验动物：SD雄性大鼠，SPF级，体重180～220g，100只，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)0105817。
高脂高糖高盐乳剂配方原料：蛋黄粉、胆固醇、牛胆盐、丙基硫氧嘧啶、白砂糖、食盐、猪油。
药物:中药组合物SHBD：山楂，康美药业股份有限公司(生产批号：120304861)；制何首乌，康美药业股份有限公司(生产批号：111203551)；白芍，康美药业股份有限公司(生产批号：120205421)；丹参，广州市岭南中药饮片有限公司(生产批号：091008)
盐酸二甲双胍片，中美上海施贵宝制药有限公司(生产批号：1204101)
辛伐他汀片，杭州默沙东制药有限公司(生产批号：110593)。
试剂：焦磷酸二乙酯(DEPC)，Sigma；氯仿(分析纯)，广州化学试剂厂；异丙醇(分析纯)，广州化学试剂厂；乙醇(分析纯)，广州化学试剂厂；PCR引物，TAKARA；Trizol Plus，TAKARA,Lot：A8601-1；Prime Script RT reagent Kit with gDNA,TAKARA,Lot：BK1301；SYBR Premix Ex TaqⅡ，TAKARA,Lot：BK1303。
仪器：智能恒温数显电热套，河南爱博特科技发展有限公司；旋转蒸发仪，SENCO公司；电子天平，艾科勒公司；生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司；超微量动物专用多功能自动生化分析仪，Trilogy；自动血流变仪，北京普利生仪器有限公司；显微镜，OLYMPUS。
二、实验方法
(一)胰岛素抵抗大鼠模型的建立及动物饲养方法
健康雄性SD大鼠100只，SPF级，体重180～220g，适应性饲养1周，按体重随机选取10只设为正常组，余下90只供造模用。造模组大鼠前4周每天给予不含丙基硫氧嘧啶的高脂高糖高盐乳剂灌胃1ml/100g/d。从第5周开始，给予含有丙基硫氧嘧啶的高脂高糖高盐乳剂灌胃1ml/100g/d，连续2周。正常组用同等剂量蒸馏水灌胃，正常饮水。所有大鼠喂食普通饲料，饲料和水每日更换一次。
高脂高糖高盐乳剂配制：猪油20％，胆固醇5％，蛋黄粉6％，牛胆盐1％，白砂糖20％，盐10％。取20g猪油、5g胆固醇、6g蛋黄粉、1g牛胆盐、20g白砂糖、10g盐放入烧杯中，加入100ml蒸馏水，放入恒温电热套中加热并充分搅拌直到完全溶解，即成高脂高糖高盐乳剂，连续灌胃4周后，乳剂中加入0.1％丙基硫氧嘧啶，再连续灌胃2周。乳剂4℃冷藏保存，使用前37℃水浴加热融化。
于造模第6周末晚上禁食12小时，次日10％水合氯醛腹腔麻醉，眼眶取血1ml/只，3000rpm，离心15min取血清，多功能自动生化分析仪检测大鼠血糖，并采用放免法检测胰岛素含量。计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)。ISI＝Ln(FBG×FINS)-1(FBG：空腹血糖，FINS：空腹血清胰岛素)。
(二)动物分组及给药
选取造模成功的大鼠随机分为6组，分别是模型组、辛伐他汀组、二甲双胍组、SHBD大、中、小剂量组，连同正常组共7组。
模型组及各用药组上午灌胃高脂高糖高盐乳剂1ml/100g/d，下午各用药组分别灌胃辛伐他汀、二甲双胍及SHBD药液大、中、小剂量，模型组和正常组灌胃生理盐水，正常饮水。所有大鼠喂食普通饲料，饲料和水每日更换一次，连续6周。
药液制备：按本发明上述具体实施方式制得，定容至0.864g·ml-1，为SHBD大剂量组；中剂量组加水稀释为0.432g·ml-1；小剂量组加水稀释为0.216g·ml-1；按100g体重1ml灌胃给药。
辛伐他汀药液：蒸馏水溶解辛伐他汀片，药液浓度为0.5mg·ml-1，按5mg·kg-1·d-1剂量给药。
二甲双胍药液：蒸馏水溶解二甲双胍片，药液浓度为10mg·ml-1，按100mg·kg-1·d-1剂量给药。
动物给药剂量按照《药理实验方法学》(第三版，徐淑云，卞如濂，陈修主编，人民卫生出版社，2002年)“附表11-8人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”(P1861)，根据人的用药剂量换算成大鼠等效剂量：
大鼠等效剂量＝(人的每日用量×0.018)/0.2
(三)标本采集
用药6周后，处理前晚上禁食，次日清晨10％水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，分离血清，检测血清血糖和胰岛素水平；取全血和血浆检测大鼠血液流变学和血浆内皮素水平。
取大鼠肝脏、后肢骨骼肌和大网膜脂肪组织，放入离心管中，-80℃冰箱保存备用。用于检测组织中IRS-1、IRS-2、GLUT2、GLUT4mRNA的表达，以及及PPAR-γ、β3AR mRNA的表达。
(四)检测方法
1.肝脏组织中IRS-1、IRS-2、GLUT2、β3AR mRNA表达、骨骼肌中GLUT4mRNA表达和大网膜脂肪组织中PPAR-γmRNA的表达
(1)肝脏total RNA的提取：
-80℃冰箱中取出各组大鼠肝脏、骨骼肌和大网膜脂肪组织，PBS清洗一次，每100mg肝脏加入1ml的TRIZOL试剂，将内含大鼠组织及裂解液的离心管放入多功能生物样品均质器内匀浆，室温静置5min。4℃，12,000g,离心5min，取上清，加入上清1/5体积的氯仿，剧烈振荡15sec，待溶液充分乳化后，室温静置5min，后12,000g，4℃离心15min，吸取上清液转移至另一新的离心管中。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀后，15～30℃静置10min。后12,000g，4℃离心10min。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒，12,000g4℃离心5min后小心弃去乙醇。室温干燥沉淀2～5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。
(2)反转录反应：
①基因组DNA的除去反应
室温5min，4℃。
②反转录反应(反应液配制在冰上进行)
37℃15min，85℃5sec，4℃。
(3)Real Time PCR反应
①引物序列
②PCR反应体系
反应条件：Stage 1：预变性，95℃，30sec，1Reps；Stage 2：PCR反应，95℃，5sec，60℃，34sec，40Reps。
PCR反应结束后，通过引物扩增曲线及溶解曲线验证引物的扩增效率及引物特异性，根据2-△△Ct来计算各基因的相对表达量，其中，△Ct等于目的基因组的Ct减去内参基因组的Ct，其中，GAPDH为内参基因，-△△Ct等于用药组的△Ct减去对照组的△Ct，以模型组为对照，则模型组的2-△△Ct值为l。
三、实验结果
1.SHBD方对胰岛素抵抗模型大鼠血糖和血清胰岛素的影响
各实验组大鼠空腹血糖、血清胰岛素及胰岛素敏感指数水平
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组相比，模型组大鼠空腹血糖(FBS)和血清胰岛素水平(Ins)显著升高(P<0.05)，胰岛素敏感指数(ISI)降低((P<0.05))，说明胰岛素抵抗大鼠模型造模成功；经药物干预后，与模型组相比，二甲双胍组和SHBD大、中剂量组大鼠空腹血糖(FBG)和血清胰岛素水平(Ins)显著降低(P<0.05)，胰岛素敏感指数(ISI)升高；与模型组相比，辛伐他汀组、SHBD小剂量组FBS、Ins、ISI均无显著性差异(P>0.05)。
5.SHBD方对胰岛素抵抗模型大鼠血液流变学的影响
各实验组大鼠血液流变学水平
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组相比，模型组大鼠全血粘度和血浆粘度均显著升高(P<0.05)，说明经高脂高糖高盐乳剂喂养后，大鼠血液流变学发生改变，血液粘稠度增高；经药物干预后，与模型组相比，辛伐他汀组和SHBD大、中剂量组全血粘度和血浆粘度均显著降低(P<0.05)。
6.SHBD方对胰岛素抵抗模型大鼠血浆内皮素(ET-1)的影响
各实验组大鼠血浆内皮素水平
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组相比，模型组血浆内皮素水平显著升高(P<0.05)，说明胰岛素抵抗导致血管内皮功能受损，血浆内皮素合成分泌增多；经药物干预后，与模型组相比，二甲双胍组、辛伐他汀组、SHBD大剂量组和SHBD中剂量组血浆内皮素水平显著降低(P<0.05)。
4.SHBD方对胰岛素抵抗模型大鼠肝脏IRS-1、IRS-2、GLUT2、β3AR mRNA表达水平的影响
各实验组大鼠肝脏IRS-1、IRS-2、GLUT2、β3AR mRNA相对表达量
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组比较，模型组大鼠肝脏IRS-1、IRS-2、GLUT2、β3AR mRNA相对表达量均显著降低(P<0.05)；经药物干预后，与模型组相比，二甲双胍组和SHBD大、中剂量组IRS-1、IRS-2、GLUT2mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)，SHBD大剂量组β3AR mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。
5.SHBD方对胰岛素抵抗模型大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表达水平的影响
各实验组大鼠骨骼肌GLUT4mRNA相对表达量
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组比较，模型组大鼠骨骼肌GLUT4mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)；经药物干预后，与模型组相比，二甲双胍组和SHBD大、中剂量组GLUT4mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。
6.SHBD方对胰岛素抵抗模型大网膜脂肪组织PPAR-γmRNA表达水平的影响
各实验组大鼠大网膜脂肪组织PPAR-γmRNA相对表达量
与正常组相比，△P<0.05；与模型组相比，*P<0.05.
与正常组比较，模型组大鼠大网膜脂肪组织PPAR-γmRNA相对表达量显著降低(P<0.05)；经药物干预后，与模型组相比，辛伐他汀组和SHBD大、中剂量组PPAR-γmRNA相对表达量显著升高(P<0.05)。
四、实验结论
实验结果表明，SHBD方能显著降低胰岛素抵抗模型大鼠空腹血糖和血清胰岛素水平，提高模型大鼠的胰岛素敏感指数；能降低由胰岛素抵抗引起的血液高粘度状态，降低模型大鼠全血粘度和血浆粘度；能降低由胰岛素抵抗导致的血管内皮损伤，降低血浆内皮素-1水平。通过SHBD方干预后，模型大鼠调节糖代谢的基因IRS-1、IRS-2、GLUT2、GLUT4mRNA表达升高，调节脂代谢的β3AR和PPAR-γmRNA表达升高，进一步验证了SHBD方治治疗胰岛素抵抗及其引起的相关疾病的有效性。
综上所述，本发明由山楂、制何首乌、白芍、丹参组成，具有以下特点：
一、本发明的组合物药效作用显著，对胰岛素抵抗及其相关疾病有较好的治疗作用。本发明作用机制明确，研究发现该组合物靶向作用于糖、脂代谢的相关通路，通过调控胰岛素受体底物IRS-1、IRS-2基因的表达，提高机体对胰岛素的敏感性；通过上调葡萄糖转运蛋白GLUT2、GLUT4mRNA的表达，促进机体对葡萄糖的摄取，增加机体对葡萄糖的消耗；通过上调PPAR-γ、β3AR mRNA的表达，促进脂肪细胞的分解代谢；从基因水平起到防治胰岛素抵抗的作用。同时，该组合物还具有改善血液流变学，降低内皮素-1(ET-1)水平，起到防治血栓形成和保护血管内皮功能的作用。该组合物通过多个方面起到治疗胰岛素抵抗及其相关疾病的作用。
二、本发明以改善胰岛素抵抗为中心，通过调节与胰岛素抵抗相关的信号通路，以治疗胰岛素抵抗为出发点，进而起到治疗与胰岛素抵抗相关的高胰岛素血症、糖尿病、高血压、高血脂、代谢综合征、高尿酸血症、血粘度增高等多种疾病，达到“一药多病”的效果，提高患者依从性，减轻患者的经济和生理负担。
三、本发明为中药制剂，药物组成简单，服用量小，并经药效实验验证对胰岛素抵抗及其相关疾病有明显的治疗作用，毒副作用小。
四、本发明是天然植物药材的提取物，原料药价格低廉，来源广泛，提取工艺简单。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。