要求优先权
本申请要求2009年4月17日提交的美国临时申请号61/170,368 和2008年12月5日提交的美国临时申请号61/120,234的优先权，这 两个申请的全部内容通过引用方式并入本文。
发明背景
酸性的富含半胱氨酸的分泌蛋白(Secreted Protein，Acidic， Rich in Cysteines，SPARC)也被称作骨粘连蛋白(osteonectin)，是 人体内表达的303个氨基酸的糖蛋白。
SPARC的表达在发育上受到调控，SPARC主要在正常发育或响应于 损伤而发生重塑的组织中表达。参见，例如Lane等人，FASEB J.，8， 163-173(1994)。例如，在鼠、牛和人胚胎的发育中的骨和牙齿(主 要是成骨细胞、成牙质细胞、软骨膜的成纤维细胞)以及分化中的软 骨细胞中高水平表达SPARC蛋白。SPARC也在组织重塑、创伤修复、 形态发生、细胞分化、细胞迁移和血管形成过程中的细胞-基质相互作 用中发挥重要作用，其中包括这些过程与疾病状态相关的情况。例如， 在肾间质纤维化中表达SPARC，并且其在宿主对肺损伤例如博来霉素 诱导的肺纤维化的应答中具有重要作用。
然而SPARC具有许多性质，其中之一是其结合白蛋白的能力。参 见，例如，Schnitzer，J.Biol.Chem.，269，6072(1994)。该性 质的用途的一个实例是用于在转移性乳腺癌的治疗中所示的紫杉醇 (Abraxis BioScience，Inc.，Santa Monica，California) 的FDA批准的无溶剂配方。该活性试剂也称为″Nab-紫杉醇″，其利用 白蛋白可逆地结合紫杉醇的天然性质，将其运输穿过内皮细胞，并且 在肿瘤区域浓集紫杉醇。更具体地，药物递送的机制部分地包括紫杉 醇结合的白蛋白的糖蛋白60介导的内皮细胞胞吞转运作用 (transcytosis)和通过白蛋白与SPARC结合产生的在肿瘤区域的积 累。临床研究已显示nab-紫杉醇明显比其他紫杉醇制剂明更有效，前 者几乎使反应速率加倍，在二线患者中延长了疾病进展的时间并提高 了存活率。参见Gradishar，Expert Opin.Pharmacother 7(8)：1041 -53(2006)。
发明概述
本发明提供了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子(“包 含肽配体结构域的缀合物”)包含缀合于活性试剂的肽配体结构域， 其中所述肽配体结构域包括SEQ ID NO：1-67的肽、其同源物和其组 合，在此类肽当中，优选的是SEQ ID NOs：1、2、66和67的肽、其 同源物和其组合。参见图1和11。包含肽配体结构域的缀合物可由两 个或更多个肽组成，其中每一个肽包含一个或多个白蛋白结合肽结构 域，其中每一个肽配体结构域包含来自SEQ ID NOs：1-67的一个或 多个肽、其同源物和其组合，在此类肽中，优选的是SEQ ID NOs：1、 2、66和67的肽、其同源物和其组合。
本发明提供了用于调节活性试剂在动物组织内的分布的方法，包 括：向动物施用包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子包含缀合 于活性试剂的肽配体结构域，其中所述肽配体结构域包括SEQ ID NO： 1-67的一个或多个肽、其同源物和其组合，在此类肽当中，优选的是 SEQ ID NOs：1、2、66和67的肽、其同源物和其组合，并且其中相 对于单独施用活性试剂时所获得的组织分布而言，向动物施用所述组 合物时引起不同的活性试剂组织分布。优选地，本方法在疾病位点提 供增加浓度的活性试剂，和/或增加的或延长的活性试剂血液水平，其 大于向动物施用活性试剂(以未缀合的形式)时提供的浓度和水平。
本发明提供了组合物和其使用方法，其中所述缀合物分子还包含 第二肽配体结构域，后者优选地包含如下SEQ ID NOs的肽：来自SEQ ID NOs：1、2、66和67的一个或多个肽、其同源物和其组合。该第 二肽配体结构域可在与第一肽配体结合结构域相同的多肽上或在另一 个多肽上。
此外，本发明提供了用于治疗肿瘤的试剂盒，其包含药物制剂和 在治疗肿瘤中使用该制剂的说明书(例如，FDA批准的包装插页)， 其中所述药物制剂包含缀合物分子，所述缀合物分子包含缀合于活性 试剂的肽配体结构域，并且其中所述肽配体结构域包括SEQ ID NO： 1-67的一个或多个肽、其同源物和其组合，在此类肽当中，优选的是 SEQ ID NOs：1、2、66和67的肽、其同源物和其组合。
附图概述
图1显示了SEQ ID NOs：1、2和66。
图2显示了野生型、全长SPARC和Q3 SPARC突变体的白蛋白结合 活性。
图3显示了SPARC组织蛋白酶K消化产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳 的结果。
图4显示了SPARC氨基酸序列中的组织蛋白酶K切割位点和所得 的3个SPARC组织蛋白酶K切割片段的氨基酸序列。
图5显示了SPARC组织蛋白酶K预消化(predigestion)对SPARC 白蛋白结合的影响。
图6显示了来自SPARC C-末端半胱氨酸稀少的(cysteine-poor) 结构域的示例性15聚体肽。
图7显示了来自SPARC C-末端半胱氨酸稀少的结构域的15聚体 肽在竞争性结合测定中的性能。
图8显示了来自SPARC C-末端半胱氨酸稀少的结构域的示例性 SPARC亚片段肽(以黑体字显示)。
图9显示了SPARC亚片段肽在竞争性结合测定中的性能。
图10显示了噬菌体展示筛选的一般方法。
图11显示了筛选白蛋白结合肽(包括SEQ ID Nos：2-65的氨基 酸序列)的噬菌体展示的结果。
发明详述
I.本发明利用肽配体结构域
术语“肽配体结构域”意思是指：可以以其本身存在和/或存在于 更大的多肽序列内并且特异性地与另一种生物分子结合的氨基酸序 列。例如，脂肪酸、胆红素、色氨酸，钙、类固醇激素和其它生理上 重要的化合物的主要血液运输系统涉及这些生物分子与血清白蛋白的 结合。类似地，作为跨内皮白蛋白运输的第一步骤，白蛋白特异性结 合内皮细胞表面糖蛋白60。白蛋白多肽内结合脂肪酸、胆红素、色氨 酸、钙、类固醇激素和糖蛋白60的特定氨基酸是“肽配体结构域”。 因此，白蛋白是″包含肽配体结构域的多肽″。如本文中所使用的术语″ 白蛋白″包括任何动物白蛋白分子，特别是任何哺乳动物血清白蛋白， 包括尤其是人血清白蛋白，其中所述白蛋白是任何野生型或实质上为 野生型的氨基酸序列。“实质上为野生型氨基酸序列”的白蛋白保持 “野生型”白蛋白的基本上全部体内功能。
在一个方面，本发明涉及包含SEQ ID NOs：1-65的任意一项或多 项的氨基酸序列作为肽配体结构域的多肽。令人惊讶地，发现氨基酸 序列SEQ ID NOs：1-65的肽以大的亲和力结合人类白蛋白。本发明利 用该发现并且涉及包含SEQ ID NOs：1-65的多肽和其同源物的多种用 途。
在一个方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：1(即，氨基酸序列 MYIFPVHWQFGQLDQ)作为肽配体结构域的多肽，此类多肽与人类SPARC 蛋白的氨基酸209-223相同。令人惊讶地发现，SEQ ID NO：1以大的 亲和力结合人类白蛋白，并且可能至少部分地负责SPARC的白蛋白结 合。本发明利用该发现并且涉及包含SEQ ID NO：1的多肽的多种用途。
在另一个方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：2(即，氨基酸序列 KNHGATRTTRAS)作为肽配体结构域的多肽，该肽经噬菌体显示方法鉴定 为分离的人血清白蛋白结合序列。令人惊讶地，发现SEQ ID NO：2 以大的亲和力结合人类白蛋白。本发明利用该发现，并且涉及包含SEQ ID NO：2的多肽的多种用途。
SEQ ID NOs：1-67中一种或多种肽、其同源物和其组合(在此类 肽中，优选的是SEQ ID NOs：1、2、66和67的肽、其同源物和其组 合)的用途包括例如：(1)通过使用白蛋白运输系统将治疗剂递送至肿 瘤；和(2)通过与人类白蛋白紧密结合而以与白蛋白相似的稳定血浆动 力学将组合物隔离在血浆区室内。对于前一种用途，白蛋白结合常数 优选在与白蛋白相同的数量级上(约0.7μM至约700μM的平衡解 离常数(Kd))，然而对于后一种用途，白蛋白结合常数优选在nM至μM 范围内(即，约0.7nM至约7μM的Kd)。因此，本发明提供了肽配体 结构域，其对于它们的关联结合伴侣的Kd为例如约700μM或更低， 优选约10μM或更低，更优选，甚至最优选约100nM或更低以及最 优选为约10nM或更低。
可以通过任意合适的方法来监视和测定经由本发明的组合物和方 法递送至肿瘤的治疗或诊断剂，所述方法包括例如，向组合物中添加 放射活性标记物或放射不透性标记物并成像，这视情况而定，并且是 本领域普通技术人员所熟知的。可以通过任意合适的方法包括例如静 脉穿刺来监测组合物在血浆区室内的隔离。
在相关方面中，本发明还提供了包含缀合物分子的组合物，其中 所述缀合物分子包含缀合于活性试剂的多肽配体结构域，其中所述多 肽配体结构域包含作为来自SEQ ID NO：1-67的一个或多个肽，优选 SEQ ID NO：1、2、66和67的肽的同源物的多肽。术语“同源物”意 思是具有与原始序列实质上相同的氨基酸序列并且显示出与原始序列 所显示出的性质实质上相似的相关性质的多肽。一种此类性质的实例 是调节活性试剂的组织分布的能力，其中SEQ ID NO：1或2或66的 同源物将能够提供与SEQ ID NO：1或2或66提供的调节水平实质上 相似的调节水平。在本文中，例如以及优选地，相对于SEQ ID NO：1 至67提供的活性试剂的血液水平而言，显示出这种实质上相似的调节 的SEQ ID NO：1或2或66的同源物将提供至少大约80％，优选至少 大约85％，更优选至少大约90％，最优选至少大约95％的活性试剂血液 水平。或者，术语“同源物”还意指SEQ ID NO：1的至少11个连续 氨基酸的肽序列或SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的肽序列。
另一个这样的性质的实例是例如其对于结合白蛋白的Kd为约700 μM或更低，优选约10μM或更低，更优选，甚至更优选约100nM 或更低，以及最优选为约10nM或更低的SEQ ID NOs：1-67同源肽配 体结构域。
就相对于原始序列的变化而言，原始序列的同源物优选将与原始 序列至少大约80％同一，优选与原始序列至少大约90％同一，甚至更优 选与原始序列至少大约95％同一，最优选与原始序列至少大约99％同 一。同样类似地，SEQ ID Nos：3-65也可具有可根据本发明使用的同 源物，即，与原始序列至少约80％同一，优选与原始序列至少约90％ 同一，甚至更优选与原始序列至少约95％同一，最优选与原始序列至 少约99％同一的肽序列。举另一个具体的例子而言，并且在15个氨基 酸的序列(例如由SEQ ID NO：1描述的序列)的上下文中，同源物可优 选地包含存在于原始序列中的至少11个氨基酸，优选包含至少12个 这样的氨基酸，更优选至少13个这样的氨基酸，最优选包含至少14 个这样的氨基酸。类似地，在12个氨基酸序列(例如由SEQ ID NO：2 描述的序列)的上下文中，同源物可优选地包含存在于原始序列中的至 少8个氨基酸，优选包含至少9个这样的氨基酸，更优选至少10个这 样的氨基酸，最优选包含至少11个这样的氨基酸。同样类似地，SEQ ID Nos：3-65也可具有可根据本发明使用的同源物，即可包含存在于原 始序列中的至少8个氨基酸，优选包含至少9个这样的氨基酸，更优 选至少10个这样的氨基酸，最优选包含至少11个这样的氨基酸。
如本文使用的“序列同一性百分率”意思是通过在比较窗口中比 较两个优化比对的序列而测定的值。另外，为了两个序列优化比对的 目的，比较窗口中的多肽序列部分相对于参考序列(其不包含添加或 缺失)可以包含添加或缺失(即空隙)。百分率是这样计算的：测定 两个序列中的相同氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将 匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，将结果乘以100以 产生序列同一性百分率。优选地，使用Needleman和Wunsch(1970)J. Mol.Biol.48：443453中的同源性比对算法来进行优化比对。
另外优选的是，当同源物不含相同的氨基酸时，突变仅产生保守 性氨基酸变化。因此，那些不相同的残基位置的变化使得氨基酸残基 被替换为其它的具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残 基，因此，分子的功能性质不发生改变。当序列的区别在于保守性替 换时，可以上调序列同一性百分率以校正替换的保守性性质。区别在 于此类保守性替换的序列被称作具有“序列相似性”或“相似性”。 进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。
为了进一步例示本发明上下文中的“保守性”氨基酸取代或改变 的含义，以下列出了组A-F。下列组中的一个成员被替换为同一个组 中的另一个成员被认为是“保守性”取代。
组A包括：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和具有下列侧链的修饰的氨基酸：乙基、 异丁基、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2OH、-CH2CHOHCH3和CH2SCH3。
组B包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸 和具有乙基侧链的修饰的氨基酸。
组C包括苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、环己基甲基 和具有取代的苄基或苯基侧链的修饰的氨基残基。
组D包括谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或天冬氨酸的取代的或非取 代的脂肪族、芳香族或苄族酯(例如，甲酯、乙酯、正丙酯、异丙酯、 环己酯、苄酯或取代的苄酯)、谷氨酰胺、天冬酰胺、CO-NH-烷基化 的谷氨酰胺或天冬酰胺(例如，甲基、乙基、正丙基和异丙基)，以及 具有侧链-(CH2)3COOH的修饰的氨基酸，其酯(取代的或非取代的脂 肪族、芳香族或苄族酯)，其酰胺，及其取代的或未取代的N-烷基化 酰胺。
组E包括组氨酸、赖氨酸、精氨酸、N-硝基精氨酸、p-环精氨酸、 g-羟基精氨酸、N-脒基瓜氨酸(N-amidinocitruline)，2-氨基胍基丁 酸(2-arnino guanidinobutanoic acid)、赖氨酸的同源物、精氨酸 的同源物和鸟氨酸。
组F包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和具有被-OH或-SH取代的 C1-C5直链或支链烷基侧链的修饰的氨基酸。
本发明还提供了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子包含 缀合于活性试剂的肽配体结构域，其中所述肽配体结构域在氨基或羧 基末端或者两个末端包含至多另外大约50个氨基酸，优选至多另外大 约25个氨基酸，更优选至多另外大约15个氨基酸，最优选至多另外 大约10个氨基酸。得到的多肽(本发明的多肽)包括总长度小于50 个，小于40，小于30，小于25或小于20个氨基酸的多肽。
本发明还提供了包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子包含 缀合于活性试剂的肽配体结构域，其中存在一个包含例如SEQ ID NO： 1或2、1和2或其同源物的多个肽配体结构域肽。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码具有肽配体结合结构域 的氨基酸序列的多肽，包括在氨基和/或羧基末端具有所述的另外的氨 基酸的那些多肽。
II.制备肽配体结构域的方法
可以使用已知的技术来合成、检测、定量和纯化本发明提供的含 有肽配体结构域的多肽。例如，可以这样产生表达含有外源肽配体结 构域的多肽的细胞：通过本领域普通技术人员熟知的方法将cDNA置于 强启动子/翻译起始点的控制下并将载体转染或转化进入合适的原核 或真核细胞以驱动含有肽配体结构域的多肽的表达。或者，可以通过 本领域普通技术人员熟知的方法化学地制备含有肽配体结构域的多 肽。
可以通过标准的固相合成技术来制备含有肽配体结构域的多肽。 如一般已知的那样，可以使用商售的设备和试剂，根据生产商的说明 书，通过封闭干扰性基团、保护待反应的氨基酸、偶联、脱保护和将 未反应的残基加帽来制备所需长度的肽。合适的设备可以从下列生产 商获得，例如，Applied BioSystems，Foster City，CA或Biosearch Corporation，San Raphael，CA。
例如，使用具有合适侧链保护的叔丁氧羰基-α-氨基酸，应用标 准的自动化固相合成程序来合成肽。使用标准的氟化氢方法从固相载 体上取下完成的肽，同时使侧链脱保护。使用0.1％三氟乙酸中的乙腈 梯度，通过半制备型反相HPLC(Vydac C18)进一步纯化粗制肽。将 肽真空干燥以除掉乙腈并从0.1％的TFA水溶液中冷冻干燥。通过分析 型RP-HPLC验证纯度。可以将肽冻干，然后以1-2mg/mL的重量浓度 溶解于水或0.01M乙酸中。
如果肽中存在非编码氨基酸或D形式的氨基酸，则需要使用前述 合成方法。然而，对于由基因编码的肽，也可以使用容易合成的DNA 序列在商售的表达系统中通过重组技术获得其来源。
本发明相应地提供了包含控制编码含有肽配体结构域的多肽的多 核苷酸序列表达的元件的重组载体。此外，本发明提供了包含编码含 有肽配体结构域的多肽的核酸的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真 核细胞。微生物和组织培养方法是本领域技术人员熟知的(见，例如， Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Pres s，New York(2001)，pp.16.1- 16.54)。因此，本发明提供了制备含有肽配体结构域的多肽的方法， 包括：(a)以编码权利要求1的多肽的核酸转化细胞；(b)诱导转 化的细胞表达所述多肽；和(c)纯化所述多肽。
蛋白表达取决于RNA转录的水平，RNA转录继而又由DNA信号调 节。类似地，mRNA的翻译至少需要AUG起始密码子，其通常位于信使 的5’末端的10-100个核苷酸内。已经表明侧接AUG起始密码子的序 列影响其识别。例如，对于真核细胞核糖体的识别而言，与完美“Kozak 共有”序列一致的序列中镶嵌的AUG起始密码子引起优化的翻译(见， 例如，Kozak，J.Molec.Biol.196：947-950(1987))。同样，细 胞中外源核酸的成功表达可能需要所得到的蛋白的翻译后修饰。
本文描述的核酸分子优选包含与合适的启动子可操作地连接的编 码区，所述启动子是例如真核细胞中有功能性的启动子。病毒启动子， 例如但不限于，RSV启动子和腺病毒主要晚期启动子，可用于本发明 中。合适的非病毒启动子包括但不限于，磷酸甘油激酶(PGK)启动子 和延伸因子1α启动子。非病毒启动子优选是人类启动子。另外的合 适的遗传元件(很多是本领域已知的)也可以连接于或插入至本发明 的核酸和构建体中以提供另外的功能、表达水平或表达模式。
此外，本文描述的核酸分子可以与增强子可操作地连接以促进转 录。增强子是DNA的顺式作用元件，其刺激相邻基因的转录。赋予所 连接的基因在来自很多物种的多种不同细胞类型中的高水平转录的增 强子的实例包括但不限于，来自SV40和RSV-LTR的增强子。此类增强 子可以与具有细胞类型特异性效应的其它增强子组合，或者可以单独 使用任意增强子。
为了优化真核细胞中的蛋白产生，本发明的核酸分子还可以在核 酸分子的编码区之后包含多腺苷酸化位点。同样地，优选所有的正确 转录信号(以及翻译信号，如果适用)将正确地排列，以使外源核酸 在其所被导入的细胞中正确表达。如果需要，外源核酸中还可以引入 剪接位点(即，剪接受体和剪接供体位点)以促进mRNA产生并同时保 持框内的全长转录本。此外，本发明的核酸还可以包含合适的序列以 进行加工、分泌、细胞内定位等。
可以将核酸分子插入至任何合适的载体中。合适的载体包括但不 限于病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于，逆转录病毒载体，α 病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和禽痘病毒载体。 载体优选具有天然或工程化的能力以转化真核细胞，例如CHO-K1细 胞。另外，用于本发明上下文中的载体可以是“裸的”核酸载体(即 具有极少或没有封装它们的蛋白、糖类和/或脂类的载体)，例如质粒 或游离体，或者载体可以与其它分子复合。可以与本发明的核酸适宜 地组合的其它分子包括但不限于病毒包被、阳离子脂质、脂质体、聚 胺、金颗粒和靶向部分，例如靶向细胞分子的配体、受体或抗体。
如本文描述的核酸分子可以被转化进入任意合适的细胞，通常是 真核细胞，例如CHO，HEK293或BHK，优选引起含有肽配体结构域的 多肽例如本文描述的包含SEQ ID NO：1或2的多肽或其变体或同源物 的表达。可以培养所述细胞以提供核酸分子的表达，并由此产生含有 肽配体结构域的多肽，例如本文描述的包含SEQ ID NO：1或2所示氨 基酸序列或其同源物的多肽。
因此，本发明提供了以本文描述的本发明的核酸分子转化或转染 的细胞。以外源DNA分子转化或转染细胞的方法是本领域熟知的。例 如但不限于，使用本领域熟知的标准转化或转染技术将DNA分子导入 细胞中，所述技术是例如磷酸钙或DEAE-葡聚糖-介导的转染、原生质 体融合、电穿孔、脂质体和直接显微注射(参见，例如，Sambrook& Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001)，pp.1.1-1.162， 15.1-15.53，16.1-16.54)。
转化方法的另一个实例是原生质体融合法，将源自携带高拷贝数 的目标质粒的细菌的原生质体直接与培养的哺乳动物细胞混合。细胞 膜融合后(通常使用聚乙二醇)，细菌的内容物被递送进入哺乳动物 细胞的胞质中，并且质粒DNA被转移进入细胞核。
电穿孔，即向多种哺乳动物和植物细胞施加短暂的高压电脉冲， 导致在质膜上形成纳米尺寸的孔。通过这些孔或者由于膜成分的重新 分布(伴随孔的关闭)而使DNA直接被递送进入细胞的细胞质内。电 穿孔可以是非常有效率的，并且可以用于克隆的基因的瞬时表达以及 用于建立携带整合拷贝的目标基因的细胞系。
此类技术可用于真核细胞的稳定转化和瞬时转化。稳定转化的细 胞的分离需要在导入目标基因的同时导入可选择标志物。此类可选择 标志物包括赋予对新霉素抗性的基因，以及HPRT阴性细胞中的HPRT 基因。选择可能需要在选择性培养基中进行延长的培养，至少大约2-7 天，优选至少大约1-5周(见，例如，Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001)，pp.16.1-16.54)。
可以从重组宿主细胞表达并纯化含有肽配体结构域的多肽。重组 宿主细胞可以是原核或真核细胞，包括但不限于细菌，例如大肠杆菌； 真菌细胞例如酵母；昆虫细胞，包括但不限于果蝇和蚕衍生的细胞系， 以及哺乳动物细胞和细胞系。当体外或在体内在细胞例如人类细胞中 表达含有肽配体结构域的多肽时，可以就给定的细胞类型(即物种) 对选择用于编码肽的多核苷酸进行优化。很多用于密码子优化的技术 是本领域已知的(见，例如，Jayaraj等人，Nucleic Acids Res. 33(9)：3011-6(2005)；Fuglsang等人，Protein Expr.Purif. 31(2)：247-9(2003)；Wu等人，″The Synthetic Gene Designer：a Flexible Web Platform to Explore Sequence Space of Synthetic Genes for Heterologous Expression，″csbw，2005 IEEE Computational Systems Bioinformatics Conference-Workshops (CSBW05)，pp.258-259(2005)).
可以从重组宿主细胞表达并纯化含有肽配体结构域的多肽。重组 宿主细胞可以是原核或真核细胞，包括但不限于细菌，例如大肠杆菌； 真菌细胞例如酵母；昆虫细胞，包括但不限于果蝇和蚕衍生的细胞系， 以及哺乳动物细胞和细胞系。当无论体外还是在体内在细胞例如人类 细胞中表达含有肽配体结构域的多肽时，可以就给定的细胞类型(即 物种)对选择用于这样的编码肽的多核苷酸的密码子进行优化。很多 用于密码子优化的技术是本领域已知的(见，例如，Jayaraj等人， Nucleic Acids Res.33(9)：3011-6(2005)；Fuglsang等人，Protein Expr.Purif.31(2)：247-9(2003)。在原核细胞中进行最佳的多肽 表达时必须考虑的问题包括：所用的表达系统、宿主菌株的选择、mRNA 的稳定性、密码子偏好性、包涵体的形成和防止、融合蛋白和位点特 异性蛋白水解、腔室导向的分泌(见Sorens en等人，Journal of Biotechnology 115(2005)113-128，通过引用方式并入本文)。
通常从遗传背景相容性系统携带的质粒诱导表达。表达质粒的遗 传元件包括复制起点(ori)、抗生素抗性标志物、转录启动子、翻译 起始区(TIR)以及转录和翻译终止子。
可以使用任何合适的表达系统，例如大肠杆菌由于其相对的简单 性、高密度培养、熟知的遗传学和大量的相容性工具(包括可用于多 肽表达的多种可获得的质粒，重组融合伴侣和突变菌株)而有助于蛋 白表达。用于重组表达的大肠杆菌菌株或遗传背景是非常重要的。表 达菌株应该缺乏最有害的天然蛋白酶，维持表达质粒稳定，并且提供 与表达系统相关的遗传元件(例如DE3)。
质粒拷贝数由复制起点控制，优选以松弛的方式复制(Baneyx， 1999)。存在于现代的表达质粒中的ColEl复制子源自pBR322(拷贝 数15-20)或pUC(拷贝数500-700)质粒家族，而p15A复制子源自 pACYC184(拷贝数10-12)。重组表达质粒中最常见的药物抗性标志物 赋予对氨比西林、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性。
大肠杆菌表达系统包括基于T7的pET表达系统(由Novagen商业 化)、λPL启动子/cI阻抑子(例如，Invitrogen pLEX)、Trc启动子 (例如，Amersham Biosciences pTrc)、Tac启动子(例如，Amersham Biosciences pGEX)和杂合lac/T5(例如，Qiagen pQE)和BAD启动子 (例如，Invitrogen pBAD)。
从转录的信使RNA的翻译起始区(TIR)进行的翻译起始需要核糖 体结合位点(RBS)，包括Shine-Dalgarno(SD)序列和翻译起始密 码子。Shine-Dalgarno序列位于起始密码子上游7±2个核苷酸处， 在有效的重组表达系统中，起始密码子是规范的AUG。从具有SD序列 UAAGGAGG的mRNA获得最佳的翻译起始。
大肠杆菌中的密码子使用由细胞质中可获得的同源的氨基-酰基 化tRNA的水平反映。主要密码子存在于高水平表达的基因中，而少数 或罕见密码子倾向于在低水平表达的基因中。在大肠杆菌中罕见的密 码子在来源于具有不同密码子频率偏向的来源例如真核细胞、古细菌 和其它远相关的生物的异源基因中通常是丰富的(Kane，1995)。含有 罕见密码子的基因的表达可能导致翻译错误，这是由于在需要引入偶 联于少数密码子tRNA的氨基酸的位置处核糖体停滞所致(McNulty等 人，2003)。当含有成簇(例如双重和三重)的罕见密码子的转录本大 量积累时，密码子偏向问题在重组表达系统中变得至关重要。
蛋白活性需要折叠成精确的三维结构。压力状况例如热休克会破 坏体内的折叠，折叠中间体倾向于结合成无定形的蛋白颗粒，其被称 作包涵体。
包涵体是一组结构上复杂的聚合体，通常被理解为当以高水平表 达重组蛋白时作为压力应答而发生。大肠杆菌的细胞质中浓度为 200-300mg/ml的蛋白的大分子量密集暗示高度不利的蛋白折叠环境， 尤其是在高水平重组表达过程中(van den Berg等人，1999)。尚不 知道包涵体是通过非折叠链上暴露的碎片之间的疏水相互作用而发生 的被动事件而形成还是通过特定的聚集机制而形成(Villaverde and Carrio，2003)。可以使用去污剂例如脲和盐酸胍溶解纯化的聚集体。 可以通过稀释、透析或柱上重折叠方法，从溶解的包涵体中在体外进 行重折叠以制备天然蛋白(Middelberg，2002；等人， 2003a)。
可以通过加入分子伴侣来改善重折叠策略(Mogk等人，2002)。然 而，对于给定的蛋白，重折叠程序的优化需要耗时的努力，并不总是 产生高的产品产率。防止形成包涵体的可能的策略是共同过表达分子 伴侣。
已经开发了多种蛋白融合配对物以简化重组蛋白的纯化和表达 (Stevens，2000)。融合蛋白或嵌合蛋白通常包括经由特异性蛋白酶的 识别位点而连接于乘客蛋白(passenger protein)或靶蛋白的配对物 或“标签”。多数融合配对物用于特异性亲和纯化策略。融合配对物 在体内也是有利的，其中它们可以保护乘客蛋白免受细胞内蛋白水解 (Jacquet等人，1999；Martinez等人，1995)、增强溶解性(Davis等 人，1999；Kapust and Waugh，1999；等人，2003b)或用作 特异性表达报告蛋白(Waldo等人，1999)。高表达水平通常可以从N- 末端融合配对物转移至低表达的乘客蛋白，最有可能是由于mRNA稳定 化的结果(Arechaga等人，2003)。常见的亲和标签是聚组氨酸标签 (His-tag)，其与固定化的金属亲和色谱(IMAC)相容，以及谷胱甘肽 S-转移酶(GST)标签，其用于基于谷胱甘肽树脂上进行的纯化。还 有数种其它的亲和标签并且已经进行了深入评论(Terpe，2003)。
原则上可以将重组表达的蛋白导向三个不同的位置，即细胞质、 周质或培养基。将重组蛋白导向特定细胞区室具有不同的优点和缺点。 在细胞质中表达通常是优选的，因为产率高。在大肠杆菌中，二硫键 的形成被隔离，在周质中被Dsb系统活性地催化(Rietsch和Beckwith， 1998)。在细胞质中，硫氧还蛋白和谷氧还蛋白实现半胱氨酸的还原。 硫氧还蛋白还原酶使硫氧还蛋白保持还原，谷胱甘肽使谷氧还蛋白保 持还原。谷胱甘肽还原酶使低分子量的谷胱甘肽分子还原。编码这两 种还原酶的trxB和gor基因的破坏允许在大肠杆菌细胞质中形成二硫 键。
就产生的蛋白的质量和数量而言，基于细胞的表达系统具有缺点， 并且并不总是适合于高通量生产。可以通过使用无细胞翻译系统来克 服很多这些缺点。
已经针对很多不同的原核和真核系统描述了用于体外基因表达和 蛋白合成的无细胞系统(见Endo&Sawasaki Current Opinion in Biotechnology 2006，17：373-380)。真核的无细胞系统，例如兔网 织红细胞裂解物和小麦胚提取物，是从包含体外转录RNA模板的翻译 所需的所有成分的粗提取物制备而来的。真核的无细胞系统使用体内 或体外合成的分离的RNA作为模板以进行翻译反应(例如兔网织红细 胞裂解物系统或小麦胚提取物系统)。偶联的真核无细胞系统组合了 原核噬菌体RNA聚合酶与真核提取物，并且利用具有噬菌体启动子的 外源DNA或由PCR产生的模板以进行体外蛋白合成(例如，偶联 的网织红细胞裂解物)。
使用偶联系统翻译的蛋白可用于多种类型的功能性研究。 偶联的转录/翻译反应传统地被用于确认开放阅读框，研究蛋白 突变和在体外制备蛋白以用于蛋白-DNA结合研究，蛋白活性测定，或 蛋白-蛋白相互作用研究。最近，使用偶联系统表达的蛋白已经 被用于确认酵母双杂交反应的测定法中，进行体外表达克隆(IVEC)和 制备用于酶活性或蛋白修饰测定的蛋白底物。关于在多种应用中使用 偶联系统的最近的文献的列举，请访问www.promega.com。
可以通过本领域已知的方法改善纯化的含有肽配体结构域的多肽 的溶解性。例如，为了增强表达的蛋白(例如，在大肠杆菌中表达的) 的溶解性，可以通过降低生长温度、使用较弱的启动子、使用低拷贝 数的质粒、降低诱导剂浓度、改变生长培养基来降低蛋白合成速率， 见Georgiou和Valax(Current Opinion Biotechnol.7：190-197 (1996))的描述。这会降低蛋白合成速率，通常会获得更可溶的蛋白。 也可以添加正确折叠或蛋白稳定性必不可少的辅基或辅因子，或添加 缓冲剂以控制生长过程中培养基中的pH波动，或添加1％的葡萄糖以 阻止乳糖(在多数富集培养基例如LB、2xYT中存在乳糖)对lac启动 子的诱导。也可以向培养基中添加多元醇(例如山梨醇)和蔗糖，因 为这些添加物引起的渗透压的升高会导致细胞中渗透保护剂的积累， 渗透保护剂会稳定天然蛋白的结构。可以添加乙醇、低分子量的硫醇 和二硫化物和NaCl。此外，可以与需要的多肽共表达伴侣和/或折叠 酶。分子伴侣通过与折叠中间体的瞬时相互作用而促进正确的异构化 和细胞靶向。大肠杆菌伴侣系统包括但不限于：GroES-GroEL、 DnaK-DnaJ-GrpE、CIpB。
折叠酶加速折叠途径中的限速步骤。有三种类型的折叠酶具有重 要作用：肽基脯氨酰顺式/反式异构酶(PPI′s)、二硫化物氧化还原酶 (DsbA)和二硫化物异构酶(DsbC)，蛋白二硫化物异构酶(PDI)，后者是 真核蛋白，其催化蛋白半胱氨酸氧化和二硫键异构化。这些蛋白中的 一种或多种与靶蛋白的共表达可以产生更高水平的可溶性靶蛋白。
可以以融合蛋白的形式产生包含肽配体结构域的多肽，以改善其 溶解性和产量。所述融合蛋白包含含有肽配体结构域的多肽和在框内 融合在一起的第二多肽。所述第二多肽可以是本领域已知的融合配对 物以改善与其融合的多肽的溶解性，例如，NusA、细菌铁蛋白(BFR)、 GrpE、硫氧还蛋白(TRX)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。Novagen Inc. (Madison，WI)提供了pET 43.1载体系统，其允许形成NusA-靶标融 合物。已经表明：当用作融合配对物时，DsbA和DsbC对表达水平具 有积极影响，因此它们可用于与肽配体结构域融合以实现较高的溶解 性。
在此类融合蛋白的一个方面，表达的含有肽配体结构域的多肽包 括连接子多肽，所述连接子多肽包含蛋白酶切割位点，所述蛋白酶切 割位点包括可被蛋白酶水解的肽键。结果，可以在表达之后通过蛋白 水解使多肽中的肽配体结构域与多肽的其余部分分离。所述连接子可 以在蛋白酶的催化位点相结合的所述键的任一侧包含一个或多个另外 的氨基酸，(见，例如，Schecter和Berger，Biochem.Biophys.Res. Commun.27，157-62(1967))。或者，连接子的切割位点可以与蛋白酶 的识别位点间隔开，并且两个切割位点与识别位点可以被一个或多个 (例如2-4个)氨基酸间隔开。在一个方面，连接子包含至少大约2、 3、4、5、6、7、8、9、大约10、大约20、大约30、大约40、大约 50或更多个氨基酸。更优选地，连接子长度为大约5至大约25个氨 基酸，最优选地，连接子长度是大约8至大约15个氨基酸。
在以下文献中讨论了可用于本发明的一些蛋白酶：Hooper等人， Biochem.J.321：265-279(1997)；Werb，Cell 91：439-442(1997)； Wolfsberg等人，J.Cell Biol.131：275-278(1995)；Murakami& Etlinger，Biochem.Biophys.Res.Comm.146：1249-1259(1987)； Berg等人，Biochem.J.307：313-326(1995)；Smyth和Trapani， Immunology Today 16：202-206(1995)；Talanian等人，J.Biol. Chem.272：9677-9682(1997)；以及Thornberry等人，J.Biol.Chem. 272：17907-17911(1997)。根据本发明，也可以使用细胞表面蛋白酶 和可切割的连接子，包括但不限于：氨肽酶N；嘌呤霉素敏感性氨肽 酶；血管紧张素转化酶；焦谷氨酰肽酶II；二肽基肽酶IV；N-精氨酸 二元转化酶；内肽酶24.15；内肽酶24.16；淀粉样蛋白前体蛋白分泌 酶α、β和γ；血管紧张素转化酶分泌酶；TGFα分泌酶；TNFα分泌 酶；FAS配体分泌酶；TNF受体-I和TNF受体-II分泌酶；CD30分泌 酶；KL1和KL2分泌酶；IL6受体分泌酶；CD43、CD44分泌酶；CD16-I 和CD16-II分泌酶；L-选择素分泌酶；叶酸受体分泌酶；MMP 1、2、3、 7、8、9、10、11、12、13、14和15；尿激酶纤溶酶原激活剂；组织 纤溶酶原激活物；纤溶酶；凝血酶；BMP-1(前胶原C-肽酶)；ADAM 1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10和11；以及Granzymes A、B、C、D、E、 F、G和H。
依赖于细胞相关蛋白酶的替代性方式是使用自我切割的连接子。 例如，口足病病毒(FMDV)2A蛋白酶可用作连接子。其是17个氨基酸 的短的多肽，其在2A/2B接合点切割FMDV的多聚蛋白。FMDV 2A前 肽的序列是NFDLLKLAGDVESNPGP。切割发生于肽C-末端的最后的甘氨 酸-脯氨酸氨基酸对处，并且不依赖于其它FMDV序列的存在，即使在 存在异源序列的情况下也切割。
可以单独使用亲和色谱或与离子交换、分子筛或HPLC色谱技术联 合用于纯化含有肽配体结构域的多肽。可以使用柱或以批式形式进行 此类色谱技术。此类色谱纯化方法是本领域熟知的。
另外，本发明提供了编码含有肽配体结构域的多肽的分离的核酸， 所述多肽在SEQ ID NO：1和/或2的序列中具有一个或多个氨基酸替 换和插入或缺失：大约1至大约5个氨基酸，优选大约1至大约3个 氨基酸，更优选1个氨基酸，其中相关性质基本上类似于原始肽显示 出的性质。
可以通过本领域已知的数种方法中的任意方法进行诱变。一般而 言，可以通过将核酸序列克隆进入质粒或一些其它的易于操作序列的 载体来进行诱变。然后，鉴定或在核酸序列中插入可以向所述核酸序 列中添加另外的核酸的独特限制性位点。通常从重叠的合成单链正义 和反义寡核苷酸中产生双链的合成寡核苷酸，从而所述双链寡核苷酸 中引入侧接靶序列的限制性位点，并且例如可用于引入替代性DNA。 以限制性酶切割质粒或其它载体，将具有相容性粘末端的寡核苷酸序 列连接进入质粒或其它载体中以替换原始DNA。
其它体外定点诱变方法是本领域技术人员已知的并且是可实现的 (尤其是，使用重叠延伸聚合酶链式反应(PCR)，见，例如，Parikh& Guengerich，Biotechniques 24：428-431(1998))。与变化位点重叠 的互补性引物可用于在混合物中PCR扩增完整质粒，所述混合物包含 500mM dNTP，2单位的Pfu聚合酶，250ng每种正义和反义引物，以 及200ng包含编码含有肽配体结构域的多肽的序列的质粒DNA。PCR 优选包括18个循环，对于每Kb的DNA，延伸时间为2.5分钟。可以 以DpnI(其仅消化腺嘌呤甲基化的质粒DNA)处理PCR产物，并转化 进入大肠杆菌DH5α细胞。可以通过限制性酶消化就引入的变化来筛 选转化子，然后可以通过DNA序列分析来确认。
合适的蛋白检测和含有肽配体结构域的多肽的定量测定方法包括 Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELI SA)、银染、BCA测定(见，例如， Smith等人，Anal.Biochem.，150，76-85(1985))、Lowry蛋白测定 (描述于，例如，Lowry等人，J.Bio1.Chem.，193，265-275(1951)) (其是基于蛋白-铜复合物的比色测定)，以及Bradford蛋白测定(描 述于，例如，Bradford等人，Anal.Biochem.，72，248(1976))(其 依赖于蛋白结合之后考马斯蓝G-250的吸光率的变化)。一旦被表达， 可以通过传统的纯化方法来纯化含有肽配体结构域的多肽，例如离子 交换、大小排阻或C18色谱。
III.偶联肽配体结构域的方法
用于将合适的活性试剂例如治疗剂、化疗剂、放射性核素、多肽 等“偶联”(或“缀合”或“交联”)至含有肽配体结构域的多肽上 的方法在本领域有完善的描述。在制备本文提供的缀合物时，通过本 领域目前已知用于连接两个部分的任意方法将活性试剂直接或间接连 接至肽配体结构域，只要缀合或偶联部分与肽配体结构域的连接不实 质上妨碍肽配体结构域的功能或实质上妨碍活性试剂的功能即可。偶 联可以通过任意合适的方法进行，包括但不限于，离子和共价键，以 及任意其它足够稳定的结合，由此将调节被靶向的试剂的分布。
用于在氨基和巯基之间形成共价键以及用于向蛋白中导入巯基的 多种异双官能交联剂是本领域技术人员已知的(见，例如，Cumber等 人(1992)Bioconjugate Chem.3′：397401；Thorpe等人(1987) Cancer Res.47：59245931；Gordon等人(1987)Proc.Natl.Acad. Sci.84：308312；Walden等人(1986)J.MoI.Cell Immunol.2：191 197；Carlsson等人(1978)Biochem.J.173：723737；Mahan等 人(1987)Anal.Biochem.162：163170；Wawryznaczak等人(1992) Br.J.Cancer 66：361366；Fattom等人(1992)Infect ion&Immun. 60：584589)。这些试剂可用于在肽配体结构域或含有肽配体结构域的 多肽与本文公开的任意活性试剂之间形成共价键。这些试剂包括但不 限于：N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP；二硫化物连接子)； 硫代琥珀酰亚胺6-[3-(2-吡啶二硫)丙酰氨基]己酸酯(硫代 -LC-SPDP)；琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基苄基硫代硫酸酯(SMBT， 受阻的二硫酸酯连接子)；琥珀酰亚胺6-[3-(2-吡啶二硫)丙酰氨基] 己酸酯(LC-SPDP)；硫代琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己 烷-1-羧酸酯(硫代-SMCC)；琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫)丁酸酯 (SPDB；受阻的二硫键连接子)；硫代琥珀酰亚胺2-(7-叠氮-4-甲基 香豆素-3-乙酰胺)乙基-1，3-二硫丙酸酯(SAED)；硫代-琥珀酰亚胺 7-叠氮-4-甲基香豆素-3-乙酸酯(SAMCA)；硫代琥珀酰亚胺6-[α- 甲基-α-(2-吡啶二硫)甲苯酰胺(toluamido)]己酸酯(硫代 -LC-SMPT)；1，4-二-[3′-(2′-吡啶二硫)丙酰氨基]丁烷(DPDPB)；4- 琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶硫)-甲苯(SMPT，受阻的二 硫酸酯连接子)；硫代琥珀酰亚胺6[α-甲基-α-(2-吡啶二硫)甲苯 酰胺]己酸酯(硫代-LC-SMPT)；m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰 亚胺酯(MBS)；m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(硫代 -MBS)；N-琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB；硫醚连接子)； 硫代琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(硫代-SIAB)；琥珀酰亚 胺4(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)；硫代琥珀酰亚胺-4-(对马 来酰亚胺苯基)丁酸酯(硫代-SMPB)；叠氮苯甲酰基酰肼(ABH)。
其它的异双官能可切割的偶联剂包括：N-琥珀酰亚胺(4-碘乙 酰)-氨基苯甲酸酯；硫代琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)-氨基苯甲酸酯；4- 琥珀酰亚胺-氧基羰基-a-(2-吡啶二硫)-甲苯；硫代琥珀酰亚胺 -6-[a-甲基-a-(吡啶二硫)-甲苯酰胺]己酸酯；N-琥珀酰亚胺-3-(-2- 吡啶二硫)-丙酸酯；琥珀酰亚胺6[3(-(-2-吡啶二硫)-丙酰氨基]己 酸酯；硫代琥珀酰亚胺6[3(-(-2-吡啶二硫)-丙酰氨基]己酸酯； 3-(2-吡啶二硫)-丙酰肼，Ellman氏试剂，二氯三嗪酸 (dichlorotriazinic acid)，S-(2-硫吡啶)-L-半胱氨酸。另外的示 例性的双官能连接化合物公开于美国专利号5,349,066、5,618,528、 4,569,789、4,952,394和5,137,877。
或者，可以使用例如多肽硫氢基进行缀合。另外，与糖蛋白例如 抗体结合的糖部分可以被氧化以形成可用于本领域已知的多种偶联程 序的醛基。根据本发明形成的缀合物在体内可以是稳定的或不稳定的， 例如可酶促降解的四肽键或酸不稳定性的顺式-乌头酰(aconityl)或 腙键。
任选地，含有肽配体结构域的多肽通过一个或多个连接子与活性 试剂连接。连接子部分根据所需的性质来选择。例如，可以选择连接 子部分的长度以优化配体结合的动力学和特异性，包括由于配体与靶 受体结合而诱导的任何构象变化。连接子部分的长度和灵活性应该足 以允许多肽配体部分与靶细胞受体自由地相互作用。如果连接子太短 或太刚硬，则在多肽配体部分与细胞毒素之间可能会有空间位阻。如 果连接子部分太长，则活性试剂可能在生产过程中被降解，或者可能 不会将所需的效应有效递送至靶细胞。
本文中可以使用本领域技术人员已知的任意合适的连接子。一般 而言，那些是融合蛋白的缀合物中将使用与通过化学方式产生的缀合 物中的连接子不同的一组连接子。适合用于化学连接的缀合物的连接 子和键包括但不限于：二硫键、硫醚键、受阻的二硫键和自由反应基 例如胺和巯基之间的共价键。使用异双功能试剂产生这些键以在多肽 中的一个或二者中产生活性巯基，然后使一个多肽上的巯基与另一个 多肽上的活性巯基或胺基(其上可以连接活性马来酰亚胺基或巯基) 反应。其它的连接子包括：酸可切割的连接子，例如双马来酰亚胺乙 氧基丙烷(bismaleimideothoxy propane)，酸不稳定性转铁蛋白缀合 物和己二酸二酰肼，其将在更加酸性的细胞内区室内被切割；在暴露 于UV或可见光后被切割的交联连接子，以及连接子。在一些实施方式 中，可以包括数种连接子以利用每种连接子的优点。可以通过将连接 子共价偶联至含有肽配体结构域的多肽和被靶向的试剂来插入化学连 接子和肽连接子。如下文描述的异双官能试剂可用于进行此类共价偶 联。还可以通过以融合蛋白形式表达编码连接子和肽配体结构域的 DNA，编码连接子和活性试剂的DNA，或者编码肽配体结构域、连接子 和活性试剂的DNA来连接肽连接子。在本文中也考虑单独使用或与其 它连接子一起使用弹性连接子和增加缀合物溶解性的连接子。
因此，连接子可以包括但不限于：肽键、氨基酸和肽键，其通常 包含1至大约60个氨基酸，更优选大约10至30个氨基酸。或者，化 学连接子，例如异双官能可切割的关联连接子，包括但不限于：N-琥 珀酰亚胺(4-碘乙酰)-氨基苯甲酸酯；硫代琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)- 氨基苯甲酸酯；4-琥珀酰亚胺-氧基羰基-a-(2-吡啶二硫)-甲苯；硫 代琥珀酰亚胺-6-[a-甲基-a-(吡啶二硫)-甲苯酰胺]己酸酯；N-琥珀 酰亚胺-3-(-2-吡啶二硫)-丙酸酯；琥珀酰亚胺6(3(-(-2-吡啶二 硫)-丙酰氨基)己酸酯；硫代琥珀酰亚胺6(3(-(-2-吡啶二硫)-丙酰 氨基)己酸酯；3-(2-吡啶二硫)-丙酰肼，Ellman氏试剂，二氯三嗪酸， 和S-(2-硫吡啶)-L-半胱氨酸。
其它的连接子包括三苯甲基连接子，尤其是衍生的三苯甲基以产 生一类缀合物，其提供在不同的酸度或碱度时释放治疗剂。通过预先 选择治疗剂被释放时的pH范围而提供的灵活性允许基于需要递送治 疗剂的组织之间的已知的生理差异来选择连接子(见，例如，美国专利 号5,612,474)。例如，肿瘤组织的酸度似乎比正常组织低。
也可以使用酸可切割的连接子，光可切割的连接子和热敏感性连 接子，尤其是在需要切割被靶向的试剂以允许其更容易地进入反应的 情况下。酸可切割的连接子包括但不限于：二马来酰亚胺乙氧基丙烷 (bismaleimideothoxy propane)和己二酸二酰肼连接子(见，例如， Fattom等人(1992)Infection&Immun.60：584589)，以及酸不稳 定性转铁蛋白缀合物，其包含足够的转铁蛋白部分以允许进入细胞内 转铁蛋白循环途径(见，例如，Welhoner等人(1991)J.Biol.Chem. 266：43094314)。
光可切割的连接子是在暴露于光后被切割的连接子(见，例如， Goldmacher等人(1992)Bioconj.Chem.3：104107，该连接子通过 引用方式并入本文)，从而在暴露于光后释放被靶向的试剂。在暴露于 光后被切割的光可切割的连接子是已知的(见，例如，Hazum等人 (1981)in Pept，Proc.Eur.Pept.Symp.，16th，Brunfeldt，K(Ed)， pp.105110，其描述了使用硝基苯甲基作为用于半胱氨酸的光可切割 的保护性基团；Yen等人(1989)Makromol.Chem 190：6982，其描 述了水溶性的光可切割的共聚物，包括羟基丙基甲基丙烯酰胺共聚物、 甘氨酸共聚物、荧光素共聚物和甲基罗丹明共聚物；Goldmacher等人 (1992)Bioconj.Chem.3：104107，其描述了在暴露于近紫外光(350 nm)后发生蛋白水解降解的交联剂和反应剂；和Senter等人(1985) Photochem.Photobiol 42：231237，其描述了硝基苄氧基羰基氯化 物交联反应剂，其产生光可切割的键)，从而在暴露于光之后释放被靶 向的试剂。此类连接子在治疗可以使用纤维光学暴露于光的皮肤或眼 科病况中是特别有用的。施用缀合物之后，可以使眼睛或皮肤或身体 的其它部分暴露于光，从而使被靶向的部分从缀合物中释放。此类光 可切割的连接子可以与诊断程序联合使用，其中需要除掉靶向试剂以 允许迅速从动物体内清除。
IV.本发明提供了多种活性试剂
本发明的多个方面涉及偶联于活性试剂即治疗或诊断剂的含有肽 配体结构域的多肽。
如本文使用的术语“治疗剂”是指化学化合物，生物大分子，或 从怀疑具有治疗性质的生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(尤其 是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物，例如化疗剂或放疗剂。如本 文使用的术语“治疗”是指缓解折磨哺乳动物受试者的疾病或相关病 况的影响，治愈或预防(举例而言，预防或减少靶向的疾病例如癌症 或其它增殖性疾病的机会)折磨哺乳动物受试者的疾病或相关病况。 治愈性治疗是指全部或部分地减轻哺乳动物中存在的疾病或病况。
试剂可以是纯化的、实质上纯化的或部分纯化的。此外，此类治 疗剂可以在脂质体或免疫脂质体中或与之结合，缀合可以直接与所述 试剂进行或与所述脂质体/免疫脂质体进行。“脂质体”是由多种类型 的脂、磷脂和/或表面活性试剂组成的小囊泡，其可用于递送药物(例 如，药物、抗体、毒素)。脂质体的成分通常以类似于生物膜的脂排 列的双层形式排列。
可以按照本发明考虑到的方式偶联于含有肽配体结构域的多肽的 示例性治疗剂包括但不限于：化疗剂(例如，多西紫杉醇，紫杉醇， 紫杉烷类化合物和铂化合物)，抗叶酸类，抗代谢药物，抗有丝分裂 剂，DNA损伤剂，促凋亡剂，分化诱导剂，抗血管生成剂，抗生素， 激素，肽，抗体，酪氨酸激酶抑制剂，生物活性试剂，生物分子，放 射性核素，阿霉素，安沙霉素抗生素，天冬酰胺酶，博莱霉素，白消 安，顺铂，卡铂，卡莫司汀，卡培他滨，苯丁酸氮芥，阿糖胞苷，环 磷酰胺，喜树碱，达卡巴嗪，更生霉素，柔红霉素，右雷佐生，多西 紫杉醇，阿霉素，依托泊苷，埃坡霉素，氟尿苷，氟达拉滨，氟尿嘧 啶，吉西他滨，羟基脲，去甲氧柔红霉素，异环磷酰胺，伊立替康， 洛莫司汀，氮芥，巯基嘌呤，美法仑，甲氨蝶呤，雷帕霉素(西罗莫 司)，丝裂霉素，米托坦，米托蒽醌，硝基脲，紫杉醇，帕米膦酸钠， 喷司他丁，光神霉素，甲基苄肼，美罗华，链脲菌素，替尼泊苷，硫 鸟嘌呤，塞替派，紫杉烷类，长春碱，长春新碱，长春瑞滨，紫杉醇， 康普立停，迪科莫奈得(discodermolides)，反铂，酪氨酸激酶抑制 剂(高金雀花碱，genistein)和其它化疗剂。
如本文使用的术语“化疗剂”是指具有抗癌症、肿瘤发生和/或增 殖性疾病的活性的试剂。优选的化疗剂包括：包含白蛋白的颗粒形式 的多西紫杉醇和紫杉醇，其中50％以上的化疗剂是纳米颗粒的形式。 最优选地，化疗剂包含与白蛋白结合的紫杉醇的颗粒，例如
合适的治疗剂还包括，例如，生物活性试剂(tTF的TNF)，放射性 核素(131I，90Y，111In，211At，32P和其它已知的治疗性放射性核 素)，抗血管生成剂(血管生成抑制剂，例如，INF-α，烟曲霉素，血 管抑素，内皮抑素，萨利多胺等)，其它生物活性多肽，治疗致敏剂， 抗体，植物凝集素和毒素。
适合应用本发明的疾病包括恶性和良性病况，以及增殖性疾病， 包括但不限于，其中增殖性疾病是例如良性前列腺增生、子宫内膜异 位症、子宫内膜增生、动脉硬化症、牛皮癣、免疫增殖或增殖性肾小 球病。
术语“治疗上有效量”意思是部分或完全回复至与疾病或病况相 关或诱发疾病或病况的正常生理或生化参数的量。本领域技术人员应 该能够确定相对于特定疾病或病况在治疗上有效的药物组合物的量。 举例而言，根据其中治疗剂是紫杉醇的优选实施方式，施用的紫杉醇 剂量可以是大约30mg/m2至大约1000mg/m2，服药循环为大约三周(即， 大约每三周施用一剂紫杉醇)，优选大约50mg/m2至大约800mg/m2， 优选大约80mg/m2至大约700mg/m2，最优选大约250mg/m2至大约 300mg/m2，服药循环为大约三周，优选以大约2周循环，更优选每周 循环。
本发明还具有诊断性的方面。例如，诊断剂可以是示踪剂或标记 物，包括但不限于：放射活性试剂、MRI造影剂、X射线造影剂、超声 造影剂以及PET造影剂。本发明的这个方面也考虑到这些试剂(如就 治疗剂所描述)的偶联。此外，术语“诊断上有效量”是在相关的临 床环境中允许合理地精确测定组织和器官中的异常增殖、增生、重构、 炎性活性的存在和/或程度的药物组合物的量。例如，根据本发明“诊 断”的病况可以是良性或恶性肿瘤。
本文教导的诊断剂包括多肽，例如抗体，其可以通过共价或非共 价连接提供可检测信号的物质而进行标记。多种标记物和缀合技术是 已知的，并且在科技和专利文献中进入了深入报道。合适的标记物包 括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部 分、磁性颗粒等。教导了此类标记物的用途的专利包括美国专利号 3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437； 4,275,149；和4,366,241。同样，可以产生重组免疫球蛋白，见 Cabilly的美国专利号4,816,567；Moore等人的美国专利号 4,642,334；和Queen等人(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：10029-10033。
此外，在相关的方面，本发明提供了预测或测定肿瘤对化疗剂的 响应的方法，以及预测或测定增殖性疾病对化疗剂的应答或治疗增殖 性疾病的方法，包括但不限于，其中所述增殖性疾病是例如良性前列 腺增生、子宫内膜异位、子宫内膜增生、动脉硬化症、牛皮癣、免疫 增殖或增殖性肾小球病。
VI.抗体或抗体片段活性剂
在本发明的一个具体方面，治疗剂可以是抗体或抗体片段，其介 导下列一项或多项：补体激活，细胞介导的细胞毒性，细胞凋亡，坏 死性细胞死亡和调理作用。
本文中的术语“抗体”包括但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、 二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体可以是 鼠的、人的、人源化的、嵌合的或源自其它物种。抗体是通过免疫系 统产生的蛋白，其能够识别并结合特异性抗原。靶抗原一般具有被多 个抗体上的CDR识别的多个结合位点，也称作表位。与不同表位特异 性结合的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有不止一 种对应的抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子 的免疫活性部分，即，含有免疫特异性地结合目标靶抗原或其部分的 抗原结合位点的分子，此类靶标包括但不限于，产生与自身免疫病相 关的自身免疫抗体的癌细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是任意种类 (例如，IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)或亚类(例如，IgGl，IgG2，IgG3， IgG4，IgA1和IgA2)的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可以源自任意物 种。
“抗体片段”包括全长抗体的保持所需生物活性的部分。“抗体 片段”通常是抗原结合区或其可变区。抗体片段的实例包括：Fab，Fab′， F(ab′)2和Fv片段；diabodies；线性抗体；通过Fab表达文库产生 的片段；抗-特异型(抗-Id)抗体；CDR(互补决定区)和与癌细胞抗 原、病毒抗原或微生物抗原免疫特异性结合的上述任意项的表位结合 片段；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。然而，本 文所述的“抗体片段”也可以是抗体的其它非抗原结合部分，例如但 不限于，抗体片段可以是完整的或部分的Fc结构域。
单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链 的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体中的 相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种的抗体或属于 另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的 片段，只要它们显示出需要的生物学活性(美国专利号4,816,567)。 本文中的目标嵌合抗体包括“灵长类源化的”抗体，其包含源自非人 灵长类(例如旧世界猴或Ape)的可变域抗原结合序列和人类恒定区 序列。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指细胞介导的 反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然 杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗 体，随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达Fc γRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。为了测定目 标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定(美国专利号55,003,621； 美国专利号5,821,337)。用于此类测定的有用的效应子细胞包括外 周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代的或另外， 可以在体内测定目标分子的ADCC活性，例如，在动物模型例如在 Clynes等人PNAS(USA)，95：652-656(1998)中公开的动物模型中测 定。
“诱导细胞死亡”的抗体是引起活细胞变得不存活的抗体。可以 在不存在补体和免疫效应细胞的情况下测定体外细胞死亡，以区分抗 体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC) 诱导的细胞死亡。因此，可以使用热灭活的血清(即在不存在补体的 情况下)和不存在免疫效应细胞的情况下进行细胞死亡测定。为了测 定抗体是否能够诱导细胞死亡，可以测定相对于未经处理的细胞而言 膜完整性的丧失，这可以通过碘化丙啶(PI)、台盼蓝或7AAD的摄取 来评价。诱导细胞死亡的抗体是在PI摄取测定中诱导BT474细胞摄取 PI的那些抗体。
“诱导凋亡”的抗体是诱导程序性细胞死亡的抗体，如通过膜联 蛋白V的结合、DNA的片段化、细胞皱缩、内质网膨胀、细胞片段化 和/或膜囊泡(称作凋亡小体)的形成来测定。
VI.本发明提供了将肽配体结构域与多肽活性试剂偶联的融合蛋 白
本发明还考虑到将肽配体结构域与多肽活性试剂偶联于融合蛋白 中。例如但不限于，可以将肽配体结构域序列融合于诊断上有用的蛋 白结构域(例如半抗原、GFP)、治疗致敏剂、活性蛋白结构域(例如 但不限于，tTF、TNF、Smar1衍生的p44肽、干扰素、TRAIL、Smac、 VHL、前半胱天冬酶、半胱天冬酶和IL-2)或毒素(例如但不限于，篦 麻毒素、PAP、白喉毒素、假单胞菌外毒素)的上游或下游。
“融合蛋白”和“融合多肽”是指具有至少两个彼此共价连接的 部分的多肽，其中每个部分是具有不同性质的多肽。所述性质可以是 生物学性质，例如体外或体内的活性。所述性质也可以是简单的化学 或物理性质，例如与靶分子结合、催化反应等。所述部分可以通过单 一的肽键直接连接或通过含有一个或多个氨基酸残基的肽连接子连 接。一般而言，所述部分和所述连接子将彼此处于读码框内。
VII.调节活性试剂分布的方法
本发明的另一个方面利用了如本文公开的含有肽配体结构域的缀 合物的性质以提供用于调节活性试剂在动物组织内的分布的方法，包 括：向动物施用包含缀合物分子的组合物，所述缀合物分子包含缀合 于活性试剂的肽配体结构域，其中所述肽配体结构域包括SEQ ID NO： 1或2的肽或其同源物，并且相对于单独施用活性试剂时所获得的组 织分布而言，向动物施用所述组合物引起不同的活性试剂组织分布。
本发明的组合物和方法优选地提供了活性试剂向疾病位点的经调 节的组织分布。优选地，其表现为：在疾病位点提供一定浓度的活性 试剂，和/或增加的或延长的(半衰期)活性试剂血液水平，其大于向 动物施用活性试剂(以未缀合的形式)时提供的浓度和水平。这种调 节本身也可以表现为：增大组织摄取缀合肽分子的速率，增大缀合的 肽分子在组织中的扩散速率，和/或增加缀合的肽分子在组织中的分 布，以及，使组织摄取缀合的肽分子的速率与一种或多种组织受体的 内在化速率相匹配。可以通过本领域已知的任意合适的方法来测定此 类增强，包括但不限于，检测、定位和相对定量测定经适当标记的活 性试剂，例如使用放射照相、显微镜、化学、免疫学或MRI技术。
“增大的速率”意思是至少大约高33％，优选至少大约高25％，更 优选至少大约高15％，最优选至少大约高10％的速率。“疾病位点处较 大的浓度”意思是，在疾病位点处，缀合物中的活性试剂的浓度比相 当的疾病位点处未缀合的活性试剂的浓度高至少大约33％，优选高至 少大约25％，更优选高至少大约15％，最优选高至少大约10％。
合适的疾病位点包括但不限于，任意身体组织包括软组织、结缔 组织、骨、实体器官、血管等中的异常增殖的病况、组织重构、增生、 扩大的伤口愈合的位点。此类疾病的更具体的实例包括癌症、糖尿病 或其它肾病、炎症、纤维化、关节炎、血管或人工血管移植物或血管 内装置的再狭窄等。
在优选的方面，本发明提供了诊断和/或治疗肿瘤的方法，其中所 述肿瘤选自：口腔肿瘤、咽肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、骨 肿瘤、软骨肿瘤、骨转移、肉瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、乳腺肿瘤、 生殖系统肿瘤、尿道肿瘤、眼窝肿瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、神经 胶质瘤、内分泌系统肿瘤、甲状腺肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、小肠肿 瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝脏肿瘤、胆囊瘤、胰腺肿瘤、 喉肿瘤、肺的肿瘤、支气管肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、子宫 颈肿瘤、子宫体肿瘤、卵巢肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、前列腺肿瘤、 前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎肿瘤、膀胱肿瘤、肾脏肿瘤、肾孟肿瘤、 输尿管肿瘤、头颈肿瘤、副甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白 血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病。此外，本发明提供了预测 或确定肿瘤对化疗剂的响应的方法，治疗肿瘤的方法，用于预测哺乳 动物肿瘤对化疗剂的应答的试剂盒，其中所述肿瘤是肉瘤、腺癌、鳞 状细胞癌、大细胞癌、小细胞癌、基底细胞癌、透明细胞癌、癌细胞 瘤(oncytoma)或其组合。
在另一方面，本发明提供了组合物和使用所述组合物的方法，其 中，相对于单独使用活性试剂之后获得的血液水平，向动物施用所述 组合物引起更高的活性试剂的血液水平。可以使用任意合适的活性试 剂的血液水平的度量，包括但不限于，Cmax，Cmin和AUC。″大于单独 施用活性试剂后获得的血液水平″意思是：高至少大约33％，优选高至 少大约25％，更优选高至少大约15％，最优选高至少大约10％的血液水 平。
在另一个方面，本发明提供了组合物和使用所述组合物的方法， 其中，相对于单独使用活性试剂之后获得的血液水平半衰期而言，向 动物施用所述组合物引起更长的活性试剂的血液水平半衰期。″大于单 独施用活性试剂后获得的血液半衰期″意思是：高至少大约33％，优选 高至少大约25％，更优选高至少大约15％，最优选高至少大约10％的半 衰期。
VIII.制剂和施用
对于体内使用，优选将偶联于肽配体结构域例如SEQ ID NO：1 和2及其同源物的活性试剂配制成包含药学上可接受的载体的药物组 合物。在本发明的上下文中可以使用任意合适的药学上可接受的载体， 这取决于施用途径。本领域技术人员将认识到可以用于提供适合于所 需施用方法的药物组合物的那些载体。
本发明的药物组合物的施用可以通过任意合适的途径完成，包括 但不限于：静脉内、皮下、肌内、腹膜内、肿瘤内、经口、经直肠、 经阴道、膀胱内和吸入施用，其中静脉内和肿瘤内施用是最优选的。 组合物还可以包含任意其它合适的成分，尤其是用于增强组合物的稳 定性和/或其终用途。因此，本发明的组合物有多种合适的制剂。以下 制剂和方法仅仅是示例性的，绝不是限制。
如果需要，药物组合物还可以包括另外的治疗剂或生物活性试剂。 例如，可以存在可用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子 例如布洛芬或类固醇可以是组合物的一部分，以减少与体内施用药物 组合物相关的肿胀和炎症以及生理疼痛。
载体通常是液体，但也可以是固体，或液体与固体成分的组合。 载体优选为生理上可接受的(例如药学上可接受的或药理学上可接受 的)载体(例如赋形剂或稀释剂)。生理上可接受的载体是本领域熟 知的并且是可以容易获得的。载体的选择将至少部分由靶组织和/或细 胞的位置以及用于施用组合物的特定方法决定。
通常而言，此类组合物可以配制为可注射的液体溶液或悬浮液； 也可以配制为适合用于在注射前通过添加液体来制备溶液或悬浮液的 固体形式；制备物也可以是乳化的。适合于可注射用途的药物制剂包 括无菌水性溶液或分散液；含有已知的蛋白稳定剂和冻干保护剂的制 剂；含有芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于即用即配的 无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有的情况下，制剂必须是 无菌的并且其流动性必须达到容易注射的程度。其在生产和储存的条 件下必须是稳定的，并且必须能抗微生物例如细菌和真菌的污染作用 而保存。可以在水中通过适宜地与表面活性试剂例如羟基纤维素混合 来制备游离碱或药学上可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在 甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散液。在通常的储 存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以阻止微生物的生长。
含有肽配体结构域的缀合物，可以配制为例如中性或盐形式的组 合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成) 以及与无机酸例如盐酸或磷酸形成的盐，以及与有机酸例如乙酸、草 酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自 无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁， 以及有机碱例如异丙胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。
适合于非肠道施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液， 其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受体的血液 等渗的溶质；水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶 剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂的形式可以是单元剂量或多剂的 密封的容器，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的 条件下，在临使用前，仅需要添加无菌的液体赋形剂例如用于注射的 水。可以从无菌粉末、颗粒和之前描述的类型的片剂来制备即用型的 注射溶液和悬浮液。在本发明的一个优选实施方式中，将含有肽配体 结构域的缀合物配制为用于注射(例如，非肠道施用)。在这个意义 上，所述制剂优选适合于肿瘤内施用，但也可以配制为用于静脉内注 射、腹膜内注射、皮下注射等。
如果需要，本发明还提供了这样的实施方式：其中含有肽配体结 构域的缀合物(即，缀合于活性试剂的含有肽配体结构域的多肽)进 一步缀合于聚乙二醇(PEG)。PEG缀合能够增加这些多肽的循环半衰 期，降低多肽的免疫原性和抗原性，并改善其生物活性。如果使用， 则可以使用任意合适的PEG缀合方法，包括但不限于：使甲氧基-PEG 与肽的可供利用的氨基或其它活性反应位点例如组氨酸或半胱氨酸反 应。此外，可以使用重组DNA技术将具有PEG反应活性基团的氨基酸 添加到含有肽配体结构域的缀合物中。此外，根据本发明的这个方面， 可以使用可释放的和杂合的聚乙二醇化策略，例如多肽的聚乙二醇化， 其中，添加到含有肽配体结构域的缀合物分子上的某些位点的PEG分 子在体内被释放。PEG缀合方法的实例是本领域已知的。见，例如， Greenwald等人，Adv.Drug Delivery Rev.55：217-250(2003)。
适合于通过吸入施用的制剂包括气溶胶制剂。可以将气溶胶制剂 置于加压的可接受的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。 它们还可以被配制为非加压的制剂，用于从喷雾器或雾化器递送。
可以通过将活性成分与多种基底例如乳化基底或水溶性基底混合 而将适合用于肛门施用的制剂制备为栓剂。适合于阴道施用的制剂可 以是阴道栓剂、棉塞、霜、凝胶、糊、泡沫或喷雾制剂的形式，其中 除了活性成分之外，还含有例如本领域已知的这类载体。
此外，本发明的组合物可以包括另外的治疗剂或生物活性试剂。 例如，可以存在可用于治疗特定适应症的治疗因子。控制炎症的因子 例如布洛芬或类固醇可以是组合物的一部分，以减少与体内施用药物 组合物相关的肿胀和炎症以及生理疼痛。
在吸入式治疗的情况下，本发明的药物组合物优选以气溶胶的形 式存在。用于施用药剂(如果是固体形式)的气溶胶和喷雾发生器是 可以获得的。这些发生器提供可呼吸的或可吸入的颗粒，并以适合于 人类施用的速率产生一定体积的气溶胶，其中含有预先确定计量的剂 量的药物。此类气溶胶和喷雾发生器的实例包括本领域已知的带计量 的剂量吸入器和吹药器。如果是液体形式，则本发明的药物组合物可 以通过任意合适的装置进行气雾化。
当用于静脉内、腹膜内或肿瘤内施用时，本发明的药物组合物可 以包含活性化合物的无菌的水性和非水性注射溶液、悬浮液或乳液， 其中所述制剂优选与目标接受体的血液等渗。这些制剂可以包含下列 一项或多项：抗氧化剂、缓冲剂、表面活性试剂、助溶剂、抑菌剂、 使组合物与目标接受体的血液等渗的溶质和本领域已知的其它制剂成 分。水性和非水性的无菌悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。组合物的 形式可以是单元剂量或多剂的容器，例如密封安瓿和小瓶。
本发明的方法还可以是组合治疗的一部分。术语“组合治疗”是 指：按照顺次或同时的方式与另一种治疗组合物联合施用根据本发明 的治疗剂，从而在接受治疗的哺乳动物中实现该组合的有益效果。
XI.本发明适用于多种病况
本发明的组合物和方法适合用于诊断或治疗多种疾病，包括但不 限于，其中疾病位点是，任意身体组织包括软组织、结缔组织、骨、 实体器官、血管等中的异常增殖的病况、组织重构、增生、扩大的伤 口愈合的位点。此类疾病的更具体的实例包括癌症、糖尿病或其它肾 病、炎症、纤维化、关节炎、血管或人工血管移植物或血管内装置的 再狭窄等。
在一个优选的方面，本发明提供了诊断和/或治疗肿瘤的方法，其 中所述肿瘤选自：口腔肿瘤、咽肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、 骨肿瘤、软骨肿瘤、骨转移、肉瘤、皮肤肿瘤、黑色素瘤、乳腺肿瘤、 生殖系统肿瘤、尿道肿瘤、眼窝肿瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、神经 胶质瘤、内分泌系统肿瘤、甲状腺肿瘤、食道肿瘤、胃肿瘤、小肠肿 瘤、结肠肿瘤、直肠肿瘤、肛门肿瘤、肝脏肿瘤、胆囊瘤、胰腺肿瘤、 喉肿瘤、肺的肿瘤、支气管肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、子宫 颈肿瘤、子宫体肿瘤、卵巢肿瘤、外阴肿瘤、阴道肿瘤、前列腺肿瘤、 前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎肿瘤、膀胱肿瘤、肾脏肿瘤、肾孟肿瘤、 输尿管肿瘤、头颈肿瘤、副甲状腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、 多发性骨髓瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白 血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病。此外，本发明提供了预测 或确定肿瘤对化疗剂的响应的方法，治疗肿瘤的方法，用于预测哺乳 动物肿瘤对化疗剂的应答的试剂盒，其中所述肿瘤是肉瘤、腺癌、鳞 状细胞癌、大细胞癌、小细胞癌、基底细胞癌、透明细胞癌、癌细胞 瘤或其组合。
本发明提供了这样的实施方式，其中所述疾病是哺乳动物包括但 不限于人中的疾病。
X.试剂盒
本发明提供了用于治疗肿瘤的试剂盒，其包含药物制剂和在治疗 肿瘤中使用该制剂的说明书，其中所述药物制剂包含缀合物分子，所 述缀合物分子包含缀合于活性试剂的肽配体结构域，并且其中所述肽 配体结构域包括SEQ ID NO：1的肽或其同源物，其中所述肽配体结构 域针对人血清白蛋白具有亲和力，该亲和力表征为大约700μM或更 低的平衡解离常数(Kd)，任选地，其中所述缀合物分子还包含第二 肽配体结构域(例如，SEQ ID NO：2)，以及使用所述试剂盒的说明 书(例如，FDA批准的包装插页)。
以下实施例进一步诠释了本发明，但是，当然不应该被解释为以 任何方式限制其范围。
实施例1
本实施例证明了抗SPARC抗体对SPARC的特异性结合。
通过超声处理从HUVEC细胞制备完整细胞提取物。在5-15％ SDS-PAGE上分离蛋白质，将其转移至PVDF膜上，利用抗SPARC多克 隆抗体和抗SPARC单克隆抗体进行显示。两种抗体都与38kDa(SPARC 的正确分子量)处的单个条带反应。当通过相同方法分析MX-1肿瘤细 胞系时，在澄清的细胞裂解物或富含膜的膜级分中都检测到SPARC。
实施例2
本实施例证明在正常组织中不存在SPARC的表达。
免疫染色正常人和小鼠组织，并且使用肿瘤和正常组织阵列对 SPARC染色评分(0-4)。使用多克隆兔抗SPARC抗体进行免疫染色。除 了食道外，SPARC未在任何正常组织中表达。同样地，SPARC未在除了 雌性小鼠的肾脏外的任何正常小鼠组织中表达。然而，该表达可能归 因于与SPARC同源的卵泡抑素。
人正常组织中SPARC的表达
小鼠正常组织
实施例3
本实施例举例说明了MX-I肿瘤细胞中SPARC的表达。
将MX-1细胞培养在盖玻片上并且用使用本领域内已知的方法用 抗人SPARC抗体染色。观察到抗体染色，这证明MX-1表达SPARC。这 些结果暗示MX-1肿瘤细胞中检测到的SPARC表达是MX-1肿瘤细胞分 泌SPARC的结果。对MX-1肿瘤细胞的染色比正常原代细胞例如 HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、HLMVEC(人肺微血管内皮细胞)和HMEC(人 乳腺上皮细胞)的染色更强。虽然大部分SPARC染色是内部SPARC，但 如通过未透化细胞的共聚焦显微镜和染色所显示的，检测到显著水平 的表面SPARC。
实施例4
本实施例举例说明了人乳腺癌细胞中SPARC蛋白的过表达。
使用来自Cybrdi，Inc.(Gaithersburg，MD)的肿瘤阵列测定人 乳腺癌细胞中SPARC的表达。该分析的结果示于表1中。将染色的强 度评分为“阴性”至4+，更大的数字相应于更高的过表达强度。与1％ 的正常组织相比较，49％的乳腺癌对于SPARC而言染色呈阳性(2+和以 上)。
表1
实施例5
本实施例证明SPARC在具有高应答率(通过使用纳米颗粒白蛋白 结合的紫杉醇(ABI-007))的鳞细胞头颈癌中过表达。
在具有头与颈(H&N)和肛管的鳞状细胞癌(SCC)的患者的I期和II 期临床研究中，对于动脉内递送的纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇 (ABX或ABI-007)分别观察到78％和64％的应答率(参见， 例如，Damascelli等人，Cancer，92(10)，2592-2602(2001)和 Damascelli等人，AJR，181，253-260(2003))。在比较ABX和紫杉 醇(TAX)的体外细胞毒性中，我们观察到鳞状宫颈(squamous cervix) (A431)系显示ABX(0.004μg/ml)相对于TAX(0.012μg/ml)有提 高的IC50。最近证明了紫杉醇(P)的白蛋白介导的跨内皮陷窝运输和 ABX相对于TAX的P的增加瘤内积累(参见，例如，Desai，SABCS 2003)。
对人H&N肿瘤组织(n＝119)和正常人H&N组织(n＝15)进行免疫染 色，然后使用肿瘤和正常组织阵列就SPARC染色评分(0-4+)。使用多 克隆兔抗SPARC抗体进行免疫染色。在新的I期剂量递增研究(ABX在 30分钟内经IV给药，q3w)中，就对ABX的应答分析一个亚组的头颈 癌患者(n＝3)。
相对于正常组织中的0％(0/15)，SPARC在60％(72/119)的H&N 肿瘤中过表达(评分＞2+)(p＜0.0001)。
表2.
在新的I期剂量递增研究(ABX在30分钟内经IV给药，q3w)中， 就对ABX的应答分析一个亚组的头颈癌患者(n＝3)。在该研究中，2/3 H&N患者在以135mg/m2(1pt)和225mg/m2(1pt)的剂量水平进行 的2轮处理后获得部分应答(PR)。1/3的患者在260mg/m2的剂量水平 上进展。就SPARC对这些患者的肿瘤组织进行染色，应答的患者之一 显示SPARC的强过表达。
实施例5
本实施例证明SPARC-白蛋白相互作用。
将全长野生型SPARC(″WT″)、其中残基3上的谷氨酰胺缺失的 SPARC缺失突变体(″Q3″)或用组织蛋白酶K处理的SPARC固定在PVDF 膜上，并且将其与浓度不断降低的掺有Alexa fluor 488缀合的牛血 清白蛋白的人血清白蛋白接触。
在最初的实验中，通过在4℃下温育(5μg/孔)过夜将全长野生 型SPARC和“Q3”突变SPARC多肽固定至PVDF附着的96孔板上。第 二天，用DPBS洗涤板，用5％的DPBS中的脱指奶粉封闭1小时。向每 一个孔中加入100μl DPBS。将一小瓶Alexa 488-BSA(5mg)溶解 在1.2ml 25％人血清白蛋白(″HSA″)中，并且向板的第一行的孔中加 入100μl BSA-HAS混合物(导致第一行中Alexa 488-BSA的终浓度 变成约200μg/孔)。向下对每一列进行系列稀释，将板在黑暗位置 温育1小时。在1小时温育后，用PBS洗涤膜，通过荧光板读数器定 量剩余的白蛋白的量。
图2显示SPARC和Q 3突变体结合白蛋白。跟踪竞争性研究显示白 蛋白对SPARC的结合显示5％的IC50。对于WT和Q3多肽观察到相似的 结合。
实施例6
本实施例将示例性肽配体结构域(SPARC白蛋白相互作用序列) 定位至相应于SEQ ID NO：1的SPARC序列。
将30μg的重组人(″rh″)SPARC与0.4μg组织蛋白酶K一起 温育10、30、60和120分钟。组织蛋白酶K消化产物的聚丙烯酰胺凝 胶电泳示于图3中。图4显示组织蛋白酶K将SPARC切割成3个片段。 结合实验显示白蛋白对rhSPARC的结合可被组织蛋白酶K降解(60分 钟)阻断，从而表明SPARC白蛋白结合结构域位于C末端半胱氨酸稀少 的结构域中(图5)。因此，制备覆盖SPARC C末端半胱氨酸稀少的 结构域的重叠15聚体肽(图6)。
将15聚体的覆盖SPARC C-末端半胱氨酸稀少的结构域的肽用于 竞争性结合测定。具体地，通过在4℃下温育(5μg/孔)过夜将SPARC 肽固定至PVDF-附着的96孔板。第二天用DPBS洗涤板，利用DPBS中 的5％脱脂奶粉封闭1小时。接着，除了第一行的孔外，向每一个孔中 加入100μl DPBS。用1.2ml的25％HAS溶解一小瓶Alexa 488-BSA (5mg)。然后，将100μl BSA-HAS与100μl在DPBS中配制为4mg/ml 的SPARC肽混合(导致第一行中的Alexa 488-BSA和肽的终浓度为各 自约200ug/孔)。每一列向下进行系列稀释。将板在黑暗处温育1小 时，洗涤板，然后读取荧光。例如图7中所示，在两个实验中，只有 肽#47抑制白蛋白对SPARC的结合。为了进一步定位SPARC白蛋白结 合位点，产生SPARC亚片段(图8)。具体地，肽#103(MYIFPVHWQFG)(SEQ ID NO：66)和#104(FPVHWQFGQLDQHPI)是唯一活性肽(肽#47)的亚 片段。如图9中所显示的，这些肽具有部分活性，这暗示着全长肽47 是完全活性所必需的。
实施例7
本实施例证明SEQ ID NO：2作为白蛋白结合序列的发现。就结合 人血清白蛋白(HSA)的肽筛选商业肽噬菌体显示文库(M13中的12聚 体肽)(参见图10)。如下进行4轮淘选：
1.通过将100ug/ml HAS溶液涂铺在12孔板的孔上，将孔与1-2 x 1011pfu噬菌体接触来筛选噬菌体文库。用0.2M甘氨酸，pH2.2缓 冲液洗脱结合的噬菌体以产生15x 105pfu/ml(其在扩增后变成5x 1013pfu/ml)；
2.用0.2M甘氨酸，pH 2.2缓冲液洗脱第2轮淘选以产生12x106pfu/ml(在扩增后8x 1013pfu/ml)；
3.用250ug/ml HAS洗脱第3轮淘选进行1小时以产生5x 105pfu/ml(在扩增后2x 1012pfu/ml)；和
4.用0.2M甘氨酸，pH2.2缓冲液洗脱第4轮淘选以产生14x 108 pfu/ml。在第4轮淘选后，选择约100个噬菌斑，对其进行扩增和测 序。测序结果示于图11中。最常见序列KNHGATRTTRAS(肽47；SEQ ID NO：2)被认为可能是真正的配体，而第二常见序列WPHHHHTRLSTV是高 度碱性的，其被认为可能是非特异性结合的结果。
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在本文中描述了本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的用 于实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读了上述说明书 之后，那些优选实施方式的变体会变得明显。本发明人预期技术人员 视情况而应用此类变体，本发明人想到本发明可以按照除了本文特异 性描述以外的方式来实施。因此，本发明包括适用法律所允许的随附 的权利要求中提及的主题的所有修饰和等同物。此外，除非本文另有 指明或上下文明显矛盾，否则本发明中包括上述要素的以其所有可能 变体进行的任意组合。