技术领域
本发明涉及宫颈癌防治领域，尤其是人乳头瘤病毒58型(以下简称HPV58型)治疗 性复合基因疫苗及其构建方法。
背景技术
子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳 腺癌。我国每年有新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.8％，每年死于 宫颈癌的患者约5万人，大部分位于经济欠发达的西部地区如广西。目前，晚期宫颈癌患 者采用外科手术、放疗、化疗等传统模式疗效欠佳，5年生存率仅有50％。宫颈癌的病因 学研究表明：高危型HPV感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素。由于几乎所有宫颈 癌细胞中都有HPV DNA和病毒转化蛋白的表达，HPV病毒蛋白作为一种抗原可刺激机体产 生针对HPV的免疫反应，这就促使人们希望通过疫苗免疫治疗的方法来治疗和预防宫颈癌。 HPV58型是1988年先后由中国和日本学者发现。我国最近完成的两项中国与亚洲妇女子宫 颈中HPV型别分布的Meta研究结果显示：HPV58是在我国子宫颈癌妇女中继HPV16和18 之后的另一重要的HPV优势型别，是我国北方和南方乃至亚洲地区子宫颈癌标本中均为第 3位最常见的HPV型别。由于全球HPV16和18分布广泛而58型仅在亚洲各国比较常见， 使西方国家对于HPV58型的研究极少。目前国外不论是已经上市或正在研究的HPV疫苗， 都以16和18型为主，并没有包含58型。并且目前上市的仅有HPV预防性疫苗，对于已 经罹患HPV感染甚至发展为宫颈癌前病变或宫颈癌的患者无效。由于HPV16、18与58基 因的同源性仅有60％，一些HPV16型常用的抗原表位如HPV16E711-20、49-57在HPV58型 并不存在，因此，HPV16、18型疫苗对HPV58型感染并没有交叉保护作用。目前关于HPV16 和18型疫苗的研究已经很多，但对于HPV58型疫苗的研究仍然非常缺乏。面对我国宫颈 癌患者中HPV58高感染率的现状，HPV58型治疗性疫苗研制是非常必要和迫切的。
目前研究HPV疫苗主要有三个策略，第一种是预防HPV感染的预防性疫苗，主要通过 产生中和抗体以抵抗病毒进入宿主上皮基底角化细胞内，目前最有希望的是包含有L1或 L1/L2病毒壳蛋白的病毒样颗粒(VLPs)疫苗，这类疫苗主要用于年轻女性感染HPV之前， 对已感染HPV或已有宫颈癌前病变或宫颈癌的女性无效。第二种是治疗性疫苗，主要通过 刺激细胞介导的免疫反应以去除隐藏和表达病毒蛋白的细胞，这种疫苗应该能够阻止已经 感染了病毒的角化细胞的增殖和促进已生长肿瘤的消退。因此，这类疫苗主要用于已经感 染了HPV或已经罹患宫颈癌前病变或宫颈的患者。由于HPV的早期基因E6和E7是维持其 恶性表型所必需，从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的所有阶段均有表达，能 诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL，因而，迄今仍是研制HPV 治疗性疫苗所共同选择的靶抗原。第三策略是兼具预防和治疗作用的联合疫苗，这种疫苗 的靶抗原既包含有L1或L1/L2病毒壳蛋白又包含HPV的早期基因E6和E7。因此，这种疫 苗既能产生强的中和抗体，又能诱发特异性CTL反应，以产生预防和治疗的效果，防止病 毒的感染和扩散，清除手术或治疗后残余的肿瘤细胞。
采用HPV58型衣壳蛋白L1或L1/L2为靶抗原研制的病毒样颗粒(VLPs)疫苗的报道 有：①田厚文等于2002年构建的表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组 痘苗病毒疫苗株；②李文生等于2007年预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗； ③Zhang T等于2010年构建的HPV16/18/58三价VLPS疫苗。然而，此类疫苗存在如下问 题：由于L1、L2衣壳蛋白在宫颈癌及癌前病变组织中不表达，故上述疫苗只能用于预防 HPV58型感染，但对已发生感染或病变的宫颈组织治疗无效。
采用HPV58早期蛋白E1或E2为靶抗原研制的疫苗的报道有：张晓丽等于2009年构 建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2，但仅进行了体液免疫检测证明有抗E2特异性抗体 产生，而没有进行细胞免疫相关实验的检测。此类疫苗存在如下问题：E1和E2蛋白虽然 涉及病毒游离基因的复制和病毒早期基因的转录，可能是感染早期好的靶抗原，但由于E1 和E2蛋白的表达水平非常低以至难以被免疫系统所识别，而让病毒逃逸。而且，这两个 基因通常在肿瘤生长的早期即病毒基因整合入宿主染色体时被敲出，因此，并不是理想的 靶抗原。
采用HPV58早期蛋白E6或E7为靶抗原(目前HPV治疗型疫苗研制过程中最常用的两 个靶抗原)研制的疫苗的报道有：(1)单独使用E6或E7基因作为靶抗原，罗利群等于2003 年制备了含HPV58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果， 发现经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低，免疫小鼠后能抑制E7阳性肿瘤细胞 在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期，说明该疫苗有一定的抗肿瘤效果。然而，此类疫 苗存在如下问题：由于仅利用了HPV58E7基因作为抗原而忽略了另一个重要基因E6的抗 原性，并且没有协同相关的佐剂来打破免疫耐受，因此该疫苗的作用尚待提高。(2)未见 使用E6和E7融合基因作为靶抗原。
暂无采用HPV58L1和L2联合E6和E7为靶抗原研制的嵌合疫苗的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全性高、免疫作用强、抗肿瘤理想的HPV58型 治疗性复合基因疫苗及其构建方法，用于治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：HPV58型治疗性复合基因疫苗，该疫 苗以HPV58型E6/E7融合基因为靶抗原，以GM/B7作为抗原佐剂；HPV58型E6/E7融合基 因去除了HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸 和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸。
靶抗原由HPV58型E6/E7融合基因片段插入pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质 粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段从pCI载体上切下来 而得。
该疫苗采用的载体为pVAX1-IRES-GM/B7，它对靶抗原sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI和 GM/B7可共表达。
该疫苗是PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称PVAX1-HPV58mE6E7FcGB)。
HPV58型治疗性复合基因疫苗的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
<1>制备靶抗原：先去除HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成 HPV58mE6E7融合基因，其中，将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第 24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸；然后，把HPV58mE6E7融合基因片段插入pCI-Fc-GPI 载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将复合基因片段 sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI从pCI载体上切下来；
<2>选择载体：选用GM-CSF和B7.1双亚基共表达的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7；
<3>制备疫苗：将步骤<1>的复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI插入步骤<2>的疫 苗载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游，即得HPV58型治疗性复合基因疫苗 PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7。
本发明将HPV58型E6和E7制成融合基因HPV58mE6E7，并通过6个定点突变消除了其 转化活性而保留其抗原性，避免了潜在的致癌风险，最大程度地确保了以其作为靶抗原的 HPV58型治疗性复合基因疫苗(PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7)的安全性。 该疫苗用于治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变。由于采用了安全性更高的载体， 并引入抗原佐剂GM/B7帮助打破免疫耐受发挥协同作用从而改善了疫苗的抗肿瘤功能。此 外，该疫苗包含人Igκ链前导信号肽(sig)可有效促进基因的真核表达，而人IgG Fc段则 增强了融合基因的抗原性且利于鉴定，引入GPI锚定蛋白达到增强免疫识别的作用，可在 激发细胞免疫反应上占优。研究表明，本发明的治疗性复合基因疫苗安全性有效性较佳， 可作为HPV58型阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗。
附图说明
图1是PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒双酶切鉴定图，图中M：DNA marker(DL5000)，1： PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒，2：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒经NheI和PmeI双酶切鉴定 结果，3：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB质粒经NheI和PvuI双酶切鉴定结果。
图2是瞬时转染PVAX1-HPV58mE6E7FcGB的293T细胞免疫荧光检测图，图中A：FITC (物镜40×)，B：PE(物镜40×)，C：FITC+PE(物镜40×)。
图3是瞬时转染PVAX1-HPV58mE6E7FcGB的293T细胞流式细胞术检测图，图中A： PVAX1对照组(FITC+PE，红色荧光+绿色荧光)，B：PVAX1-HPV58mE6E7FcGB实验组(FITC+PE， 红色荧光+绿色荧光)，R1：总细胞数，R2：显色绿色荧光(FITC)细胞占总细胞数的比例， R3：显示红色荧光(PE)细胞占总细胞数的比例，R4：显示双色(红、绿)荧光细胞占总 细胞数的比例。
图4是融合蛋白突变前后氨基酸位点比较图，图中：序列1是突变前序列HPV58E6E7， 序列2是突变后序列HPV58mE6E7。
图5是PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗的构建流程图。
图6是预防模型免疫示意图。
图7是治疗模型免疫示意图。
图8是CTL加样示意图。
具体实施方式
HPV58型疫苗的安全性及有效性研究
一、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗构建(如图5)
免疫治疗的两大关键是合适的抗原及高效的载体。在抗原选择方面，由于HPV的早期 基因E6和E7是维持其恶性表型所必需，从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的 所有阶段均有表达，能诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL，因 而，迄今仍是研制HPV治疗性疫苗所共同选择的靶抗原。发明人在设计抗原时，首先去除 HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成HPV58E6E7融合基因。由于HPV E6 和E7为癌蛋白，病毒DNA有可能整合入宿主细胞基因组，诱发细胞的恶性转化，具有潜 在的致癌风险，出于对DNA疫苗安全性的考虑，在利用E6和E7基因作为靶抗原之前，必 须消除E6、E7基因的转化活性所导致的潜在致癌风险，以保证疫苗的安全性。对E6、E7 基因的转化活性位点进行点突变是目前消除其转化活性的常用方法。据文献报道，E6第 50位上的Leu(亮氨酸)在所有致癌HPV中高度保守，提示其可能在E6蛋白的转化功能中 起重要作用；第63和106位上的Cys(半胱氨酸)则位于E6蛋白一对锌指结构的两侧，对 其与抑癌基因P53的结合和降解有重要作用；E7除第24位上的Cys和26位上的Glu(谷 氨酰胺)位于E7蛋白一对锌指结构的两侧外，还有第92位的Cys位于一个单独的锌指结 构上，这些锌指结构都可与抑癌基因PRb基因使其降解失活。由于既往文献报道都是突变 E6或E7基因中的1-2个点，因此，综合文献报道，本研究首创对HPV58E6E7基因融合基 因进行6个定点突变以彻底消除其转化活性而保留其抗原性，最大程度确保疫苗的安全性。 即将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸，都 突变成Gly(甘氨酸)，构建了HPV58mE6E7(突变后)融合基因(编码的融合蛋白突变前后 氨基酸位点比较见图4)。通过对突变前HPV58E6E7(序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列，1-447 位为E6基因，448-741位为E7基因)和突变后HPV58mE6E7(序列表SEQ.ID.No.2的碱基 序列，点突变处148-150位tta->ggt、187-189位tgt->ggt、316-318位tgt->ggt、 517-519位tgc->ggc、523-525位gag->ggg、721-723位tgc->ggc)融合基因转化活 性实验的对比分析，证实了点突变后的HPV58mE6E7融合基因已消除了转化活性，可作为 HPV58型新型治疗性疫苗研制的靶抗原。
随后，发明人将已证实消除转化活性的HPV58mE6E7融合基因片段插入pCI-Fc-GPI载 体中，构建了过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI 片段从pCI载体上切下来，形成一段包含人Igκ链前导信号肽(sig)、HPV58mE6E7融合基 因、人IgG-Fc段和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽的复合基因片段—— sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。发明人前导肽的设计选用Invitrogen公司的pSecTag2哺乳动 物表达载体公布的信号肽序列，它是Igκ链V-J2-C区域的分泌信号序列，并在起始密码 子ATG前加入了Kozak序列，对基因在真核细胞内获得有效表达起到了促进的作用。之后 发明人将HPV58mE6E7抗原与人IgG Fc段进行融合表达。人IgG Fc段能与免疫效应细胞 表面的Fcγ受体结合，起到了免疫黏附素的作用。由于DC和NK细胞表面带有Fcγ受体， IgG Fc段与DC和NK细胞结合后，就能加强免疫应答的抗原呈递功能，发挥其调节免疫效 应、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及激活吞噬细胞的作用等，并可延长重组蛋白的 半衰期，增强了HPV58mE6E7的抗原性。同时带有Fc段的嵌合蛋白，还可以将Fc段作为 检测标签，对HPV58mE6E7-Fc融合蛋白的鉴定带来了很大的方便，特别是在没有HPV58mE6E7 蛋白的商品化抗体的情况下优势更为明显。GPI锚定蛋白是一类通过其羧基末端的糖基化 磷脂酰肌(glycosylphosphatidylinositol，GPI)结构锚定于真核细胞膜表面的蛋白。它 的基本化学结构主要由胆胺甘露糖、葡萄糖胺和肌醇连接而成。肌醇最终通过磷酸基团与 细胞膜中的磷脂结构相连，胆胺则与蛋白质的羧基端相连形成GPI锚定蛋白。它们与传统 的跨膜型表面蛋白不同，没有跨膜区和胞内部分，不跨越细胞膜脂质双层，只通过其羧基 末端的GPI结构锚定于细胞膜上。GPI锚定蛋白合成是在粗面内质网内进行的：在内质网 的胞浆面，完整的GPI分子转入内质网腔内后与新生蛋白连接形成GPI锚定蛋白。蛋白通 过GPI结构锚定于细胞膜表面而不跨越其磷脂膜双层结构。当它与细胞共同孵育时，可自 动整合至细胞膜表面，并可保持其生物学活性。本研究利用GPI的目的，就是要将表达的 HPV58mE6E7-Fc融合蛋白抗原锚定在细胞膜上，从而达到增强免疫识别的作用。而且目前 的研究认为，以膜形式表达的抗原要比分泌形式表达的抗原，在激发细胞免疫反应的能力 上有更大优势。
此外，疫苗构建面临的另一个重要问题就是载体。目前常用的负载靶抗原的载体主要 为病毒载体和非病毒载体。在构建HPV疫苗常用的病毒载体中，痘苗病毒和腺病毒载体是 常用的两种。二者虽然具有抗原性稳定，免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫等 优点，但这二者都存在安全性的隐忧。并且存在痘苗病毒在种痘后局部反应较大，重复免 疫后容易产生针对痘苗病毒而不是靶抗原的免疫反应，在人接种后有百万分之一发生全身 性发痘和种痘后脑炎等并发症倾向；腺病毒存在编码蛋白作为异种抗原易被机体清除，在 全身用药时可能产生致命的过敏反应等缺点。因此，这些载体都存在一定局限性。非病毒 载体中的PVAX1是Invitrogen公司出品的一种在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的一种 真核表达载体，它是由美国食品和药品管理委员会(FDA)推荐的唯一可以应用于人体实 验的载体质粒，具有自身体积小、表达容量大的优点。因此，发明人利用本室前期改造的 抗原与细胞因子GM-CSF/共刺激分子B7-1(GM/B7)双亚基可共表达的新型疫苗载体 PVAX1-IRES-GM/B7，将复合抗原片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI插入载体PVAX1-IRES-GM/B7 的IRES上游，成功构建新型复合基因疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简 称PVAX1-HPV58mE6E7Fc-GM/B7)并成功实现其真核表达。恶性肿瘤在体内能长期存在的一 个重要原因就是免疫耐受。引入GM-CSF不仅可以刺激巨噬细胞生成，还可促进单核巨噬 细胞MHC II类分子、粘附分子及其刺激分子的表达，具有激活树突细胞等专职抗原递呈 细胞作用；B7-1也可增强抗原提呈效应，有效活化T淋巴细胞成为细胞毒性T细胞(CTL)， 是目前最常用的共刺激分子。因此，GM/B7联合应用作为抗原佐剂可以在一定程度上打破 免疫耐受，提高肿瘤细胞的免疫原性和对肿瘤相关抗原的免疫力，并且激活特异性和非特 异性免疫细胞，活化局部的免疫微环境，直接杀伤肿瘤。通过IRES上游的复合抗原与下 游的分子佐剂的共表达，使二者能够协同作用，在一定程度上免疫耐受、发挥比较理想的 抗肿瘤作用，成为治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变的新型DNA疫苗。
二、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗的鉴定
①酶切鉴定
PVAX1-HPV58mE6E7FcGM/B7疫苗质粒经分别经NheI/PmeI和NheI/PvuI双酶切(如图 1)鉴定证实，目的片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI已连入真核表达载体PVAX1-IRES-GM/B7 中，疫苗质粒PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7构建成功，简称为 PVAX1-HPV58mE6E7FcGB。
②瞬时转染细胞的免疫荧光检测
在发明人构建的重组质粒中，HPV58mE6E7基因的羧基端融合了人IgG Fc段基因，可 作为检测融合蛋白表达的标签。用FITC标记的山羊抗人IgG抗体与转染48h后的细胞进 行孵育，用以检测IRES上游的插入片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI在293T细胞中的表达情 况。IRES下游的GM和B7.1融合蛋白经PE标记的兔抗人B7.1抗体染色可检测其表达情况。 经荧光显微镜观测发现，PVAX1-HPV58mE6E7FcGB组细胞有荧光显示，主要分布于细胞膜上 (图2)，且PVAX1-HPV58mE6E7FcGB组上下游分别有绿、红荧光显示，而未转染重组质粒的 293T细胞为阴性，证明插入片段HPV58mE6E7-Fc-GPI及GM/B7能够有效表达。
③瞬时转染细胞的流式细胞仪分析
瞬时转染48h后的293T细胞用FITC标记的山羊抗人IgG抗体孵育IRES上游的人IgG Fc段基因，IRES下游的GM和B7.1融合蛋白经PF标记的兔抗人B7.1抗体染色后，经流 式细胞仪检测结果如图3所示，约有14％的细胞表达(包括单独表达和共表达)IRES上游 的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI融合基因，约有17％的细胞表达(包括单独表达和共表达)IRES 下游的GM/B7融合基因。
三、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗的具体构建工艺(如图5)
1.重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的构建及鉴定
1.1重组质粒pGEM-T easy/HPV58mE6E7和真核表达载体pCI-Fc-GPI双酶切及纯化
1.1.1酶切
将重组质粒pGEM-T easy/HPV58mE6E7和载体pCI-Fc-GPI分别用XhoI和EcoRI双酶 切，酶切体系如下：
酶切条件：37℃水浴4h。
1.1.2酶切产物的纯化回收
酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，按照北京三博远志生物基因技术有限责任公司 “胶回收试剂盒”说明书进行纯化回收。
1.2HPV58mE6E7和pCI-Fc-GPI的连接、转化及阳性克隆的鉴定
酶切、纯化后的HPV58mE6E7片段与载体pCI-Fc-GPI 16℃连接过夜，转化大肠杆菌 E.coli DH5α。经氨苄青霉素筛选后，菌落PCR挑选阳性克隆；再经NheI和NotI双酶切 鉴定，鉴定正确的菌株送北京英骏生物技术有限公司进行测序。
1.2.1HPV58mE6E7片段与pCI-Fc-GPI载体连接
连接体系如下：
连接条件：16℃，过夜。
1.2.2连接产物的转化、挑选阳性克隆
1.2.3重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI酶切鉴定
酶切体系：
酶切条件：37℃水浴4h。
2.疫苗PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称PVAX1-HPV58mE6E7FcGB)的构建 及鉴定
2.1重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI的酶切、粘端补平及回收
2.1.1 NotI单酶切
鉴定正确的阳性重组质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI先经NotI单酶切并纯化，酶 切体系如下：
酶切条件：37℃水浴4h。
2.1.2补平
经过Not I单酶切并纯化回收后的片段用Klenow酶补平单酶切后产生的粘性末端， 补平体系如下：
补平条件：25℃水浴30min。
2.1.3Nhe I单酶切
补平纯化后的产物再用Nhe I进行单酶切，酶切体系如下：
酶切条件：37℃水浴4h。
2.1.4酶切补平后的片段回收
随后切胶回收含有sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI(简称HPV58mE6E7-Fc-GPI)的目的片段 (5’-端为Nhe I酶切后产生的粘性末端，3’-端为Klenow补平后产生的平端)。
2.2载体PVAX1-IRES-GM/B7的酶切、粘端补平及回收
2.2.1 Cla I单酶切
先经Cla I单酶切并纯化，酶切体系如下：
酶切条件：37℃水浴4h。
2.2.2补平
经过Cla I单酶切并纯化回收后的片段用Klenow酶补平单酶切后产生的粘性末端， 补平体系如下：
补平条件：25℃水浴30min。
2.2.3Nhe I单酶切
补平纯化后的产物再用Nhe I进行单酶切，酶切体系如下：
酶切条件：37℃水浴4h。
2.2.4酶切补平后的片段回收
随后切胶回收含有PVAX1-IRES-GM/B7的载体(5’-端为Nhe I酶切后产生的粘性末 端，3’-端为Klenow补平后产生的平端)。
3.sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI和PVAX1-IRES-GM/B7连接、转化及阳性克隆的鉴定
酶切纯化的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI与载体PVAX1-IRES-GM/B7 4℃连接过夜，转化大 肠杆菌E.coli DH5α。经卡那霉素(100μg/mL)筛选后，菌落PCR挑选阳性克隆；再经NheI 和PmeI、NheI和PvuI双酶切鉴定，酶切鉴定正确的阳性重组质粒即为基因疫苗 PVAX1-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRESGM/B7，简称PVAX1-HPV58mE6E7GB。
连接体系如下：
酶切鉴定体系如下：
四、动物实验
1.1动物分组
6-8周龄C57雌性小鼠随机分为5组，每组15只，5只进行形态学检测、5只进行生 存率检测、5只进行免疫学检测。A空白组：PBS；B空载体组：PVAX1；C单纯抗原组： PVAX1-HPV58mE6E7；D组：PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12疫苗1组；E： PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗2组。
1.2皮下移植瘤攻击
①预防模型：
分别收取对数生长期的单克隆B16-HPV58E6E7细胞，制备单细胞悬液，PBS洗两次， 调整细胞浓度至2×106个/mL，于末次免疫后1天在小鼠背部右侧皮下接种100μl细胞悬液 即2×105个/只。
②治疗模型：
分别收取对数生长期的单克隆B16-HPV58E6E7细胞，制备单细胞悬液，PBS洗两次， 调整细胞浓度至1×106个/mL，于初次免疫前1天在小鼠背部右侧皮下接种100μl细胞悬液 即1×105个/只。
1.3免疫C57BL/6小鼠
①预防模型
C57小鼠在进行移植瘤攻击前30天，连续进行3次疫苗接种，每间隔10天免疫1次。 免疫采用股四头肌肌肉注射同时局部电脉冲刺激，空白组注射100μl PBS/只，其余各组分 别注射相应的DNA质粒50μg/100μl/只，分别于d1、d11和d22共免疫三次。在末次免疫 后1天进行移植瘤攻击。攻击后每隔2天观察一次移植瘤生长，记录瘤体积，绘制肿瘤生 长曲线；末次免疫后第7和14天分别取各组免疫小鼠血清进行Elisa实验，检测体液免 疫情况；免疫后第14天收集小鼠的脾细胞，进行Elispot和CTL杀伤实验，检测细胞免 疫情况；在移植瘤攻击后2周断颈处死每组5只小鼠，手术剥取肿瘤组织并记录各种数据。 具体免疫程序见图6和表1。
②治疗模型
C57小鼠在皮下移植瘤攻击1天后开始免疫，每间隔7天免疫1次。免疫采用股四头 肌肌肉注射并同时进行电脉冲刺激，空白组注射100μl PBS/只，其余各组分别注射相应的 DNA质粒50μg/100μl/只，分别于d1、d9和d17共免疫三次。在初次免疫前1天进行移植 瘤攻击。攻击后每隔2天观察一次移植瘤生长，记录瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；于末次 免疫后第7和14天分别取各组免疫小鼠血清进行Elisa实验，检测体液免疫情况；免疫 后第14天收集小鼠的脾细胞，进行Elispot和CTL杀伤实验，检测细胞免疫情况；在进 行移植瘤攻击后第25天断颈处死每组5只小鼠，手术剥取肿瘤组织并记录各种数据。具 体免疫程序见图7和表2。
1.4疫苗免疫保护效果观察和检测
皮下移植瘤攻击后，观察小鼠体内肿瘤的生长情况。待肿瘤结节形成后(可扪及)，记 录每组小鼠的成瘤时间；以后每间隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤的垂直长径和垂直短 径，依照公式计算移植瘤体积，绘制小鼠体内肿瘤的生长曲线；待肿瘤生长至一定天数时， 断颈处死每组各5只小鼠并拍照，手术剥取肿瘤组织并称取瘤重，依照公式计算肿瘤的抑 制率。公式如下：
1.5免疫学检测
①血清抗体的ELISA检测
末次免疫后第7和14天，取各组免疫小鼠静脉血，室温放置3h后3000rpm离心10min， 取上层血清，-20℃保存备用。用发明人纯化的HPV58E6E7-GST融合蛋白分别包板，ELISA 法检测免疫小鼠血清中特异的抗体滴度。
a.包被：将纯化后的HPV58E6E7-GST融合蛋白用包被液稀释至终浓度为2.5μg/mL， 100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜；
b.洗涤：甩弃ELISA板孔中的包被液，PBST洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；
c.封闭：100μL/孔加入5％小牛血清，37℃封闭2h，弃去封闭液，PBST洗板5次，最后 一次在吸水纸上拍干；
d.检测：将各组免疫鼠血清(一抗)用PBS倍比稀释后加入各孔，100μL/孔，37℃湿盒反 应2h，弃去鼠血清，PBST洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；
e.6标记：100μL/孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)，37℃湿盒反应1h，弃去二抗， PBST洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；
f.显色：每孔加入TMB显色液100μL，室温显色30min，2M硫酸终止反应。
SPECTRAⅢ酶联仪检测450nm的OD值。结果判定：待测样品的OD值≥0.1为阳性，显 示阳性结果的最大抗体稀释度为免疫小鼠血清的抗体效价。
②免疫小鼠脾脏单个核细胞悬液的制备及Elispot检测
末次免疫后第10-15天，先后断颈处死每组5只小鼠，在无菌条件下取小鼠的脾脏制 备脾细胞悬液，具体操作如下：
(1)小鼠脾脏单个核细胞悬液的制备：
a.打开超净工作台的紫外灯照射30min，断颈处死小鼠，浸泡于75％乙醇中5min后随即 放入超净台内小鼠解剖板上左侧卧位；
b.用75％乙醇消毒小鼠腹部，无菌手术开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织，剪碎(5-7 段)后放于200目不锈钢网筛，将网筛置于预先放入2mL含5％血清PBS的平皿中，用研 磨棒挤压出脾细胞，尽量挤压干净；
c.用含5％血清PBS冲洗不锈钢网筛，轻柔吹打、充分混匀上一步研磨出来的脾细胞；
d.在透明刻度离心管中分别加入5mL淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液(约5mL)缓慢加在分 离液上方，离心，2000rpm/min，30min；
e.离心后取白膜，加入10mL含5％血清PBS洗2次(1500rpm/min，10min)；重悬于10mL 含5％血清RPMI1640培养液中，计数；
(2)Mouse IFN-γprecoated ELISPOT kit检测小鼠脾细胞
第一天：接种细胞，加入刺激物，培养(严格注意无菌操作)
a.整个实验每一个细胞样品(同一实验动物)设置1组正对照(PMA刺激)、设1组负对照(不 加刺激物)，同时整块板还要加1组背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有检测试 剂)；
b.取出预包被好的板，每孔先加入200μL的Lympho-SpotTM无血清培养基室温避光静置 10min活化，然后倾倒；
c.细胞上板：按照既定安排，接种不同组免疫小鼠的脾细胞，100μL/well，细胞在孔中 的分布要尽量均匀；
d.(1)正对照：细胞浓度为1×105cells/well；
(2)细胞样品：样品细胞浓度为4×105cells/well；
(3)背景负对照：加入100μL的Lympho-SpotTM无血清培养基，该孔即为背景负对照孔；
e.正对照孔每孔加入10μL PMA，终浓度1-4μg/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌；
f.实验孔加入刺激物：即重组抗原：纯化后的HPV58E6E7-GST融合蛋白，8μg/孔；
g.加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37℃培养24-36h；
第二天：培养后操作(不再需要无菌操作)
h.裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，加入200μL/孔冰冷的去离子水，4℃冰浴10min(低 渗法裂解细胞)；
i.洗涤：每孔加入200μL洗涤液，浸泡3-5mins后扣出，重复5次，最后一次，在吸水纸上 扣干；
j.加入检测抗体：每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体，37℃孵育1h；
k.洗涤：每孔加入200μL洗涤液，浸泡3-5mins后扣出，重复5次，最后一次，在吸水纸上 扣干；
l.加入酶标亲和素：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1h；
m.洗涤：每孔加入200μL洗涤液，浸泡3-5mins后扣出，重复5次，最后一次，在吸水纸上 扣干；
n.显色：根据说明书配好AEC显色液，每孔加入100μL的，室温避光静置45-60min；
o.待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程，将板倒扣在吸水 纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜 自然晾干；
p.将ELISPOT板置于Biosys Bioreader自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记 录斑点的各种参数，做统计分析。
③细胞免疫的检测-特异性CTL的测定
(1)效应细胞的制备
经过3次免疫后的C57BL/6小鼠断颈处死，整体置于75％乙醇中消毒处理5min，无 菌条件下在超净台中取出脾脏，培养皿中加入5mL含5％血清PBS，并将200目不锈钢网 筛置于其中，用研磨棒挤压出脾细胞，尽量挤压干净，直至留下白色结缔组织。移去网筛 及白色结缔组织，用移液管吹打开脾细胞，用含5％血清PBS冲洗不锈钢网筛，轻柔吹打、 充分混匀上一步研磨出来的脾细胞。在透明刻度离心管中加入5mL小鼠淋巴细胞分离液， 将脾细胞悬液(约5mL)缓慢加在分离液上方，离心，2000rpm/min，30min。离心后取白膜， 加入10mL含5％血清PBS洗2次(1500rpm/min，10min)，最后将脾细胞重悬于10mL含5％ 血清RPMI1640培养液中，计数。计数后的脾细胞置于6孔板中，用含IL-2、阳性刺激物 (PMA)、重组抗原(纯化后的HPV58E6E7-GST融合蛋白)及10％血清的RPMI1640培养基在 5％二氧化碳培养箱、37℃培养5-7天，作为效应细胞。
(2)靶细胞的制备
本实验中将表达HPV58E6E7融合基因的B16-HPV58E6E7单克隆细胞作为靶细胞。参 考试剂盒中的操作步骤，先进行最适靶细胞数的确定。具体步骤为：离心收集细胞，计数 细胞数，调整细胞浓度为2×105cell/mL。96孔细胞培养板中，每孔加不同数量的靶细胞0， 5000，10000，20000，40000。补加培养液至总体积为200μL，设置3个复孔。每孔再加入 10μL 10×裂解液，37℃孵育45min，1000rpm离心4min，每孔吸出50μL上清至96孔酶标 板中，再加入50μL预先配好的底物混合液，室温避光孵育30min，最后加入50μL终止液。 酶标仪上测定OD490。最适靶细胞数的反应孔的OD490值至少为对照孔OD490值平均值的2 倍以上。
(3)特异性CTL活性的测定
参照CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒说明书。
取一96孔U形底细胞培养板。实验孔中每孔加入1×104个/50μl(最适靶细胞数，即 2×105个/mL)的靶细胞，再加入不同数量和体积的效应细胞(将每只小鼠的效应细胞调整至 相同浓度，比较方便后续实验)，使之形成不同的效靶比(分别为10∶1、20∶1、40∶1)，并 补含5％血清的RPMI1640培养基至总体积200μl，每组设3个复孔。同时设立以下对照： 效应细胞自发释放(与对应的实验孔相比，不加靶细胞)、靶细胞自发释放、靶细胞最大释 放、培养基空白对照和总体积校正对照，各对照也设3个复孔，每孔总体积200μl。
培养板置于37℃、5％CO2培养箱中孵育4hr，培养结束前45min，于靶细胞最大释放孔 及体积校正孔中加入10×裂解液20μl。培养结束后，将培养板350g/min离心4min，小心 吸取每孔上清50μl重新置于另一96孔平底酶标板上对应的孔中(见图8)，加入50μl乳酸 脱氢酶底物液，室温下避光反应30min，最后加入50μl终止液。酶标仪上以490nm或492nm 测量OD值。计算公式如下：
1.6 PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫效果
由于E6和E7基因的分子量较小，表达的蛋白半衰期短，仅有3～4h，因而抗原性弱。 我们将HPV58型E6基因与E7基因融合形成E6E7融合基因，并在其前方加上信号肽，后 方融合人IgG Fc段及锚定蛋白GPI，共同构成sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI融合抗原片段，使 整个抗原分子量变大从而使所得蛋白的结构稳定，并利用人IgG Fc段加强免疫应答的抗 原呈递功能，以及GPI将融合蛋白抗原锚定在细胞膜上，有利于免疫识别。动物实验中发 现，通过融合抗原的方法增大蛋白分子量后，在一定程度上增强了体液免疫，提高了抗体 滴度，使PVAX1-HPV58mE6E7Fc-h IL12(疫苗1)组与PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)组的 最高抗体滴度可达到1∶25600，与PBS和PVAX1空载体对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。 在动物实验中我们还看到，注射PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗免疫的小鼠，对HPV58E6E7 阳性肿瘤的攻击具有免疫保护作用。在抗肿瘤移植保护实验中，虽然接种了2×105/只 B16-HPV58E6E7细胞的各组(PBS、PVAX1空载体、、PVAX1-HPV58mE6E7单纯抗原、 PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12(疫苗1)、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2))小鼠成瘤率均为 100％，但疫苗组小鼠皮下肿瘤成瘤时间(15.57±1.53天)晚于PBS(9.00±1.58天)、PVAX1 空载体(9.06±1.52天)(P＜0.05)，与单纯抗原组(11.35±1.66)、PVAX1-HPV58mE6E7 -h IL12(疫苗1)组(13.60±1.48天)无显著差异(P＞0.05)，说明两种疫苗组都有抗肿 瘤移植保护的作用，但PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)效果较优。在肿瘤生长抑制实验 中，疫苗组小鼠肿瘤生长速度较PBS、PVAX1空载体和单纯抗原组明显减慢，最终使小鼠 生存期延长，平均瘤重较低，差异具有统计学意义(P＜0.05)；PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫 苗1)组肿瘤生长速度、小鼠生存期、平均瘤重与PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)组相当 (P＞0.05)。说明疫苗1及疫苗组都有2组都有抑制肿瘤生长的作用。同时，在ELISPOT 实验中，虽然PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫苗1)、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)及 单独抗原组都能检测到分泌IFN-γ的特异性CTL，但从显现的斑点数可以表明，疫苗2组 小鼠被激活的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞数(288.78±18.67个/4×105个脾淋巴细 胞)明显多于疫苗1组(215.24±25.12个/4×105个脾淋巴细胞)单独抗原组(147.50± 25.32个/4×105个脾淋巴细胞)(P＜0.05)，而其他三组(PBS、PVAX1空载体和单纯佐剂组) 检测到的斑点数均在15个左右。通过LDH法，我们还检测到PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12 (疫苗1)、PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)都可以诱导C57BL/6小鼠产生杀伤 B16-HPV58E6E7细胞的CTL，疫苗1和疫苗2的免疫保护率最高分别为60％和68％，而单 独HPV58mE6E7融合基因抗原的免疫保护率最高为为40％，而其他三组(PBS、PVAX1空载 体和单纯佐剂组)没有免疫保护作用。说明没有特异性抗原(HPV58mE6E7)无法有效激活 的特异性、分泌IFN-γ的效应T细胞；PVAX1-HPV58mE6E7FcGB(疫苗2)对小鼠的免疫保 护率68％高于PVAX1-HPV58mE6E7-h IL12(疫苗1)和单独抗原组。
本研究结果表明，PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗可以诱发免疫后小鼠产生特异性抗体和 细胞免疫应答，在一定程度上保护免疫小鼠免受B16-HPV58E6E7细胞(2×105)的攻击，免 疫保护率最高为68％。因此，该疫苗也可作为HPV58阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗 的候选疫苗。