技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及NADH在制备抗血小板聚集的药物中的应用。
背景技术
血小板聚集是血栓形成的主要步骤。正常循环血液中，血小板处于静息状态。当血管壁受损，如动脉硬化斑块破裂暴露血管内皮下基质，血小板就会通过其表面膜糖蛋白(GP)Ib与vorlWillebrand因子(VWF)结合而黏附于内皮下的胶原组织，同时通过其表面的胶原受体GPⅠa-Ⅱa和GPVI直接与胶原结合，从而牢固地黏附于内皮下胶原组织。黏附的血小板或受到血小板激活剂(如胶原、凝血酶等)作用的血小板会发生一系列反应，包括花生四烯酸代谢，产生血栓烷A2(TXA2)和释放出细胞内颗粒内容物二磷酸腺苷(ADP)，最后导致血小板GPⅡb-Ⅲa复合物的构型改变，形成黏附分子受体，并通过与纤维蛋白原的结合而使血小板之间相互黏附、聚集成团，在血管破损处形成早期止血血栓。此外通过血小板的释放产物，可进一步引起血管收缩，刺激白细胞，损伤内皮细胞，促进血液凝固，有利于血栓形成。
抗血小板聚集药物能预防或者逆转血小板聚集，在抗动脉血栓形成、尤其是手术和血管支架植入后、冠脉搭桥、心肌梗死以及心肌缺血中应用最为广泛。根据血小板发生聚集的机制，目前抗血小板聚集药物主要有：(1)抑制血栓烷A2(thromboxane A2，TXA2)诱导的血小板聚集，以阿司匹林(aspirin)为代表；(2)抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)诱导的血小板聚集，以噻氯匹定(tic1opidine)、氯吡格雷(clopidogrel)为代表；(3)血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗药，抑制血小板聚集的最终共同途径，代表药物为阿昔单抗(abciximab)、替罗非班(tirofiban)、依替巴肽(eptifibatide)。此外，血小板激活因子(PAF)受体拮抗剂、凝血酶和凝血因子Xa(FXa)抑制剂，钙离子(Ca2+)通道拮抗剂、5-HT2受体拮抗剂等均有抑制血小板聚集作用。但这些药物长期服用会产生一定的耐药性，且会产生一定的副作用，如阿司匹林会引起一些过敏反应、胃肠道反应、中枢神经系统、以及肝肾损害等。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了NADH在制备抗血小板聚集的药物中的应用，能够有效地降低副作用。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了NADH在制备抗血小板聚集的药物中的应用。
优选的，所述抗血小板聚集的药物包括：抗血小板药、抗凝血药或促进纤维蛋白溶解药。
优选的，所述抗血小板聚集的药物包括NADH和药用辅料。
优选的，所述NADH的有效剂量为1～20mg/kg。
优选的，所述NADH的质量为抗血小板聚集的药物总质量的5～80％。
优选的，所述药用辅料包括：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、矫味剂、防腐剂、溶解剂和基质中的一种或多种。
优选的，所述填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素和蔗糖中的一种或多种。
优选的，所述崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素和交联羧甲基纤维素纳中的一种或多种；
所述润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉和二氧化硅中的一种或多种；
所述助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂和羟丙基甲基纤维素中的一种或多种。
优选的，所述粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素中的一种或多种。
优选的，所述矫味剂包括：甜味剂和/或香精；所述甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素和甘草次酸中的一种或多种。
优选的，所述溶解剂包括生理盐水或蒸馏水；
所述基质包括：PEG6000、PEG4000和虫蜡中的一种或多种。
优选的，所述药物的剂型选自颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、栓剂、丸剂、合剂或糖浆剂。
本发明提供了NADH在制备抗血小板聚集的药物中的应用。NADH通过一致MARK p38的磷酸化，达到抗血小板聚集的功效。本发明中NADH单独作为有效成分即可达到抗血小板聚集的功效。实施例结果表明：体外给予外源性NADH呈剂量依赖性抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集；体外给予外源性NADH呈剂量依赖性抑制Thrombin诱导的大鼠血小板聚集；大鼠体内预防性给予NADH可影响氯化铁诱导的体内血栓的形成。NADH具有抗血小板聚集的作用。
同时，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adeninedinucleotide，NADH)作为还原型辅酶I，是各种生物过程的基本共同介质，这些生物过程包括：能量代谢、线粒体功能、钙稳态、氧化应激、基因表达、免疫功能、衰老和细胞死亡等。是生物体自身普遍存在的物质，对胃肠道无刺激、对PGI2的合成无影响，副作用小，对人体无害。
附图说明
图1为体外给予不同药物后对ADP诱导的大鼠血小板聚集情况的影响；
图2为体外给予不同药物后对Thrombin诱导的大鼠血小板聚集情况的影响；
图3为体内给予不同药物对FeCl3诱导的大鼠体内血栓形成的影响。
具体实施方式
本发明提供了NADH在制备抗血小板聚集的药物中的应用。
本发明中，所述抗血小板聚集的药物优选包括：抗血小板药、抗凝血药或促进纤维蛋白溶解药。本发明中，所述抗血小板聚集的药物优选包括NADH和药用辅料。本发明中，所述NADH的有效剂量为1～20mg/kg，更优选为10mg/kg。本发明中，所述NADH的质量优选占抗血小板聚集的药物总质量的5％～80％，更优选为10％～50％。本发明对所述NADH的来源没有特殊限定，可以通过人工合成、半合成、生物提取获得。本发明实施例中NADH购买自Sigma公司。
本发明研究表明，体外给予外源性NADH呈剂量依赖性抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集；体外给予外源性NADH呈剂量依赖性抑制Thrombin诱导的大鼠血小板聚集；大鼠体内预防性给予NADH可影响氯化铁诱导的体内血栓的形成。
本发明提供的抗血小板聚集的药物优选包括药用辅料。本发明中，所述药用辅料优选包括填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、矫味剂、防腐剂、溶解剂和基质中的一种或多种。
本发明中，所述填充剂优选包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素和蔗糖中的一种或多种。
本发明中，所述崩解剂优选包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素和交联羧甲基纤维素纳中的一种或多种。
本发明中，所述润滑剂优选包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉和二氧化硅中的一种或多种。
本发明中，所述助悬剂优选包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂和羟丙基甲基纤维素中的一种或多种。
本发明中，所述粘合剂优选包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素中的一种或多种。
本发明中，所述防腐剂优选包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸盐、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油和叔丁基-4-羟基苯甲醚中的一种或多种。
本发明中，所述矫味剂优选包括：甜味剂和/或香精；所述甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素和甘草次酸中的一种或多种。
本发明中，所述溶解剂优选包括生理盐水或蒸馏水。
本发明中，所述基质优选包括：PEG6000、PEG4000和虫蜡中的一种或多种。
本发明中，所述药物的剂型优选包括颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、注射剂、气雾剂、贴膏剂、软膏剂、栓剂、丸剂、合剂或糖浆剂。
本发明根据药物的剂型不同具体确定选用的药用辅料及其用量、制备方法，对此无特殊限定。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
称量NADH 20g，助悬剂微晶纤维素60g，防腐剂叔丁基-4-羟基苯甲醚0.04g，润滑剂硬脂酸镁2g，填充剂乳糖加至200g，将上述处方量的原料混合均匀，过3次60目筛，装入胶囊壳，即得胶囊剂。
实施例2
体外给予外源性NADH对腺苷二磷酸(ADP)诱导的大鼠血小板聚集的影响
(1)实验材料
腺苷二磷酸(ADP)试剂和NADH试剂购自Sigma公司，成年雄性SD大鼠，体重300～350g，清洁级，购自上海史莱克公司，许可证号码：SCXK(沪)2012-0002。实验前，将大鼠在室温22℃，湿度50-60％，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄食摄水的条件下饲养2d。
(2)实验方案
以4％水合氯醛溶液将大鼠麻醉，分离出腹主动脉，采血，柠檬酸钠1:9抗凝。500r/min离心5min，吸取上层富含血小板血浆(PRP)，余下的血液2500r/min离心10min，吸取上层贫血小板血浆(PPP)，调节血小板数至2×108个/mL，采用泰利康信4通道半自动血小板聚集仪检测血小板聚集情况。
(3)实验方法
1)血小板聚集的检测
打开血小板聚集仪并预热30min，以PPP作空白对照调节透光率到100％。PRP内加入5μL不同浓度(15μM、30μM、60μM、120μM)NADH溶液于37℃预热5min，放入测试孔道后加入5μL ADP(10μM)溶液诱导血小板聚集，记录5min内图形变化，观察NADH对ADP诱导的血小板聚集的影响情况。
2)数据统计与分析
数据均以均数±标准误(Mean±SEM)表示，统计分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05为统计学差异有显著性。
(4)实验结果
由图1可知，与Control组相比，体外给予外源性NADH以剂量依赖的方式抑制ADP诱导的大鼠血小板聚集。
实施例3
体外给予外源性NADPH对凝血酶(Thrombin)诱导的大鼠血小板聚集的影响
(1)实验材料
凝血酶(Thrombin)试剂购自Solarbio公司，NADH试剂购自Sigma公司，成年雄性SD大鼠，体重300～350g，清洁级，购自上海史莱克公司，许可证号码：SCXK(沪)2012-0002。
实验前，将大鼠在室温22℃，湿度50-60％，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄食摄水的饲养环境中适应2d。
(2)实验方案
以4％水合氯醛溶液将大鼠麻醉，分离出腹主动脉，采血，柠檬酸钠1：9抗凝。500r/min离心5min，吸取上层富含血小板血浆(PRP)，余下的血液2500r/min离心10min，吸取上层贫血小板血浆(PPP)。将PRP以血小板洗涤液洗涤两次，再加入血小板缓冲液重悬，调节血小板数至2×108个/mL，采用泰利康信4通道半自动血小板聚集仪检测血小板聚集情况。
(3)实验方法
1)血小板聚集的检测
打开血小板聚集仪并预热30min，以血小板缓冲液作空白对照调节透光率到100％。血小板悬液内加入5μL不同浓度(15μM、30μM、60μM、120μM)NADH溶液于37℃预热5min，放入测试孔道后加入5μL Thrombin(0.05U/mL)诱导血小板聚集，记录5min内图形变化，观察NADH对Thrombin诱导的血小板聚集的影响情况。
2)数据统计与分析
数据均以均数±标准误(Mean±SEM)表示，统计分析采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05为统计学差异有显著性。
(4)实验结果
由图2可知，与Control组相比，体外给予外源性NADH以剂量依赖的方式抑制Thrombin诱导的大鼠血小板聚集。
实验例4
体内预防性给予NADH对FeCl3诱导的大鼠体内血栓形成的影响
(1)实验材料
氯化铁(FeCl3)购自国药集团化学试剂有限公司，NADH试剂和Aspirin试剂购自Sigma公司，外源性NADH药物的来源可以通过人工合成、半合成、生物提取获得；成年雄性SD大鼠，体重300～350g，清洁级，购自上海史莱克公司，许可证号码：SCXK(沪)2012-0002。
(2)实验方案
实验前，将大鼠在室温22℃，湿度50-60％，通风良好，人工昼夜(12h/12h)，自由摄食摄水的饲养环境中适应2d，将大鼠随机分为三组：生理盐水组(空白对照组)、NADH组(实验组)和Aspirin组(阳性对照组)。给药后于不同时间点以4％水合氯醛溶液麻醉。然后用10％FeC13溶液诱导血栓形成，用多普勒血流仪实时监测血流情况。受损血管进行石蜡切片，用苏木精-伊红(HE)对切片进行染色后观察。
(3)实验方法
1)体内血栓形成
9只雄性SD大鼠(300-350g)，分为三组：生理盐水组(空白对照组)、NADH组(实验组)和Aspirin组(阳性对照组)。生理盐水组的大鼠，尾静脉注射生理盐水；NADH组的大鼠，尾静脉注射5mg/kg NADH溶液，给药30min后以4％水合氯醛溶液麻醉。Aspirin组的大鼠，灌胃给予10mg/kgAspirin，给药1h后以4％水合氯醛溶液麻醉。麻醉后，使其仰卧，并将其固定于大鼠解剖台上，分离出腹主动脉。在腹主动脉下垫一条1.5cm×2.0cm的塑料薄膜，然后用浸渍10％FeC13溶液的滤纸条(0.5cm×1.0cm)包裹腹主动脉15min(开始计时)，用多普勒血流仪实时监测血流情况。取下滤纸条，待血流量降至极低且保持稳定后，记录下间隔时间，即为血栓形成时间。
2)受损血管内血栓形成情况观察
剪下受损段血管，以4％多聚甲醛溶液固定后进行石蜡切片，再用苏木精-伊红(HE)对切片进行染色，用显微镜观察血管内血栓的形成情况并拍照记录。
(4)实验结果
由图3可知，与Model组相比，NADH可对FeCl3诱导的大鼠体内血栓形成造成影响，减小血栓面积，结果表明NADH具有抗血小板聚集的作用，有减少血栓形成的作用，可以作为潜在的抗血小板聚集的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。