一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811279053.6 (22)申请日 2018.10.30 (71)申请人 贵阳中医学院第一附属医院 地址 550001 贵州省贵阳市云岩区宝山北 路71号 申请人 贵州省中国科学院天然产物化学重 点实验室 (72)发明人 阮婧华 范东生 杨莹 陈艳 周婵媛 苏松柏 于佳 华玉玲 万明香 王道平 (74)专利代理机构 贵阳春秋知识产权代理事务 所(普通合伙) 52109 代理人 杨云 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 47/36(20。

2、06.01) A61K 47/24(2006.01) (54)发明名称 一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的 中空纳米微球及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种胃肠道稳定且靶向肠道 微生物聚集的中空纳米微球， 采用抗性淀粉10- 15份、 壳聚糖3-5份共溶于温度为80-90的水 中， 回流4-5h， 减压浓缩旋干， 然后加入4-10份卵 磷脂， 按总重量的10倍加入无水乙醇， 回流2-3h, 减压浓缩旋干， 即为微球壳层聚合物； 取1-3份碳 酸氢钠溶解于3-5倍的水中， 再将其缓慢分散于 20-30份的无水乙醇中得到纳米核仁无水乙醇溶 液， 将微球壳层聚合物缓慢加入至含有纳米核仁 的。

3、无水乙醇溶液中， 搅拌5-10min， 将其加入200 份含有浓度为0.2%的十八烷基丙烯酸酯的水中， 搅拌至乙醇挥干， 加入2-5%葡萄糖， 冷冻干燥， 即 得中空纳米微球， 本发明所公开的中空纳米微球 可以通过内部中空装载大量的药物， 提高药物的 载药量； 外层具有电负性的壳聚糖分布， 具有稳 定性提高、 粒径小的特点， 有助于药物的吸收和 分布。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 109223731 A 2019.01.18 CN 109223731 A 1.一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球， 其特征在于， 制备该中空 纳米微球的原料组成， 按重量份数计： （1。

4、） 微球壳层聚合物:抗性淀粉10-15份， 壳聚糖3-5份， 卵磷脂4-10份， 无水乙醇100- 400份；（2） 纳米核仁无水乙醇溶液: 碳酸氢钠溶1-3份， 水3-15份， 无水乙醇20-30份； 所述的中空纳米微球制备的步骤如下： 步骤A微球壳层聚合物的制备： 采用抗性淀粉、 壳聚糖共溶于温度为80-90的水中， 回 流4-5h， 减压浓缩旋干， 然后加入卵磷脂， 按比例加入无水乙醇， 回流2-3h, 减压浓缩旋干， 即为微球壳层聚合物； 步骤B纳米核仁无水乙醇溶液制备： 取碳酸氢钠溶解于水中， 再将其缓慢分散于无水乙 醇中得到纳米核仁无水乙醇溶液； 步骤C中空纳米微球的制备： 将步骤。

5、A得到的微球壳层聚合物缓慢加入至步骤B得到的 含有纳米核仁的无水乙醇溶液中， 搅拌5-10min， 将其加入含有浓度为0.2%的十八烷基丙烯 酸酯的水中， 搅拌至乙醇挥干， 加入挥干后总重量2-5%葡萄糖， 冷冻干燥， 即得中空纳米微 球； 步骤D中空纳米微球的纯化处理： 将步骤C得到中空纳米微球的重悬于水中， 离心收集， 去除未包裹物质及游离壳聚糖， 然后抗性淀粉溶于80%乙醇中， 并调节pH 值至9， 制备得抗 性淀粉溶液， 将二者混合后， 加入至含有表面活性剂的冷油溶液中， 持续搅拌至固化， 真空 过滤， 石油醚清洗， 烘干。 2.根据权利要1所述的一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中。

6、空纳米微球， 其特 征在于： 所述的抗性淀粉为从何首乌中提取的抗性淀粉。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109223731 A 2 一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球及其 制备方法 技术领域 0001 本发明属于中空纳米微球制备领域， 具体涉及一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物 聚集的中空纳米微球及其制备方法。 背景技术 0002 何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflrum Thunb.的干燥块根。 采用何首 乌提取制备的抗性淀粉品质高， 可抵抗胃内及十二指肠酶消化， 在胃肠道上半部位降解速 率慢； 在胃肠道下半部， 易被肠道微生物分解吸收并释放短链脂。

7、肪酸等活性物质， 可广泛用 可作为口服药物传递系统的理想载体。 0003 肠道微生物是人体健康的重要组成部分， 可发酵分解外源物质， 最终生成短链脂 肪酸， 为肠粘膜细胞提供主要能量来源。 这种能量吸收是由受体介导的高效率过程。 最近有 文献指出： 在结肠外黏液层上存在大量的微生物聚集位， 促进发酵分解， 完成外黏液层与上 皮细胞的能量 “分子交换” 。 众多研究已表明， 靶向纳米粒可通过多种机制改善亲水性、 亲脂 性药物、 生物药物的口服生物利用度。 事实上， 以提高药物溶解度和吸收为目的的口服纳米 混悬剂已经有上市品种。 尽管口服靶向纳米粒的巨大潜在应用， 但其传递系统在苛刻的胃 肠道环境。

8、中的有效性仍是研究的重点与难点。 纳米粒表面耦合适当的配体， 与特定受体结 合， 可增加其穿越上皮细胞的能力， 但是配体与受体的辨识有限。 研究者采用了多种方式改 善靶向纳米材料在口服给药中的性质， 如耦合高分子量亲水性物质如白蛋白、 聚乙二醇等 改善纳米材料的亲水性和表面电性； 选用小分子配体如叶酸增加与粘蛋白的相互作用； 制 备壳结构的纳米材料， 掩蔽配基， 增加其稳定性。 然而， 剧烈变化的pH和酶环境均会显著影 响靶向纳米粒的稳定性、 特异性， 纳米材料靶向有效性在复杂的生理环境中仍然是不可控 的。 因此， 为了确保靶向NPs配体-受体作用的有效性， 我们需要设计一种具有胃肠道稳定性 。

9、好， 结构可控， 穿过黏液层的能力的纳米材料， 可以靶向肠道微生物聚集位的微粒， 借助能 量交换受体位点可以实现药物主动穿越黏液层、 进入上皮细胞。 0004 天然来源的抗性淀粉又称抗酶解淀粉及难消化淀粉， 是由葡萄糖缩合而成的直链 淀粉。 它具有特殊的理化性质： 不受pH影响， 不能被肠道中胰酶酶解， 但可被人的肠胃道结 肠中微生物分解。 发明人在前期研究中从何首乌药渣中提取分离得到了一种抗性淀粉。 其 稳定性好， 不溶于水， 聚合度适中， 性质结构不受pH变化以及淀粉酶、 胰酶影响， 能够快速被 微生物分解。 通过实验证明， 何首乌抗性淀粉在胃肠道生理环境下保持较好的稳定性， 易被 微生物。

10、分解， 具有较好的微生物靶向性。 此外， 由于其适中的分子量， 已证明在塑化剂的作 用下可以缩聚成微米级颗粒。 因此， 何首乌抗性淀粉的水不溶性， 对胃肠道酶和pH的耐受性 以及在肠道微生物环境下的快速分解性， 使其可以作为口服传递系统的理想载体。 然而， 何 首乌抗性淀粉自身并不适合作为药物的传递载体， 因为它在生理条件下高稳定会导致药物 释放不完全。 壳聚糖是另一种天然聚合物， 已被广泛用于口服给药系统中， 可制成纳米级粒 径的小颗粒。 由于其强粘附性和肠道中高稳定性， 不易被微生物降解， 因而特别适合肠道传 说 明 书 1/6 页 3 CN 109223731 A 3 递介质。 但是， 。

11、壳聚糖在酸性条件下溶解度大、 不稳定且易被溶菌酶降解， 不利于给药系统 的胃内稳定性。 联合抗性淀粉和壳聚糖,利用抗性淀粉在胃肠道的高稳定、 微生物环境迅速 分解的特性和壳聚糖纳米粒强粘附的作用， 建立一个双物质口服给药中空纳米微球颗粒将 会很大的开发应用潜力。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球 及其制备方法， 该中空纳米微球可以通过内部中空装载大量的药物， 提高药物的载药量； 外 层具有电负性的壳聚糖分布， 具有稳定性提高、 粒径小的特点， 有助于药物的吸收和分布， 为达到上述目的本发明采取以下技术方案： 0006 1.一种胃肠道稳定且。

12、靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球， 制备该中空纳米微球 的原料组成， 按重量份数计： 0007 (1)微球壳层聚合物:抗性淀粉10-15份， 壳聚糖3-5份， 卵磷脂4-10份， 无水乙醇 100-400份； (2)纳米核仁无水乙醇溶液:碳酸氢钠溶1-3份， 水3-15份， 无水乙醇20-30份； 0008 所述的中空纳米微球制备的步骤如下： 0009 步骤A微球壳层聚合物的制备： 采用抗性淀粉、 壳聚糖共溶于温度为80-90的水 中， 回流4-5h， 减压浓缩旋干， 然后加入卵磷脂， 按比例加入无水乙醇， 回流2-3h,减压浓缩 旋干， 即为微球壳层聚合物； 0010 步骤B纳米核仁无水乙醇。

13、溶液制备： 取碳酸氢钠溶解于水中， 再将其缓慢分散于无 水乙醇中得到纳米核仁无水乙醇溶液； 0011 步骤C中空纳米微球的制备： 将步骤A得到的微球壳层聚合物缓慢加入至步骤B得 到的含有纳米核仁的无水乙醇溶液中， 搅拌5-10min， 将其加入含有浓度为0.2的十八烷 基丙烯酸酯的水中， 搅拌至乙醇挥干， 加入挥干后总重量2-5葡萄糖， 冷冻干燥， 即得中空 纳米微球； 0012 步骤D中空纳米微球的纯化处理： 将步骤C得到中空纳米微球的重悬于水中， 离心 收集， 去除未包裹物质及游离壳聚糖， 然后抗性淀粉溶于80乙醇中， 并调节pH值至9， 制备 得抗性淀粉溶液， 将二者混合后， 加入至含有。

14、表面活性剂的冷油溶液中， 持续搅拌至固化， 真空过滤， 石油醚清洗， 烘干。 0013 所述的抗性淀粉为从何首乌中提取的抗性淀粉。 0014 本发明的有益效果表现在以下几个方面： 0015 (1)该纳米微球可以靶向肠道微生物聚集位的微粒， 借助能量交换受体位点可以 实现药物主动穿越黏液层、 进入上皮细胞， 是联合抗性淀粉和壳聚糖,利用壳聚糖在胃肠道 的高稳定、 微生物环境迅速分解的特性和抗性淀粉纳米粒强粘附的作用建立一个双物质口 服给药系统。 0016 (2)该中空纳米微球可以通过内部中空装载大量的药物， 提高药物的载药量； 外层 具有电负性的壳聚糖分布， 具有稳定性提高、 粒径小的特点， 有。

15、助于药物的吸收和分布。 附图说明： 0017 图1中空纳米微球的形态结构图： 左为扫描电镜图， 右为激光共聚焦扫描电镜图； 说 明 书 2/6 页 4 CN 109223731 A 4 0018 图2不同pH值条件下PTX-SZN和PTX-HTZN平均粒径稳定性的对比图； 0019 图3不同pH条件离心后PTX-SZN(左)和PTX-HTZN(右)稳定性对比图； 0020 图4中空纳米粒PTX-HTZN与固体纳米PTX-SZN累积渗透率对比图； 0021 图5不同抑制剂对中空纳米粒PTX、 固体纳米PTX-SZN与中空纳米粒PTX-HTZN的表 观渗透率的对比图。 具体实施方式 0022 下面。

16、结合实施例对本发明一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微 球及其制备方法作进一步描述。 0023 实施例1 0024 一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球， 制备该中空纳米微球的 原料组成， 按重量份数计： 0025 (1)微球壳层聚合物:抗性淀粉10份， 壳聚糖5份， 卵磷脂4份， 无水乙醇100份； 0026 (2)纳米核仁无水乙醇溶液:碳酸氢钠溶1份， 水3份， 无水乙醇20份。 0027 其中所述的抗性淀粉为从何首乌中提取的抗性淀粉。 0028 一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球的制备方法包括以下步 骤： 0029 步骤A微球壳层聚合物的制备： 采用抗。

17、性淀粉10份、 壳聚糖5份共溶于温度为90 的水中， 回流4h， 减压浓缩旋干， 然后加入4份卵磷脂， 加入100份无水乙醇， 回流2h,减压浓 缩旋干， 即为微球壳层聚合物； 0030 步骤B纳米核仁无水乙醇溶液制备： 取1份碳酸氢钠溶解于3倍的水中， 再将其缓慢 分散于20份的无水乙醇中得到纳米核仁无水乙醇溶液； 0031 步骤C中空纳米微球的制备： 将步骤A得到的微球壳层聚合物缓慢加入至步骤B得 到的含有纳米核仁的无水乙醇溶液中， 搅拌5min， 将其加入200份含有浓度为0.2的十八 烷基丙烯酸酯的水中， 搅拌至乙醇挥干， 加入2葡萄糖， 冷冻干燥， 即得中空纳米微球； 0032 步骤。

18、D中空纳米微球的纯化处理： 将步骤C得到中空纳米微球的重悬于水中， 离心 收集， 去除未包裹物质及游离壳聚糖。 然后抗性淀粉溶于80乙醇中， 并调节pH值至9， 制备 得抗性淀粉溶液。 将二者混合后， 加入至含有表面活性剂的冷油溶液中， 持续搅拌至固化， 真空过滤， 石油醚清洗， 烘干。 0033 实施例2 0034 一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球， 制备该中空纳米微球的 原料组成， 按重量份数计： 0035 (1)微球壳层聚合物:抗性淀粉15份， 壳聚糖5份， 卵磷脂10份， 无水乙醇150份； 0036 (2)纳米核仁无水乙醇溶液:碳酸氢钠溶2份， 水10份， 无水乙醇2。

19、5份。 0037 其中所述的抗性淀粉为从何首乌中提取的抗性淀粉。 0038 一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球的制备方法包括以下步 骤： 0039 步骤A微球壳层聚合物的制备： 采用抗性淀粉15份、 壳聚糖5份共溶于温度为80 的水中， 回流5h， 减压浓缩旋干， 然后加入10份卵磷脂， 加入150份无水乙醇， 回流2h,减压浓 说 明 书 3/6 页 5 CN 109223731 A 5 缩旋干， 即为微球壳层聚合物； 0040 步骤B纳米核仁无水乙醇溶液制备： 取2份碳酸氢钠溶解于10份的水中， 再将其缓 慢分散于25份的无水乙醇中得到纳米核仁无水乙醇溶液； 0041 步骤C。

20、中空纳米微球的制备： 将步骤A得到的微球壳层聚合物缓慢加入至步骤B得 到的含有纳米核仁的无水乙醇溶液中， 搅拌8min， 将其加入200份含有浓度为0.2的十八 烷基丙烯酸酯的水中， 搅拌至乙醇挥干， 加入3葡萄糖， 冷冻干燥， 即得中空纳米微球； 0042 步骤D中空纳米微球的纯化处理： 将步骤C得到中空纳米微球的重悬于水中， 离心 收集， 去除未包裹物质及游离壳聚糖。 然后抗性淀粉溶于80乙醇中， 并调节pH值至9， 制备 得抗性淀粉溶液。 将二者混合后， 加入至含有表面活性剂的冷油溶液中， 持续搅拌至固化， 真空过滤， 石油醚清洗， 烘干。 0043 实施例3 0044 一种胃肠道稳定且。

21、靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球， 制备该中空纳米微球的 原料组成， 按重量份数计： 0045 (1)微球壳层聚合物:抗性淀粉12份， 壳聚糖4份， 卵磷脂6份， 无水乙醇200份； 0046 (2)纳米核仁无水乙醇溶液:碳酸氢钠溶3份， 水15份， 无水乙醇30份。 0047 其中所述的抗性淀粉为从何首乌中提取的抗性淀粉。 0048 一种胃肠道稳定且靶向肠道微生物聚集的中空纳米微球的制备方法包括以下步 骤： 0049 步骤A微球壳层聚合物的制备： 采用抗性淀粉12份、 壳聚糖4份共溶于温度为85 的水中， 回流4.5h， 减压浓缩旋干， 然后加入6份卵磷脂， 加入200份无水乙醇， 回流3h。

22、,减压 浓缩旋干， 即为微球壳层聚合物； 0050 步骤B纳米核仁无水乙醇溶液制备： 取3份碳酸氢钠溶解于15份水中， 再将其缓慢 分散于30份的无水乙醇中得到纳米核仁无水乙醇溶液； 0051 步骤C中空纳米微球的制备： 将步骤A得到的微球壳层聚合物缓慢加入至步骤B得 到的含有纳米核仁的无水乙醇溶液中， 搅拌10min， 将其加入200份含有浓度为0.2的十八 烷基丙烯酸酯的水中， 搅拌至乙醇挥干， 加入2葡萄糖， 冷冻干燥， 即得中空纳米微球； 0052 步骤D中空纳米微球的纯化处理： 将步骤C得到中空纳米微球的重悬于水中， 离心 收集， 去除未包裹物质及游离壳聚糖。 然后抗性淀粉溶于80乙。

23、醇中， 并调节pH值至9， 制备 得抗性淀粉溶液。 将二者混合后， 加入至含有表面活性剂的冷油溶液中， 持续搅拌至固化， 真空过滤， 石油醚清洗， 烘干。 0053 发明人对其制备的中空纳米微球的理化性质包括粒径、 电位进行测试， 同时采用 扫描电镜观察其形态， 具体数据： 通过测试得到制备的中空纳米微球的平均粒径62nm， 电 位-21.00.7mV.通过投射电镜SEM及激光共聚焦扫描电镜CLSM观察形态， 可见纳米粒中空 形态见图1。 0054 发明人为了进一步的验证本发明的有益效果， 对紫杉醇， 简写代号为： PTX作为模 型药物， 对所制备的中空纳米微球， 以稳定性、 粘附性、 透过性。

24、、 细胞摄取为指标， 通过体内- 体外试验结合的手段， 探索了中空纳米微球为载体的紫杉醇口服给药系统稳定性及有效 性。 具体实验方法和数据如下： 0055 取实施例1制备的中空纳米微球， 以微球和模型药的质量比为1： 1混合， 加入适量 说 明 书 4/6 页 6 CN 109223731 A 6 溶液中， 磁力搅拌过夜， 所得溶液按柱体积的1/100上样， 过型号为G-25葡聚糖凝胶柱， 除去 Na2CO3及其他杂质， 即得所需中空纳米微球， 简写代号为： PTX-HTZN。 以稳定性、 粘附性、 透过 性、 细胞摄取为指标， 通过体内-体外试验结合的手段， 探索了中空纳米微球为载体的紫杉 。

25、醇口服给药系统稳定性及有效性， 同时， 与常规方法制备的固体纳米粒， 简写代号为： PTX- SZN进行对比。 0056 (1)稳定性考察 0057 纳米粒稳定性影响研究中， 采用模拟体内环境方法研究载药纳米粒的泄漏和粒径 变化。 从实验结果可知， PTX固体载药纳米粒PTX-SZN在pH1-3时粒径变化剧烈， 具体见图2， 在pH1时PTX产生了大量聚集,甚至沉淀； PTX载药中空纳米粒在酸性环境下聚集程度减 轻， 在pH1时不产生沉淀； 且载药中空纳米粒有助于药物的完全释放。 中空纳米粒载药方 式为药物进入中空的内部， 从而不仅增大了载药量， 也使分布于纳米粒表面的药物量减少， 从而减少了。

26、颗粒间的聚集， 具体见图3。 0058 (2)粘附性考察 0059 取纳米粒荧光衍生化的PTX-HTZN和PTX-STZ， 以pH7.4PBS配制为0.1mg/10ml溶液。 取32只昆明种小鼠按体重随机分为3组(荧光素对照组、 PTX-HTZN组及PTX-STZ组)， 完全禁 食24小时后， 麻醉， 打开腹腔， 制备能保持良好血供且含有1个或多个派伊氏结(Peyer spatch， PP)的约1cm长的肠绊。 将上述溶液注入肠绊中， 30min后取肠绊， PBS中充分洗涤后 切取一个P氏结， 置激光共聚焦显微镜观察， 取5个视野， 对图像进行亮度积分， 以荧光素对 照组强度为1， 计算各组相。

27、对荧光强度。 结果显示， PTX-HTZN组肠道粘附能力明显高于其他 组， 具体见下表1。 0060 表1荧光素衍生化PTX与肠道作用后的相对荧光强度分析 0061 0062 (3)透过性考察 0063 Caco-2细胞固化后与不同样品孵育， 不同时间点取样。 通过HPLC定量测定纳米粒 内化效率， 考察透过肠道上皮细胞的能力。 试验结果表明， 固体纳米粒制备不易透过细胞， 因而也减少了内化的可能； 中空纳米粒较易透过细胞膜， 进入细胞， 具体见图4。 0064 (4)细胞摄取考察 0065 结合文献， 分别选择阿米洛利(amilorde， 3mM)、 酰戊二胺(50 M)和菲律宾菌素(1 g。

28、/ml)作为CAM、 网格蛋白和小窝蛋白通路的抑制剂。 Caco-2细胞在37下与传递系统共孵 育30min， 使其结合在细胞表面。 随后缓冲液冲洗去除未结合的部分。 继续共孵育， 观察不同 时间点纳米粒进入细胞的荧光变化。 以不同通路抑制剂结果为对照。 为了详细观察纳米粒 进入细胞的内化过程， 固化不同时间点的细胞并与田纳西红共育， DAPI细胞核染色。 采用荧 光显微镜观察： 细胞表面的纳米粒呈黄色荧光(红色+绿色)， 内化的纳米粒呈FITC的绿色荧 说 明 书 5/6 页 7 CN 109223731 A 7 光。 实验结果表明， 固体纳米粒可以与细胞表面结合， 但难以被内化进入细胞； 中空纳米粒 则具有较好的结合及内化效率， 具体见图5。 说 明 书 6/6 页 8 CN 109223731 A 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 109223731 A 9 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 109223731 A 10 。