一种花楸果及其提取物在制备抗病毒性肝炎药物中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811356470.6 (22)申请日 2018.11.14 (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街2699 号 (72)发明人 李海军 刘菲 慈鑫鑫 高永梅 尹嘉宁 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 22100 代理人 魏征骥 (51)Int.Cl. A61K 36/73(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61K 1。

2、31/00(2006.01) (54)发明名称 一种花楸果及其提取物在制备抗病毒性肝 炎药物中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种花楸果及其提取物在制备 抗病毒性肝炎药物中的应用， 属于中药领域。 花 楸果及其提取物在制备抗病毒性肝炎药物中的 应用， 所述的花楸果提取物为花楸果水提取物、 花楸果乙醇提取物或花楸果甲醇提取物。 优点是 该应用直接解决了慢性HBV， HCV等病毒性肝炎的 高病毒载量和严重的肝细胞损伤， 并间接的提高 机体免疫功能， 增强机体免疫细胞的活力和抗病 毒能力， 可以辅助临床抗病毒药物应用， 达到保 肝护肝同时降低病毒载量的双重作用， 应用花楸 果及其提取物可制备治疗病毒。

3、性肝炎药物。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 109248202 A 2019.01.22 CN 109248202 A 1.花楸果在制备抗病毒性肝炎药物中的应用。 2.花楸果提取物在制备抗病毒性肝炎药物中的应用。 3.根据权利要求2所述的花楸果提取物在制备抗病毒性肝炎药物中的应用， 其特征在 于： 所述的花楸果提取物为花楸果水提取物、 花楸果乙醇提取物或花楸果甲醇提取物。 4.根据权利要求3所述的花楸果提取物在制备抗病毒性肝炎药物中的应用， 其特征在 于： 花楸果乙醇提取物再经硅胶柱层析以石油醚： 丙酮(1001)： 1梯度洗脱， 收集石油 醚： 丙酮5： 1组分， 进一步经乙酸。

4、乙酯重结晶。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109248202 A 2 一种花楸果及其提取物在制备抗病毒性肝炎药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及中药领域， 特别涉及中药源抗病毒性肝炎药物。 背景技术 0002 病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。 临床上以食 欲减退、 恶心、 上腹部不适、 肝区痛、 乏力为主要表现。 部分病人可有黄疸发热和肝大伴有肝 功能损害， 有些病人可慢性化， 甚至发展成肝硬化， 少数可发展为肝癌。 病毒性肝炎的病原 学分型， 目前已被公认的有甲、 乙、 丙、 丁、 戊五种肝炎病毒， 分别写作HAV、 HBV、 HCV、 HD。

5、V、 HEV， 除乙型肝炎病毒为DNA病毒外， 其余均为RNA病毒。 己型肝炎曾有报道， 但至今病原分离 未成功。 近年报道， 属于黄病毒的庚肝病毒和单链DNA的TTV与人类肝炎的关系尚存在争议。 0003 急性肝炎一般不用抗病毒治疗， 仅在急性丙型肝炎时提倡早期应用干扰素防止慢 性化， 而慢性病毒性肝炎需要抗病毒治疗。 干扰素： 重组DNA白细胞干扰素(IFN- )可抑制 HBV的复制。 隔天肌注， 连续6个月， 仅有3050患者获得较持久的效果。 丙型肝炎的首 选药物为干扰素， 可与利巴韦林联合应用。 拉米夫定： 是一种合成的二脱氧胞嘧啶核甘类 药物， 具有抗HBV的作用。 口服拉米夫定，。

6、 血清HBV-DNA水平可明显下降， 服药12周HBV-DNA转 阴率达90以上。 长期用药可降低ALT， 改善肝脏炎症， 但HBeAg阴转率仅1618， 治疗6 个月以上， 可发生HBV的变异， 但仍可继续服用本药， 副作用轻可继续服用14年。 泛昔洛 韦： 是一种鸟苷类药物， 它的半衰期长， 在细胞内浓度高， 可以抑制HBV-DNA的复制。 本药副 作用轻可与拉米夫定干扰素等合用提高疗效。 其他抗病药物： 如阿昔洛韦、 阿德福韦、 膦 甲酸钠等均有一定抑制HBV效果。 0004 此外还有免疫调节剂疗法， 常用的有： 胸腺素 1有双向免疫调节作用， 可重建原 发、 继发性免疫缺陷患者的免疫功。

7、能。 胸腺素参与机体的细胞发生免疫反应， 诱导T淋巴 细胞的分化成熟， 放大T细胞对抗原的反应， 调节T细胞各亚群的平衡。 免疫核糖核酸在体 内能诱生干扰素而增强机体免疫功能。 导向治疗， 新的免疫治疗(如DNA疫苗免疫复合物治 疗等)及基因治疗(反义核酸治疗转基因治疗)。 护肝药： 促肝细胞生长素促进肝细胞再 生， 对肝细胞损伤有保护作用， 并能调节机体免疫功能和抗纤维化作用。 水飞蓟宾有保护 和稳定肝细胞膜作用。 甘草酸二铵具有较强的抗炎， 保护细胞膜及改善肝功能的作用， 适 用于伴有谷丙转氨酶升高的慢性迁延性肝炎及慢性活动性肝炎。 腺苷蛋氨酸补充外源性 的腺苷蛋氨酸有促进黄疸消退和肝功能。

8、恢复的作用。 中医中药： 辨证治疗对改善症状及肝 功能有较好疗效， 如茵陈、 栀子、 赤芍、 丹参等。 0005 我们在对长白山地区的近百种药用植物活性筛选过程中， 发现了几种具有较强抗 肝炎病毒的植物， 其中就包括花楸果。 0006 花楸， 俗称： 马加木(东北土名)， 别名： 臭槐树、 花楸、 水桐、 河楸、 黄花楸， 拉丁文 名： Sorbus pohuashanensis， 蔷薇科、 花楸属乔木。 复叶类槐叶， 故又有别名臭槐树。 分布于 我国黑龙江、 吉林、 辽宁、 内蒙古、 河北、 山西、 甘肃、 山东、 长江流域及以北地区； 日本也有。 嫩叶可食； 叶或树皮可作农药， 可杀稻螟、。

9、 稻飞虱； 果实入药， 有显著利尿作用， 可作利尿剂， 说 明 书 1/5 页 3 CN 109248202 A 3 治肾脏病， 肾气膀胱炎、 肝硬化， 腹水。 发明内容 0007 本发明提供一种花楸果及其提取物在制备抗病毒性肝炎药物中的应用， 该应用直 接解决了慢性HBV， HCV等病毒性肝炎的高病毒载量和严重的肝细胞损伤， 并间接的提高机 体免疫功能， 增强机体免疫细胞的活力和抗病毒能力， 可以辅助临床抗病毒药物应用， 达到 保肝护肝同时降低病毒载量的双重作用。 0008 本发明采取的技术方案是： 花楸果及其提取物作为活性组分在制备抗病毒性肝炎 药物中的应用， 其中所述花楸果及其提取物包含。

10、所述花楸果原植物、 及其溶剂提取物， 其中 所述溶剂提取物为水、 乙醇、 甲醇提取物。 0009 所述的花楸果及其提取物用于制备抗病毒性肝炎药物中的应用， 可以通过下述方 法制备： 0010 1.取花楸果， 干燥， 粉碎， 附加药学可以接受的辅料， 制成片剂、 胶囊剂、 散剂、 丸剂 等药学上可以接受的剂型。 0011 2.取花楸果， 以水、 乙醇或甲醇等溶剂提取， 浓缩至干， 得到花楸果提取物， 以该提 取物为原料， 附加药学可以接受的辅料， 制成片剂、 胶囊剂、 散剂、 丸剂、 软胶囊等药学上可 以接受的剂型。 0012 3.进一步优选花楸果经乙醇提取的乙醇提取物， 乙醇提取物再经硅胶柱层。

11、析以石 油醚： 丙酮(1001)： 1梯度洗脱， 收集石油醚： 丙酮5： 1组分， 进一步经乙酸乙酯重结 晶， 得到的有效部位为原料， 附加药学可以接受的辅料， 制成片剂、 胶囊剂、 散剂、 丸剂、 软胶 囊等药学上可以接受的剂型。 0013 本发明优点是该应用直接解决了慢性HBV， HCV等病毒性肝炎的高病毒载量和严重 的肝细胞损伤， 并间接的提高机体免疫功能， 增强机体免疫细胞的活力和抗病毒能力， 可以 辅助临床抗病毒药物应用， 达到保肝护肝同时降低病毒载量的双重作用， 应用花楸果及其 提取物可制备治疗病毒性肝炎药物。 附图说明 0014 图1是花楸果提取物对HepG2.2.15细胞系病毒。

12、载量的作用图， 其中A对照组， B拉米 夫定， C花楸果粉， D水煎煮物， E乙醇提取物， F乙酸乙酯结晶部位； 0015 图2是花楸果提取物对HepG2.2.15细胞系HBsAg的作用图， 其中A对照组， B拉米夫 定， C花楸果粉， D水煎煮物， E乙醇提取物， F乙酸乙酯结晶部位； 0016 图3是花楸果提取物对JFH-Huh7细胞系病毒载量的作用图， 其中A对照组， B特拉普 韦， C花楸果粉， D水煎煮物， E乙醇提取物， F乙酸乙酯结晶部位； 0017 图4是花楸果提取物对JFH-Huh7细胞系HCVcore的作用图， 其中A对照组， B特拉普 韦， C花楸果粉， D水煎煮物， E。

13、乙醇提取物， F乙酸乙酯结晶部位。 具体实施方式 0018 实施例1： 花楸果制备抗病毒性肝炎药物的应用 0019 1、 花楸果抗病毒性肝炎胶囊(Sorbus pohuashanensis capsule,SPC)： 收取花楸 说 明 书 2/5 页 4 CN 109248202 A 4 果， 阴干， 粉碎， 制成硬胶囊制剂。 0020 2、 花楸果抗病毒性肝炎片(Sorbus pohuashanensis tablet,SPT)： 收取花楸果， 阴干， 粉碎， 以810倍量7080乙醇超声提取三次， 每次2535分钟， 过滤， 合并滤液， 蒸干， 粉碎， 加淀粉适量， 压片。 0021 3、。

14、 花楸果抗病毒性肝炎口服液(Sorbus pohuashanensis oral liquid,SPOL)： 取 花楸果， 10倍量水煎煮3050分钟， 过滤， 滤液浓缩得流浸膏， 加辅料， 制成口服液。 0022 实施例2： 花楸果抗病毒性肝炎药物活性研究 0023 制备花楸果粉、 水煎煮物、 乙醇提取物， 乙酸乙酯结晶部位(花楸果经乙醇提取的 乙醇提取物， 乙醇提取物再经硅胶柱层析以石油醚： 丙酮(1001)： 1梯度洗脱， 收集石油 醚： 丙酮5： 1组分， 进一步经乙酸乙酯重结晶， 得到的有效部位。 0024 1材料 0025 1.1药材与试剂 0026 花楸果， 蔷薇科花楸属植物花楸。

15、树Sorbus pohuashanensis的果实， 采自长白山脉 临江地区， 乙型肝炎复制细胞系(HepG2.2.15)、 丙型肝炎复制细胞系(JFH-Huh7)， 购自ATCC 细胞库， DMEM细胞培养基， 胎牛血清购自GIBCO公司； 0027 1.2仪器 0028 Thermo细胞培养箱(赛默飞世尔科技)； II级生物安全柜(美国Thermo公司)； 多功 能酶标(德国Bio-Tek公司)； 实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)； KQ-250B型数控超声波清 洗器(昆山市超声仪器有限公司)； RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)； DZF6020真 空干燥器(上海一恒科。

16、学仪器有限公司)； 0029 1.3试剂 0030 生理盐水(四川程度科伦制药有限责任公司)； 胎牛血清(FBS,Corning,美国)； 磷 酸盐缓冲液(PBS,BI,以色列)； 台盼蓝细胞染料(Trypan blue Solution,Sigma,美国)； 细 胞裂解液(Lysing Buffer,BD,美国)； 二甲基亚砜(DMSO,北京鼎国生物有限公司,中国)； RNAlater(Sigma,美国)； 提取细胞/组织总RNA相关试剂： RNA提取试剂盒(全式金， 中国)； 反 转录试剂： 反转录试剂盒(全式金， 中国)； 实时定量PCR试剂： 实时定量PCR试剂盒(全式金， 中国)； 。

17、RNase-Free water(Sigma， 美国)； HBsAg和HCVcore浓度检测ELSIA试剂盒(科华， 中 国)； 0031 2方法 0032 对文献Yang D,et al.Complete replication of hepatitis B virus and hepatitis C virus in a newly developed hepatomacell line.Proc Natl Acad Sci U S A.2014,111(13):E1264-73中的HBV病毒载量测定， HCV病毒载量测定， HBsAg和HCVcore 浓度测定方法进行了改良。 0033 。

18、2.1细胞培养 0034 将保存于液氮中的装有乙型肝炎复制细胞系(HepG2.2.15)和丙型肝炎复制细胞 系(JFH-Huh7)的冻存管迅速置于37水浴中， 反复轻轻摇晃致细胞完全融化。 在细胞融化 过程中准备一支15mL离心管置于生物安全柜中， 并向离心管中加入5mL含10胎牛血清的 DMEM培养液， 37水浴5分钟； 在无菌操作条件下小心吸取细胞悬液， 滴于预热过的15mL离 心管中， 在滴入过程中缓慢摇动离心管。 待细胞完全转移后进行离心， 1500rpm离心10min； 说 明 书 3/5 页 5 CN 109248202 A 5 弃掉上清后， 向离心管中加入1mL DMEM完全培养。

19、液， 反复吹吸后使细胞重悬均匀。 再向离心 管中补加培养基至10mL， 1500rpm离心10min； 弃上清后将细胞转移接种至25T培养瓶中， 向 其中加入6mL含10胎牛血清的DMEM培养液， 置于37、 饱和湿度、 含有5CO2的孵箱中常 规培养。 待细胞稳定后消化传代， 并培养于96孔培养板中， 每孔细胞数为1105， 细胞贴壁 培养24小时后加入各组药物备用； 0035 2.2花楸果抗病毒性肝炎产品的样品溶液的配制 0036 花楸果抗病毒性肝炎产品见 “实施例1” ， 取相应产品， 胶囊取内容物、 片剂研为细 粉、 口服液直接吸取， 分别加磷酸盐缓冲溶液配成相应浓度的样品溶液； 00。

20、37 2.3产品对细胞系中HBV抑制作用 0038 将HepG2.2.15细胞系培养于96孔培养板中， 每孔细胞数为1105， 细胞贴壁培养 24小时后加入各组药物， 待加入药物72小时后吸去细胞培养上清， 冻存待测HBsAg浓度， 贴 壁细胞用温热至37的PBS缓冲液洗3次， 吹起收集细胞沉淀， 进行qRT-PCR实验检测HBV病 毒拷贝数； 0039 ELSIA方法检测细胞培养上清中HBsAg的浓度； 0040 拉米夫定作为阳性对照； 0041 2.4产品对细胞系中HCV抑制作用 0042 将JFH-Huh7细胞系培养于96孔培养板中， 每孔细胞数为1105。 细胞贴壁培养24 小时后加入。

21、各组药物。 待加入药物72小时后吸去细胞培养上清， 冻存待测HCVcore浓度， 贴 壁细胞用温热至37的PBS缓冲液洗3次， 吹起收集细胞沉淀， 进行qRT-PCR实验检测HCV病 毒拷贝数； 0043 ELSIA方法检测细胞培养上清中HCVcore的浓度； 0044 特拉普韦作为阳性对照； 0045 3结果与分析 0046 3.1产品对HBV抑制作用 0047 花楸果粉(C)、 水煎煮物(D)、 乙醇提取物(E)， 乙酸乙酯结晶部位(F)热溶于1640培 养基中， 浓度为2.0mg/mL， 无菌滤器过滤除菌， 1640完全培养基组(A)作为空白对照组， 拉米 夫定(B)作为阳性对照， 浓度。

22、为10 M； 0048 结果表明， HepG2.2.15细胞系培养72小时后， HBV的DNA拷贝数为6.8105， 加入10 M的拉米夫定后， DNA拷贝数显著下降， 降至4.8103， 与对照组比较具有显著性差异(p 0.01)， 花楸果粉(C)、 水煎煮物(D)不能显著下调HepG2.2.15细胞培养上清中HBV的DNA拷贝 数(p0.05)， 乙醇提取物(E)和乙酸乙酯结晶部位(F)可以显著下调HBV的DNA拷贝数(p 0.01)， 乙酸乙酯结晶部位效果强于乙醇提取物， 如图1所示。 0049 收集HepG2.2.15细胞系培养上清， ELISA法检测细胞培养上清中HBsAg的浓度。 。

23、空 白组中的HBsAg为35IU/mL， 加入10 M的拉米夫定后， HBsAg的浓度显著下降， 降至12IU/mL， 与对照组比较具有显著性差异(p0.001)， 花楸果粉(C)、 水煎煮物(D)不能显著下调HBsAg 的浓度(p0.05)， 乙醇提取物(E)和乙酸乙酯结晶部位(F)可以显著下调HBsAg的浓度(p 0.01)， 乙酸乙酯结晶部位效果强于乙醇提取物， 如图2所示； 0050 3.2产品对HCV抑制作用 0051 花楸果粉(C)、 水煎煮物(D)、 乙醇提取物(E)， 乙酸乙酯结晶部位(F)热溶于1640培 说 明 书 4/5 页 6 CN 109248202 A 6 养基中，。

24、 浓度为2.0mg/mL， 无菌滤器过滤除菌， 1640完全培养基组(A)作为空白对照组， 特拉 普韦(B)作为阳性对照， 浓度为5 M； 0052 结果表明， JFH-Huh7细胞系培养72小时后， HCV的RNA拷贝数为2.3106GE/mL， 加 入5 M的特拉普韦后， RNA拷贝数显著下降， 降至5.3104GE/mL， 与对照组比较具有显著性 差异(p0.001)， 花楸果粉(C)、 水煎煮物(D)不能显著下调JFH-Huh7细胞培养上清中RNA拷 贝数(p0.05)， 乙醇提取物(E)和乙酸乙酯结晶部位(F)可以显著下调HCV的RNA拷贝数(p 0.01)， 乙酸乙酯结晶部位效果强。

25、于乙醇提取物， 如图3所示； 0053 收集JFH-Huh7细胞系培养上清， ELISA法检测细胞培养上清中HCVcore的浓度， 空 白组中的HCVcore浓度为1.3106fmol/L， 加入5 M的特拉普韦后， HCVcore的浓度显著下 降， 降至3.3103fmol/L， 与对照组比较具有显著性差异(p0.001)， 花楸果粉(C)、 水煎煮 物(D)不能显著下调HCVcore的浓度(p0.05)， 乙醇提取物(E)和乙酸乙酯结晶部位(F)可 以显著下调HCVcore的浓度(p0.01)， 乙酸乙酯结晶部位效果强于乙醇提取物， 如图4所 示。 说 明 书 5/5 页 7 CN 109248202 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 109248202 A 8 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 109248202 A 9 。