治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及其应用以及其提取方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103202897 B (45)授权公告日 2014.12.24 CN 103202897 B (21)申请号 201210535219.2 (22)申请日 2012.12.12 A61K 36/73(2006.01) A61P 5/50(2006.01) (73)专利权人 重庆大学 地址 400044 重庆市沙坪坝区沙坪坝正街 174 号 (72)发明人 祝连彩 王伯初 郭廷旺 周雪梅 谭君 刘曦 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 谢殿武 CN 1919315 A,2007.02.28, 全文 . CN 101229252。

2、 A,2008.07.30, 全文 . 周晓蓉等 . 仙鹤草对糖尿病大鼠血糖胰岛素 水平的影响 .职业与健康 .2012, 第 28 卷 ( 第 6 期 ), 陈优生等 . 仙鹤草降糖活性部位筛选 .安 徽医药 .2010, 第 14 卷 ( 第 7 期 ), 陈优生等 . 仙鹤草降糖活性成分研究 （） . 中药材 .2010, 第 33 卷 ( 第 5 期 ), (54) 发明名称 治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及 其应用以及其提取方法 (57) 摘要 本发明公开一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙 鹤草活性组分及其应用以及其提取方法， 治疗和 改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 包括仙鹤草 黄。

3、酮组分和仙鹤草三萜组分， 所述仙鹤草黄酮组 分与仙鹤草三萜组分的质量比为 4:1-1:4 ； 通过 HPLC 分析得知 ： 仙鹤草的黄酮组分中主要含有牡 荆苷、 异牡荆苷和木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷、 槲皮 苷、 银椴苷 ； 仙鹤草三萜组分中主要含有熊果酸、 4- 羟基熊果酸、 科罗索酸和齐墩果酸。针对仙鹤 草活性组分对胰岛素抵抗的干预， 发现仙鹤草活 性组分不仅对 PPAR 的激活作用与阳性对照药 物吡格列酮无显著差异， 可显著促进前脂肪细胞 的分化 ； 而且在激活 PPAR 表达的同时不像阳性 对照药物吡格列酮样诱导 AP2 的过度表达， 表明 仙鹤草活性组分具有改善和治疗胰岛素抵抗的。

4、作 用， 可以制备成相应的剂型进行预防或治疗胰岛 素抵抗。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孔倩 权利要求书 1 页 说明书 11 页 序列表 2 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图6页 (10)授权公告号 CN 103202897 B CN 103202897 B 1/1 页 2 1. 一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 其特征在于 ： 该活性组分为仙鹤草 黄酮组分或仙鹤草三萜组分或仙鹤草黄酮组分和仙鹤草三萜组分的组合物， 仙鹤草的黄酮 组分中主要含有牡荆苷、 异牡荆苷、 木犀草素。

5、 -7-O- 葡萄糖苷、 槲皮苷和银椴苷 ； 仙鹤草三 萜组分中主要含有熊果酸、 4- 羟基熊果酸、 科罗索酸和齐墩果酸， 该仙鹤草活性组分通过包 括以下步骤的提取方法提取 ： a. 取仙鹤草全草在温度为 105-115下干燥至恒重并粉碎至 35-45 目， 然后加入 95 乙醇在温度为 85-95回流提取 3 次后过滤， 每次提取 2 小时， 滤过， 收集滤液和滤渣， 将收 集的滤液减压浓缩制得浸膏 ； b. 将步骤 a 中的浸膏用 95乙醇分散溶解后加入 10浸膏重量的活性炭回流 2 小时 后过滤并收集滤液， 将所收集的滤液浓缩后以样品 ： 硅胶 1 ： 30 上硅胶柱， 依次用乙酸乙 酯。

6、:石油醚1:1， 乙酸乙酯:石油醚5:1及纯乙酸乙酯洗脱， 各洗脱5个柱体积， 分别收 集得洗脱液 ( )， 洗脱液 ( )， 洗脱液 ( ) ； c. 将洗脱液 ( ) 和洗脱液 ( ) 溶于体积比为氯仿 ： 甲醇 1:1 的混合液， 上 LH-20 凝胶柱， 经薄层层析法检测分析， 得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分 ； d. 将步骤 a 中的滤渣用 50的乙醇回流提取 3 次， 每次 1.5h， 提取液浓缩后用 60的 乙醇分散溶解， 调节 pH 为 5.0， 然后缓慢加入 5.0的明胶溶液至不再产生沉淀为止， 过滤 除去鞣酸蛋白后再加入 95的乙醇至乙醇浓度为 85时除去过量的明胶和提取物中。

7、的蛋 白及多糖， 然后过滤并将滤液浓缩， 制得浸膏 ； 将该浸膏溶于 80的甲醇， 上 LH-20 凝胶柱， 经薄层层析检测分析， 得到黄酮组分 ； e. 合并步骤 c 和步骤 d 中的黄酮组分。 2. 根据权利要求 1 所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 其特征在于 ： 所述黄酮组分及三萜组分的组合物中黄酮组分与三萜组分的质量比为 4:1-1:4。 3. 根据权利要求 2 所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 其特征在于 ： 所 述仙鹤草黄酮组分与仙鹤草三萜组分的质量比为 4:1。 4. 根据权利要求 3 所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 其特征在于 ： 所 述。

8、仙鹤草黄酮组分总黄酮的质量百分比含量不低于 30， 仙鹤草三萜组分总三萜的质量百 分比含量不低于 40。 5. 根据权利要求 1-4 任一权利要求所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 其特征在于 ： 所述仙鹤草为蔷薇科龙牙草属植物。 6. 根据权利要求 1 所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 其特征在于 ： 步 骤 a 中取仙鹤草全草在温度为 110下干燥至恒重并粉碎至 40 目， 然后加入 95乙醇在温 度为 90回流提取 3 次后过滤。 7. 一种权利要求 1 所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分在制备治疗和改 善胰岛素抵抗药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 。

9、103202897 B 2 1/11 页 3 治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及其应用以及其 提取方法 技术领域 0001 本发明涉及一种仙鹤草的活性组分， 特别涉及一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤 草活性组分及其应用以及其提取方法。 背景技术 0002 胰岛素抵抗是指胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率降低， 表现为外周组织尤其 是肌肉、 脂肪组织对葡萄糖的利用障碍， 自始至终贯穿于 2 型糖尿病发生、 发展的全过程。 特别是 1995 年 Stern 提出了闻名的 “共同土壤” 学说， 丰富了 IR 的内涵， 即肥胖、 高血压、 高脂血症、 动脉粥样硬化、 冠状动脉粥样硬化性心脏病、 2 型。

10、糖尿病、 脑卒中等均具有共同的 病理基础胰岛素抵抗。 目前临床应用于改善和治疗胰岛素抵抗的药物主要是胰岛素增 敏剂噻唑烷二酮类药物 （TZDs） （如吡格列酮和罗格列酮） ， 其通过激活 PPAR， 进一步选择 性的促进下游基因的转录， 可以募集前脂肪细胞， 促进其分化及在胞内积聚更多的脂质。 所 以此类药物往往伴随着体重增加， 肥胖的副作用， 也加重了心血管的危险， 同时低血糖、 全 身性浮肿、 心脏负荷、 骨质疏松、 癌症等也是较明显的副作用。因此， 开发新型的 PPAR 激活 剂则具有重要的经济和社会价值， 而中药具多环节、 多靶点、 且相对安全特点， 寻找和开发 PPAR 的选择性或不。

11、完全激活剂， 可以在降低胰岛素抵抗的同时， 降低因脂肪过度积累而 导致的心血管疾病风险等副作用。调控前脂肪细胞分化的转录因子主要为 ： PPAR、 ADD1/ SREBP-1 和 C/EBP-。PPAR 可以调控 C/EBP-、 脂质代谢关键酶、 脂肪分泌蛋白、 脂肪活 性因子的表达从而参与脂肪细胞分化进程。 AP2可调控细胞内脂肪酸的转运和合成， 是外周 胰岛素敏感和糖脂代谢的关键调节器。PPAR 是 AP2 基因表达的重要调节因子， 通过调节 其基因启动子中的 PPAR 反应元件 （PPRE） ， 增加脂肪细胞中 AP2 的表达， 从而促进脂肪细胞 的分化， 但同时增加了胞内脂质的累积。因。

12、此 AP2 过量表达， 可造成正常的脂肪代谢平衡的 紊乱。研究表明， 使用 AP2 的抑制剂和 PPAR 的激动剂均可以使外周胰岛素增敏。 0003 仙鹤草为蔷薇科多年生草本植物龙牙草 （Agrimonia Pilosa Ledeb） 的全草， 中医 主要用于治疗治咯血、 吐血、 便血， 崩漏带下， 劳伤脱力， 痈肿， 创伤出血等。 目前对仙鹤草的 化学成分的研究表明， 其含有多酚、 黄酮及黄酮糖苷类化合物、 三萜类化合物和仙鹤草内酯 等。而目前尚未有仙鹤草活性组分用于治疗和改善胰岛素抵抗的报道。 发明内容 0004 本发明主要针对仙鹤草活性组分对胰岛素抵抗的干预， 发现仙鹤草活性组分不仅 对。

13、 PPAR 的激活作用与阳性对照药物吡格列酮无显著差异， 可显著促进前脂肪细胞的分 化 ； 而且在激活 PPAR 表达的同时不像阳性对照药物吡格列酮样诱导 AP2 的过度表达， 表 明仙鹤草活性组分具有改善和治疗胰岛素抵抗的作用。 0005 本发明的一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分， 该活性组分包括仙鹤草 中黄酮组分或仙鹤草三萜组分或仙鹤草黄酮组分和仙鹤草三萜组分的组合物。 说 明 书 CN 103202897 B 3 2/11 页 4 0006 进一步， 所述黄酮组分及三萜组分的组合物中黄酮组分与三萜组分的质量比为 4:11 4。 0007 进一步， 所述仙鹤草黄酮组分与仙鹤草三萜组。

14、分的质量比为 4:1 ； 0008 进一步， 所述仙鹤草黄酮组分总黄酮的质量百分比含量不低于 30%， 仙鹤草三萜组 分总三萜的质量百分比含量不低于 40% ； 0009 进一步， 所述仙鹤草为蔷薇科龙牙草属植物， 包括牙草、 黄龙尾、 疏毛龙牙草、 东北 朝鲜龙牙草、 东北的钝齿龙、 东北大兴安岭的多齿龙牙草、 小花龙牙草、 大花龙牙草、 托叶龙 牙草和欧洲的龙牙草。 0010 本发明还公开一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分在制备治疗和改善 胰岛素抵抗药物中的应用。 0011 本发明还公开一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分的提取方法， 其特征 在于 ： 包括以下步骤 ： 0012。

15、 a. 取仙鹤草全草在温度为 105-115下干燥至恒重并粉碎至 35-45 目， 然后加入 95% 乙醇在温度为 85-95回流提取 3 次后过滤， 每次提取 2 小时， 滤过， 收集滤液和滤渣， 将收集的滤液减压浓缩制得浸膏 ； 0013 b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小 时后过滤并收集滤液， 将所收集的滤液浓缩后以样品 ： 硅胶 =1 ： 30 上硅胶柱， 依次用乙酸乙 酯:石油醚=1:1， 乙酸乙酯:石油醚=5:1及纯乙酸乙酯洗脱， 各洗脱5个柱体积， 分别收集 得洗脱液 （） ， 洗脱液 （） ， 洗脱液 （） ； 0014 c. 将洗脱液。

16、 （） 和洗脱液 （） 溶于体积比为氯仿 ： 甲醇 =1:1 的混合液， 上 LH-20 凝胶柱， 经薄层层析法检测分析， 得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分 ； 0015 d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次， 每次1.5h， 提取液浓缩后用60% 的乙醇分散溶解， 调节PH为5.0， 然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止， 过滤 除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白 及多糖， 然后过滤并将滤液浓缩， 制得浸膏 ； 将该浸膏溶于 80% 的甲醇， 上 LH-20 凝胶柱， 经 薄层层析检测分析， 得到黄酮组分。 0016 e. 合。

17、并步骤 c 和步骤 d 中的黄酮组分 ； 0017 进一步， 步骤a中取仙鹤草全草在温度为110下干燥至恒重并粉碎至40目， 然后 加入 95% 乙醇在温度为 90回流提取 3 次后过滤 ； 0018 进一步， 步骤 b 中， 将步骤 a 中的浸膏用 95% 乙醇分散溶解， 然后加入 10% 浸膏重 量的活性炭回流 2 小时后过滤并收集滤液。 0019 本发明的有益效果 ： 本发明的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及其应用 以及其提取方法， 仙鹤草的活性物质群为黄酮组分和三萜组分。通过 HPLC 分析得知 ： 仙鹤 草的黄酮组分中主要含有牡荆苷、 异牡荆苷和木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷、。

18、 槲皮苷、 银椴苷 ； 仙鹤草三萜组分中主要含有熊果酸、 4-羟基熊果酸、 科罗索酸和齐墩果酸。 针对仙鹤草活性 组分对胰岛素抵抗的干预， 发现仙鹤草活性组分不仅对 PPAR 的激活作用与阳性对照药 物吡格列酮无显著差异， 可显著促进前脂肪细胞的分化 ； 而且在激活 PPAR 表达的同时不 像阳性对照药物吡格列酮样诱导 AP2 的过度表达， 表明仙鹤草活性组分具有改善和治疗胰 岛素抵抗的作用， 可以制备成相应的剂型进行预防或治疗胰岛素抵抗。 说 明 书 CN 103202897 B 4 3/11 页 5 附图说明 0020 图 1 为仙鹤草黄酮组分 （FC） 的 HPLC 色谱图 ： 0021。

19、 1、 牡荆苷2、 异牡荆苷3、 金丝桃苷4、 木犀草素-7-O-葡萄糖苷5、 槲皮苷8、 槲皮素 9、 银椴苷 10、 木犀草素 11、 芦丁 12、 芹菜素 13、 山奈酚 15、 花旗松素 16、 儿茶素化合物 6、 7、 14- 待定 ； 0022 图 2 为仙鹤草三萜组分 （TC） 的 HPLC 色谱图 ： 4 号化合物 ： 4- 羟基熊果酸， 6 号化 合物 ： 马斯里酸， 7 号化合物 ： 科罗羧酸， 9 号化合物 ： 齐墩果酸， 10 号化合物 ： 熊果酸， 化合 物 1、 2、 3、 5、 8 待定 ； 0023 图 3 为浓度梯度仙鹤草黄酮组分 （FC） 处理 3T3-L1。

20、 前脂肪细胞诱导分化第 7 天显 微镜图 （x200） ； 0024 图 4 浓度梯度仙鹤草三萜组分 （TC） 处理 3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化第 7 天显微 镜图 （x200） ； 0025 图 5 浓度梯度仙鹤草黄酮组分 （FC） 处理 3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化第 7 天油红 染色图 （x200） ； 0026 图 6 浓度梯度仙鹤草三萜组分 （TC） 处理 3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化第 7 天油红 染色图 （x200） ； 0027 图 7 仙鹤草两个活性组分以及两个组分的不同配比组分对前脂肪细胞分化过程 中三酰甘油积累的影响 ； 0028 图 8 仙鹤草黄酮组分 （。

21、FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 对前脂肪细胞分化主要转录因 子的基因表达的调控 ； 0029 图 9 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 不同配比组分对前脂肪细胞分 化主要转录因子基因表达的调控 ； 0030 图 10 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 对前脂肪细胞分化 AP2 表达的 调控 ； 0031 图 11 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 不同配比组分对前脂肪细胞 AP2 表达的调控。 具体实施方式 0032 实施例一 0033 a. 取仙鹤草全草 1.0kg, 在温度为 110下干燥至恒重并粉碎至 40 目， 然后加入 。

22、95% 乙醇在温度为 90回流提取 3 次后过滤， 每次提取 2 小时， 滤过， 收集滤液和滤渣， 将收 集的滤液减压浓缩制得浸膏 140g ； 0034 b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小 时后过滤并收集滤液， 将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱 （样品 ： 硅胶 =1 ： 30） ， 依次用乙酸乙 酯 : 石油醚 =1:1， 5:1 及纯乙酸乙酯洗脱， 各洗脱 5 个柱体积， 分别收集得洗脱液 （） ， 洗脱 液 （） ， 洗脱液 （） ； 0035 c. 将洗脱液 （） 和洗脱液 （） 溶于体积比为氯仿 ： 甲醇 =1:1 的混合液， 上 LH-20 。

23、凝胶柱， 经薄层层析法检测分析， 得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分 ； 说 明 书 CN 103202897 B 5 4/11 页 6 0036 d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次， 每次1.5h， 提取液浓缩后用60% 的乙醇分散溶解， 调节PH为5.0， 然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止， 过滤 除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白 及多糖， 然后过滤并将滤液浓缩， 制得浸膏 ； 将该浸膏溶于 80% 的甲醇， 上 LH-20 凝胶柱， 经 薄层层析检测分析， 得到黄酮组分。 0037 e. 合并步骤 c 和步骤 d 中。

24、的黄酮组分。 0038 分光光度法测得仙鹤草黄酮组分 （FC） 的总黄酮含量为 316.536.37mg/g， 仙鹤 草三萜组分 （TC） 的总三萜含量为 415.965.15mg/g。 0039 将制得的仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 以质量比为 4:1 常规制粒， 制成胶囊、 片剂或颗粒剂等。 0040 实施例二 0041 a. 取仙鹤草全草 1.0kg, 在温度为 105下干燥至恒重并粉碎至 35 目， 然后加入 95% 乙醇在温度为 85回流提取 3 次后过滤， 每次提取 2 小时， 滤过， 收集滤液和滤渣， 将收 集的滤液减压浓缩制得浸膏 ； 0042 b. 将。

25、步骤 a 中的浸膏用 95% 乙醇分散溶解后加入 5% 浸膏重量的活性炭回流 2 小 时后过滤并收集滤液， 将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱 （样品 ： 硅胶 =1 ： 30） ， 依次用乙酸乙 酯 : 石油醚 =1:1， 5:1 及纯乙酸乙酯洗脱， 各洗脱 5 个柱体积， 分别收集得洗脱液 （） ， 洗脱 液 （） ， 洗脱液 （） ； 0043 c. 将洗脱液 （） 和洗脱液 （） 溶于体积比为氯仿 ： 甲醇 =1:1 的混合液， 上 LH-20 凝胶柱， 经薄层层析法检测分析， 得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分 ； 0044 d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次， 每次1.5h， 提取。

26、液浓缩后用60% 的乙醇分散溶解， 调节PH为5.0， 然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止， 过滤 除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白 及多糖， 然后过滤并将滤液浓缩， 制得浸膏 ； 将该浸膏溶于 80% 的甲醇， 上 LH-20 凝胶柱， 经 薄层层析检测分析， 得到黄酮组分。 0045 e. 合并步骤 c 和步骤 d 中的黄酮组分。 0046 分光光度法测得仙鹤草黄酮组分 （FC） 的总黄酮含量为 316.536.37mg/g， 仙鹤 草三萜组分 （TC） 的总三萜含量为 415.965.15mg/g。 0047 将制得的仙鹤草。

27、黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 以质量比为 3:2 常规制粒， 制成胶囊、 片剂、 颗粒剂等。 0048 实施例三 0049 a. 取仙鹤草全草 1.0kg, 在温度为 115下干燥至恒重并粉碎至 45 目， 然后加入 95% 乙醇在温度为 90回流提取 3 次后过滤， 每次提取 2 小时， 滤过， 收集滤液和滤渣， 将收 集的滤液减压浓缩制得浸膏 ； 0050 b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入15%浸膏重量的活性炭回流2小 时后过滤并收集滤液， 将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱 （样品 ： 硅胶 =1 ： 30） ， 依次用乙酸乙 酯 : 石油醚 =1:1， 5:1。

28、 及纯乙酸乙酯洗脱， 各洗脱 5 个柱体积， 分别收集得洗脱液 （） ， 洗脱 液 （） ， 洗脱液 （） ； 0051 c. 将洗脱液 （） 和洗脱液 （） 溶于体积比为氯仿 ： 甲醇 =1:1 的混合液， 上 LH-20 说 明 书 CN 103202897 B 6 5/11 页 7 凝胶柱， 经薄层层析法检测分析， 得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分 ； 0052 d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次， 每次1.5h， 提取液浓缩后用60% 的乙醇分散溶解， 调节PH为5.0， 然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止， 过滤 除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85。

29、%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白 及多糖， 然后过滤并将滤液浓缩， 制得浸膏 ； 将该浸膏溶于 80% 的甲醇， 上 LH-20 凝胶柱， 经 薄层层析检测分析， 得到黄酮组分。 0053 e. 合并步骤 c 和步骤 d 中的黄酮组分。 0054 分光光度法测得仙鹤草黄酮组分 （FC） 的总黄酮含量为 316.536.37mg/g， 仙鹤 草三萜组分 （TC） 的总三萜含量为 415.965.15mg/g。 0055 将制得的仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 以质量比为 2:3 常规制粒， 制成胶囊或片剂等。 0056 实施例四 0057 a. 取仙鹤草全草 1.0kg,。

30、 在温度为 110下干燥至恒重并粉碎至 45 目， 然后加入 95% 乙醇在温度为 85回流提取 3 次后过滤， 每次提取 2 小时， 滤过， 收集滤液和滤渣， 将收 集的滤液减压浓缩制得浸膏 ； 0058 b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小 时后过滤并收集滤液， 将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱 （样品 ： 硅胶 =1 ： 30） ， 依次用乙酸乙 酯 : 石油醚 =1:1， 5:1 及纯乙酸乙酯洗脱， 各洗脱 5 个柱体积， 分别收集得洗脱液 （） ， 洗脱 液 （） ， 洗脱液 （） ； 0059 c. 将洗脱液 （） 和洗脱液 （） 溶于体积比为氯。

31、仿 ： 甲醇 =1:1 的混合液， 上 LH-20 凝胶柱， 经薄层层析法检测分析， 得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分 ； 0060 d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次， 每次1.5h， 提取液浓缩后用60% 的乙醇分散溶解， 调节PH为5.0， 然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止， 过滤 除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白 及多糖， 然后过滤并将滤液浓缩， 制得浸膏 ； 将该浸膏溶于 80% 的甲醇， 上 LH-20 凝胶柱， 经 薄层层析检测分析， 得到黄酮组分。 0061 e. 合并步骤 c 和步骤 d 中的黄酮组分。。

32、 0062 分光光度法测得仙鹤草黄酮组分 （FC） 的总黄酮含量为 316.536.37mg/g， 仙鹤 草三萜组分 （TC） 的总三萜含量为 415.965.15mg/g。 0063 将制得的仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 以质量比为 1:4 常规制粒， 制成胶囊或剂等。 0064 实施例五 0065 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和三萜组分 (TC) 的 HPLC 物质表征 0066 1. 实验材料方法 0067 1.1 试剂与仪器 0068 1.1.1 试剂 0069 对照品 ： 槲皮苷、 熊果酸、 山奈酚、 银椴苷、 槲皮素、 木犀草素、 芹菜素、 木犀草苷、 杜荆苷。

33、、 异杜荆苷、 花旗松素、 芦丁、 科罗羧酸、 齐墩果酸、 4- 羟基熊果酸和马斯里酸购自中 检所 说 明 书 CN 103202897 B 7 6/11 页 8 0070 乙腈、 甲醇为进口色谱纯 0071 其它试剂均为国产分析纯 0072 1.1.2 仪器 0073 精密电子天平 FA2004 型， 上海精密科学仪器有限公司 0074 高效液相色谱仪 Agilent1200， 安捷伦科技有限公司 0075 1.1.3 样品及对照品溶液的配制 0076 精确称取仙鹤草黄酮组分 (FC)10.0mg， 甲醇溶解定溶于 10mL 容量瓶， 待测。 0077 精确称取仙鹤草三萜组分 (FC)10.。

34、0mg， 甲醇溶解定溶于 10mL 容量瓶， 待测。 0078 槲皮苷、 熊果酸、 山奈酚、 银椴苷、 槲皮素、 木犀草素、 芹菜素、 木犀草苷、 杜荆苷、 异杜荆苷、 花旗松素、 芦丁、 科罗羧酸、 齐墩果酸、 4- 羟基熊果酸和马斯里酸对照品各自用甲 醇溶解配制成 0.5mg/mL 的溶液待用。 0079 1.2 方法 0080 1.2.1 仙鹤草黄酮组分的 HPLC 物质表征 0081 色谱柱 ： Welch Materials Ultimate XB-C184.6x250mm， 5m ； 流动相 ： 流动相 A 为 0.1% 磷酸水溶液， 流动相 B ： 乙腈 ； 检测波长 ： 350。

35、nm， 柱温 ： 35， 流速 ： 1.0mL/min， 进样 量 ： 20L 0082 梯度洗脱条件如表 1 ： 0083 表 1 仙鹤草黄酮组分 （FC） 的 HPLC 流动相梯度表 0084 0085 1.2.2 仙鹤草三萜组分的 HPLC 物质表征 0086 色谱柱 ： Welch Materials Ultimate XB-C184.6x250mm， 5m 0087 流动相 ： 流动相 A 为 0.1% 磷酸水溶液， 流动相 B 为乙腈 : 甲醇 =2:1 0088 检测波长 ： 210nm， 柱温 ： 30， 流速 ： 1.0mL/min， 进样量 ： 20L 0089 梯度洗脱条。

36、件如表 2 ： 0090 表 2 仙鹤草三萜组分 （TC） 的 HPLC 流动相梯度表 0091 说 明 书 CN 103202897 B 8 7/11 页 9 0092 1.3 结果与分析 0093 仙鹤草黄酮组分 （FC） 的 HPLC 色谱图见图 1。通过对照品添加法确定仙鹤草黄酮 组分 （FC） 主要含有牡荆苷、 异牡荆苷、 金丝桃苷、 槲皮苷、 槲皮素、 银椴苷、 木犀草素、 芦丁、 芹菜素、 山奈酚、 花旗松素、 儿茶素和木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷。 0094 仙鹤草三萜组分 （TC） 的 HPLC 色谱图见图 2， 通过对照品添加法确定仙鹤草 TC 主 要含有熊果酸、 4- 。

37、羟基熊果酸、 科罗羧酸、 马斯里酸和齐墩果酸。 0095 实施例六 0096 仙鹤草中活性成分黄酮组分 （FC） 和三萜组分 （TC） 以及二者不同配比对脂肪细胞 分化的促进作用 0097 1、 实验材料与方法 0098 1.1 试剂与仪器 0099 1.1.1试剂DMEM高糖培养基， 胎牛血清， 小牛血清， 双抗， 胰酶， Hyclone公司 ； 油红 O， Sigma 公司 ； 地塞米松， IBMX， 胰岛素， sigma 公司 ； Trizol， invitrogen 公司 ； cDNA 转录 试剂盒， Takara 公司 ； DEPC 去酶水， 碧云天公司 ； Bio-Rad SYBg。

38、reen， Bio-Rad 荧光定量 PCR 管 / 管盖， 美国伯乐公司 ； MTT， 购自于 sigma 公司 ； 细胞培养板 （6 孔， 12 孔， 96 孔） ， Hyclone 公司 0100 1.1.2 仪器精密电子天平 FA2004 型， 上海精密科学仪器有限公司 ； CO2 细胞培养 箱， 美国 THERMO 公司 ； 酶标仪 Model680， Bio-Rad， USA ； 荧光定量 PCR 仪 CYMMZ-EPXFY-052， Bio-Rad， USA ； Eppendorf 冷冻离心机 -5417R， 基因有限公司 ； RNA/DNA 紫外分光光度计， 美 国 beckm。

39、an 公司 ； 正置显微镜 CYMML-EPTXCJ-004， OLYMPUS 0101 1.2、 3T3-L1 前脂肪细胞分化诱导和药物处理 0102 实验组为仙鹤草样品不同浓度处理 （每个样品设置 1、 5、 25 和 125g/mL 四个梯 度） ， 阳性对照组为吡格列酮 （10M） ， 空白对照组为空白溶剂。将融合到 90% 的细胞， 接种 到 6 孔板或者 12 孔板中， 用含有双抗的 10% 小牛血清的 DMEM 高糖培养基进行培养， 每隔一 天换一次培养基， 培养2天， 待细胞100%的融合 ； 第一期诱导分化 ： 换MDI诱导液， 加入不同 浓度的仙鹤草的样品和阳性对照溶液， 。

40、培养 2 天 ； 第二期诱导分化 ： 弃培养液， 换上胰岛素 诱导液， 加入不同浓度的仙鹤草的样品和阳性对照溶液， 继续培养 2 天 ； 第三期诱导分化 ： 弃培养液， 换上含有 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养， 同时加入不同浓度的仙鹤草的样品和 阳性对照溶液， 继续培养 2-4 天， 等 3T3-L1 前脂肪细胞分化成熟， 观察细胞形态。 说 明 书 CN 103202897 B 9 8/11 页 10 0103 1.3、 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 对细胞分化形态的影响 0104 将 6 孔板中分化第 7 天的 3T3-L1 前脂肪细胞， 小心吸取上清培养。

41、基， 然后弃去。 取 1mLPBS， 沿培养板孔壁注入， 用手轻轻摇晃静置 5min， 然后吸取 PBS， 用 PBS 溶液洗 3 次 ； 清洗干净培养基和药物之后， 用 10% 的甲醛固定液 （24 孔板每孔 1mL） 固定细胞 30-60min ； PBS洗净后将细胞晾干30min ； 加入配置好的油红O工作液 （油红储存液 ： 蒸馏水=3:2） 每孔 0.5mL， 室温下染色 40-60min（避光， 密封） 油红 O 染液， 用 60% 异丙醇洗细胞 2 次去除多余 的染料再用三蒸水洗涤 3 次。用甘油或者甘油明胶封片 ； 倒置显微镜下观察结果， 拍照。 0105 1.4、 油红染色法。

42、观察甘油三酯的沉积程度 0106 将种有细胞的24孔板， 进行诱导培养， 第7天取出进行油红染色 ； 用60%异丙醇洗 细胞2次去除多余染料， 用三蒸水洗涤3次， 加入100%异丙醇1mL， 枪头反复吹打， 然后在振 荡仪上振荡 20min ； 用酶标仪， 在 520nm 处测定吸光值。 0107 2、 结果 0108 2.1、 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 对细胞分化形态的影响 0109 如图 3 和图 4， 未诱导分化的 3T3-L1 前脂肪细胞为长梭状的状态， 当细胞诱导分 化 7 天后， 可以看出分化成熟脂肪细胞为圆形， 同时有明显的脂质累积在胞内， 并且在胞内。

43、 有明显的 “指环脂滴” 富集 ； 从细胞的形态比较可以看出， 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三 萜组分 （TC） 都有明显的促进细胞分化的作用， 并且以剂量依赖性的方式促进前脂肪细胞的 分化 ； 且从脂肪滴的大小来比较， 仙鹤草黄酮组分 （FC） 处理下的较仙鹤草三萜组分 （TC） 和 阳性对照的小。 0110 2.2、 油红染色法观察甘油三酯的沉积程度 0111 通过油红染色图 5 和 6 可以得知 ： 随着 3T3-L1 前脂肪细胞的分化， 胞内的三酰 甘油含量逐渐累积， 脂滴的大小和数量与空白组处理有明显的差异 ； 仙鹤草黄酮组分 （FC） 和仙鹤草三萜组分 （TC） 都呈现出以剂。

44、量依赖性的方式促进三酰甘油的生成。如图 7， 其 中， * 为与空白对照相比具有显著性差异 (p0.5)， * 为与空白对照相比具有极显著性差 异 (p0.1) ； A 为黄酮组分的不同浓度的药物处理后三酰甘油含量作用， B 为三萜组分的 不同浓度梯度的药物处理后的三酰甘油含量作用， C 图为黄酮组分和三萜组分的不同配 比的组分在 50g/mL 时对三酰甘油含量的作用 ： I 为 FC:TC=1:4， II 为 FC:TC=1:1， III 为 FC:TC=4:1。A 显示仙鹤草黄酮组分 （FC）具促三酰甘油含量的作用， 5-25g/mL 浓度 范围， 与空白对照具显著性差异， 达 125g/。

45、mL 时， 具有极显著性差异， 但不如阳性对照 ； B 显示仙鹤草三萜组分 （TC） 具促进三酰甘油累积的作用， 5g/mL 时， 与空白对照相比具有 显著性差异， 达 25-125g/mL 时， 具极显著性差异， 但均不如阳性对照的作用 ； C 表明， 当 FC:TC=4:1 时与空白对照相比具有显著促进作用， 当 FC:TC=1:4 具极显著性差异， TC 比 FC 具有更强的促进三酰甘油沉积的作用。 0112 3、 结论 0113 对 3T3-L1 前脂肪细胞用经典的鸡尾酒诱导法进行诱导分化， 观察到仙鹤草的 黄酮组分 （FC） 和三萜组分 （TC） 两个活性组分同步药物处理诱导分化第 。

46、7 天的细胞形态， 可以观察到细胞由长梭状变成圆形， 在胞内可以观察到明显的 “指环脂滴” ， 说明仙鹤草活 性组分 FC 和 TC 都有明显促进细胞分化的作用。通过油红染色图结果和三酰甘油含量测 定显示， FC 和 TC 均以浓度依赖性的方式促进脂肪细胞内的三酰甘油含量增加 ； 同时二者三 说 明 书 CN 103202897 B 10 9/11 页 11 个不同配比的复合组分的药物处理后数据分析得知， TC 比 FC 对三酰甘油更强的促进作用。 以上实验说明仙鹤草活性组分 FC 和 TC 对前脂肪细胞的分化具有促进作用。 0114 实施例七 0115 仙鹤草中活性组分对脂肪细胞分化及脂肪代。

47、谢相关基因表达的调控作用 0116 1、 实验材料与方法 0117 1.1、 试剂与仪器 0118 1.1.1 试剂同实施例一 0119 1.1.2 仪器同实施例一 0120 1.2、 3T3-L1 前脂肪细胞的 mRNA 的提取、 RT-PCR 和 real-time PCR 0121 取诱导分化第 7 天的细胞冰浴， PBS 洗 2 遍。加入 0.9mL Trizol 裂解液。将各 孔裂解液分别收集至 1.5mL EP 管中。向每个 EP 管中均加入 0.2mL 氯仿， 振荡 15S， 待为乳 白状， 静置 3min。4 12000g 转离心 15min。吸取上清， 加 0.5mL 异丙醇。

48、， 混匀， 静置 10min。 4 12000g 转离心 10min。弃上清， 加 75% 的乙醇 1mL， 4 7500g 转离心 5min。室温干燥， 加 25LDEPC 水溶解沉淀。紫外分光法检测浓度和纯度 RNA 浓度测定。取 7L 混合转录 试剂， 按 V=1/C（C 表示 RNA 浓度） 加入 RNA 提取液， 加入 DEPC 水使总体积为 20L。进行 逆转录， cDNA 于 -20保存。取 2L 稀释 10 倍的 cDNA 溶液， 与 8L 混合转录液 （上下游 引物 1.4L/ 孔， SYB greenL/ 孔， DEPC 水 L/ 孔） 混匀。按表 4 反应条件进行 0122 表 3 引物序列 0123 0124 表 4 荧光定量 PCR 的 Protocol 说 明 书 CN 103202897 B 11 10/11 页 12 0125 0126 2、 结果 0127 2.1、 3T3-L1 前脂肪细胞的 mRNA 的提取、 RT-PCR 和 real-time PCR 0128 2.1.1、 前脂肪细胞的分化的主要转录因子 C/EBP-、 PPAR 和 ADD1/SREB。