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1、(10)申请公布号 CN 103263672 A (43)申请公布日 2013.08.28 CN 103263672 A *CN103263672A* (21)申请号 201310182062.4 (22)申请日 2013.05.13 A61K 47/34(2006.01) A61K 31/337(2006.01) A61K 9/14(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 杭州普施康生物科技有限公司 地址 310021 浙江省杭州市江干区笕丁路 485 号杭州普施康生物科技有限公司 (72)发明人 余波 王国营 张晓敏 周晨光 李剑光 (54) 发明名称 一。
2、种紫杉烷类药物纳米粒的制备方法及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种紫杉烷类药物纳米制剂的 制备方法。采用乳液扩散法制备的纳米粒包含紫 杉烷类药物、 共聚物载体材料和乳化剂。 将紫杉烷 类药物和共聚物载体材料溶于与水互溶的有机相 中， 然后滴加到溶有乳化剂的水与乙醇的混合溶 液中， 搅拌混合形成乳液， 除去有机溶剂、 固化后 形成纳米粒子。本发明制备的纳米粒粒径非常均 匀， 平均粒径在80120nm、 包封率高、 稳定性好， 且制备过程简单可控、 易于放大生产。本发明制 备的紫杉烷类药物纳米粒可应用于恶性肿瘤的治 疗， 具有明显的抑瘤效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书。
3、 8 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103263672 A CN 103263672 A *CN103263672A* 1/1 页 2 1. 一种紫杉烷类药物纳米制剂， 其特征在与 ： 所述制剂中包含紫杉烷类药物、 共聚物 载体材料和乳化剂。 2. 根据权利要求 1 所述的紫杉烷类药物纳米制剂， 其特征在于 ： 所述的紫杉烷类药物 为紫杉醇或多烯紫杉醇。 3. 根据权利要求 1 所述的紫杉烷类药物纳米制剂， 其特征在于 ： 所述共聚物载体材料 为聚乳酸、 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物或。
4、聚乙二醇 - 聚乳酸共聚物、 聚乙二醇 - 聚乳酸羟基乙 酸共聚物， 或者任意两者的混合物 ； 所述的共聚物与紫杉烷类药物的重量比例为 5 1 至 20 1。 4. 根据权利要求 1 所述的紫杉烷类药物纳米制剂， 其特征在于 ： 所述的乳化剂为水溶 性维生素 E(TPGS)、 聚乙二醇硬脂酸酯 15(HS15) 或者两者混合物。 5. 一种制备根据权利 1 至 4 中任一项所述的紫杉烷类药物纳米粒制剂的方法， 其特征 在于该方法包括以下步骤 ： i 将紫杉烷类药物和共聚物溶于有机溶剂中作为油相， 乳化剂溶于水与乙醇形成的共 溶剂相 ； ii 在剪切力作用下将油相采用加入到共溶剂相， 得到蓝色乳。
5、光的乳液 ； iii 去除有机溶剂。 6. 根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征在于 ： 有机溶剂为丙酮、 四氢呋喃中的一种 或混合物， 优选为丙酮。 7. 根据权利要求 1 至 5 所述的紫杉醇纳米粒制剂， 其特征在于 ： 所述的纳米粒制剂的 平均粒径在 80 120nm， 纳米粒的药物包封率为 80至 95。 8. 根据权利要求 1 所述的紫杉烷类药物纳米制剂， 其特征在于可进一步制成注射液、 冻干粉针、 混悬剂型注射液、 注射用片剂。 权 利 要 求 书 CN 103263672 A 2 1/8 页 3 一种紫杉烷类药物纳米粒的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明属药物制剂领。
6、域， 涉及包载难溶性抗肿瘤药物的聚合物纳米粒， 具体涉及 一种含紫杉烷类难溶性抗肿瘤药物的纳米粒的制备方法及应用。 背景技术 0002 紫杉烷类药物主要包括紫杉醇和多烯紫杉醇， 是目前临床上最有效的抗肿瘤药 物之一。紫杉醇 (paclitaxel) 从太平洋红豆杉树皮中分离得到的一种四环二萜类化合 物， 分子式为 C47H51O14N， 分子量为 853.9， 不溶于水。1992 年美国 FDA 批准上市， 其作用机 制是与细胞微管蛋白结合， 促进微管蛋白聚合， 以对抗解聚、 阻断有丝分裂， 从而抑制肿瘤 生长， 诱导肿瘤细胞凋亡。临床研究已经证实了紫杉醇在治疗多种实体肿瘤， 包括乳腺癌、 晚。
7、期卵巢癌、 肺癌、 脑部和颈部肿瘤以及急性白血病等方面， 都有显著的作用。多烯紫杉醇 (docetaxel)由欧洲红豆杉提取到的非细胞毒性前体化合物10-脱酰基浆果赤霉素II经半 合成得到， 1998年获美国FDA批准上市。 多烯紫杉醇的作用机理与紫杉醇相似， 但抗肿瘤活 性是紫杉醇的很多倍， 对乳腺癌、 非小细胞肺癌等癌症具有明显的治疗效果。 0003 紫杉烷类药物其水溶性较低 ( 约 1 10g/mL)， 因此临床上所使用的紫杉醇注 射液和多烯紫杉醇注射液均需要分别使用表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油 (Cremophor EL) 和 聚山梨醇 80( 吐温 80) 以及助溶剂乙醇来达到溶解药物的。
8、目的。现有的上市剂型为紫杉醇 注射剂 ( 商品名为 “泰素” )， 以聚羟乙基蓖麻油 (Cremophor EL) 乙醇 1 1 为溶剂， 浓度为 6mg/mL， 临床应用时用生理盐水或右旋糖苷稀释 5 20 倍， 一次静注 3h， 用药剂量 为135mg/m2。 聚氧乙烯蓖麻油已被证明会导致严重的过敏反应、 神经毒性、 肾毒性和低血压 等。此外， 聚氧 乙烯蓖麻油还可在血液中形成微小颗粒包裹紫杉醇分子， 影响药物分子向 组织间扩散， 降低抗肿瘤效果。目前上市的多烯紫杉醇注射剂 ( 商品名为 “泰索帝” )， 采用 吐温80与无水乙醇的复合溶媒制备而成， 吐温80的使用易引发病人严重的过敏反应。
9、， 在化 疗前， 病人往往需预先服用或注射抗过敏药物 ( 皮质类激素和 H2 受体拮抗剂 )， 在输液过 程中， 还需连接微孔过滤器以防止药物在稀释过程中产生的结晶微粒进入病人血液循环系 统， 这些均给临床应用带来极大的风险和不便。 0004 为消除现有紫杉烷类药物剂型的不良反应， 增加紫杉烷药物的溶解度、 稳定性， 降 低毒性， 国内外研究者展开了大量紫杉烷类药物新剂型的研究， 包括环糊精包合物、 胶束、 脂质体、 白蛋白等。 这些新剂型虽然从一定程度上改善了现有制剂的不足， 但均存在各自的 缺陷， 如 ： 环糊精本身存在极高的肾毒性 ； 脂质体制剂包封率低、 不稳定、 易泄露等 ； 白蛋白。
10、 紫杉醇制备工艺复杂等。 这些难以克服的缺陷限制了上述新型制剂的产业化发展和试剂临 床应用。 0005 近年来使用聚合物材料制备纳米粒作为抗癌药物载体受到人们广泛的关注。 聚合 物载体具有缓慢释放药物， 降低药物毒性， 促进药物在肿瘤部位吸收等作用。 用于制备纳米 粒制剂的辅料多为高分子可降解聚合物， 聚酯是应用最广的生物可降解高分子材料之一， 常用的有聚乳酸 (PLA)、 聚羟基乙酸 (PGA)、 聚乳酸 - 聚羟基乙酸共聚物 (PLGA) 和聚 - 己内 说 明 书 CN 103263672 A 3 2/8 页 4 酯(PCL)等。 其中PLGA无毒、 无刺激性， 具有良好的生物相容性， 。
11、可生物分解和吸收， 其降解 产物能参与人体代谢， 因此 PLGA 已被美国 FDA 批准广泛应用于制药、 医药工程材料中。通 过调节 PLGA 中乳酸和乙醇酸的比例及 PLGA 的分子量， 可以得到具有不同降解速率的聚合 物， 从而满足具有不同体外释放性质的纳米颗粒的需求。 0006 长循环对于纳米粒长效的起作用有很重要的意义。由于 PLGA 纳米粒易于被 巨噬细胞识别和吞噬， 在体内循环时间较短， 往往不能发挥足够的药效， 使用聚乙二醇 (polyethylene glycol， PEG) 修饰使纳米粒逃避体内的调理作用来增加纳米粒体内的循 环时间， 成为近年来的制备长循环纳米粒的一个热点。。
12、纳米粒的表面性质对纳米粒的长循 环起着非常重要的作用， 表面要有足够的亲水性才能更好的避免人体内的调理素作用将纳 米粒从血液中清除。长循环纳米粒的表面修饰一般是在普通纳米粒的表面通过物理吸附 或者化学键接一些亲水性高分子材料得到， 常见的亲水性高分子材料有聚氧乙烯 (PEO)、 聚 维酮 (PVP)、 甲氧基聚乙二醇 (mPEG)、 聚乙二醇 (PEG)、 三梨酯 80、 泊洛沙姆、 水溶性生育酚 (TPGS)等， 这些材料均可达到提高长循环的目的。 与普通的纳米粒相比， 长循环纳米粒在血 液循环中的半衰期明显提高， 因此又称为 “隐形” 纳米粒。 0007 聚乙二醇 1000 维生素 E 琥。
13、珀酸酯 (TPGS) 是维生素 E 的水溶性衍生物， 由维生素 E 琥珀酸酯 (VES) 的羧基与聚乙二醇 (PEG)1000 酯化而成， 相对分子质量约为 1513， 已载入 美国药典 。TPGS 最早由美国 Eastman 公司生产并上市， 在国外现已广泛应用于制剂研究 中， 作为增溶剂、 吸收促进剂、 乳化剂、 增塑剂以及水难溶性和脂溶性药物传递系统的载体， 如固体分散体、 眼部给药的载体、 鼻腔内给药的载体等。另外 TPGS 由于 PEG 链段的亲水作 用， 也常被用作 “隐形” 纳米粒的表面修饰材料。 0008 制备纳米粒的常用的方法有乳化法和纳米沉淀法。近年来发展了很多改进的 乳化。
14、法和纳米沉淀法， 在制备工艺上有了很大的改进， 如我们公开一种反向滴加水相到 油相的方式制备长循环紫杉醇或多烯紫杉醇纳米粒制剂的方法 (CN 102772368 和 CN 102772369)。 总的来说， 目前就制备长循环紫杉烷纳米粒这方面的技术还不成熟， 尚没有一 套成熟的制备工艺制备出理想的长循环纳米粒， 并最终实现规模化扩大生产。 发明内容 0009 针对现有技术中存在的上述不足， 本发明所要解决的技术问题在于提供一种紫杉 烷类药物纳米粒制剂的制备方法， 通过本方法制备的紫杉烷类纳米制剂可长循环、 毒副作 用低、 抗肿瘤疗效高、 可静脉注射。 0010 本发明公开了一种紫杉烷类药物的纳。
15、米粒。 采用乳液扩散法制备的纳米粒包含紫 杉烷类药物、 共聚物载体材料和乳化剂。将紫杉烷类药物和共聚物载体材料溶于与水互溶 的有机相中， 然后滴加到溶有乳化剂的水与乙醇的混合溶液中， 搅拌混合形成乳液， 除去有 机溶剂、 固化后形成纳米粒子。本发明制备的长循环紫杉烷类药物纳米粒可应用于恶性肿 瘤的治疗， 具有明显的抑瘤效果。 0011 本发明所要解决的技术问题在于提供一种全新的聚合物纳米粒制备方法， 由于乳 液扩散法中双有机溶剂的存在提高了有机溶剂在水相的扩散速率， 且方法简便， 制备出的 纳米粒粒径分布非常均匀。 0012 本发明目的是通过如下技术方案实现的 ： 说 明 书 CN 10326。
16、3672 A 4 3/8 页 5 0013 一种紫杉烷类药物纳米粒制剂， 制剂中包含紫杉烷类药物、 共聚物和乳化剂。 0014 其中， 所述的紫杉烷类药物为紫杉醇或多烯紫杉醇 ； 所述共聚物为聚乳酸 (PLA)、 聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 或聚乙二醇 - 聚乳酸共聚物 (PEG-PLA)、 聚乙二醇 - 聚乳 酸羟基乙酸共聚物 (PEG-PLGA)， 或者任意两者的混合物， 所述的共聚物与紫杉醇的重量比 例为 5 1 至 20 1， 特别优选为 10 1。 0015 所述的乳化剂为水溶性维生素 E(TPGS) 或聚乙二醇硬脂酸酯 15(HS15) 或者两者 的混合物， 优选为 。
17、TPGS。 0016 本发明利用 TPGS 或者 HS15 作为乳化剂形成一层保护纳米粒的壳层材料， 并且我 们在工艺上另辟新路， 采用含有双有机溶剂的乳液扩散法制备了粒径均 匀、 包封率高、 载 药量高的新型紫杉醇或多烯紫杉醇纳米粒， 粒径控制在 80 120 纳米， 纳米粒的药物包封 率可达到 80至 95。 0017 本发明还提供了上述紫杉烷类纳米粒制剂的制备方法， 包括如下步骤 ： 0018 i 将紫杉烷类药物和共聚物溶于有机溶剂中作为油相， 乳溶剂溶于水和乙醇的共 溶剂中作为水相 ； 0019 ii 在剪切力作用下将油相滴入水与乙醇的共溶剂中， 得到蓝色乳光的乳液 ； 0020 ii。
18、i 去除有机溶剂。 0021 其中， 所述有机溶剂为有机溶剂为丙酮、 四氢呋喃中的一种或混合物， 优选为丙 酮， 油相和水相的体积比例为 1 1 至 1 3。 0022 传统的乳液 - 溶剂挥发法中， 乳液滴的形成和溶剂的挥发需极大的借助外力的作 用， 如超声、 均质化及负压的作用， 外力条件的不均匀性很大程度上会导致粒径分布的不均 匀。本发明中采用了乳液扩散法， 是对传统乳液 - 溶剂挥发法的改进， 使用了与水互溶的溶 剂， 如丙酮等。 制备时首先将紫杉烷类药物与共聚物溶于水互溶的溶剂中， 然后加入到含乳 化剂如 TPGS 溶于含乙醇与水 ( 比例 1 1) 的混合溶液中， 形成乳液。乳化剂。
19、吸附在乳液 液滴表面， 可以防止颗粒间的聚集发生。 水互溶性溶剂如丙酮亲和于共聚物材料， 而乙醇亲 和于乳化剂， 由于丙酮溶剂自发的扩散行为， 在制备过程中， 亲乳化剂的乙醇首先从乳液滴 中向外水相扩散， 使得乳液内部表面张力降低， 粒径急速减小， 随后亲共聚物的丙酮溶剂进 一步向外水相扩散， 由于丙酮对乳化剂亲和性不强， 其浓度的增加使得乳化剂在乳液滴表 面发生絮凝， 从而吸附在纳米粒表面形成保护层。两种不同亲和势溶剂的联用使用有效地 改进了乳液的分散效果， 使得乳液滴可自发形成并缩小， 仅需平稳的搅拌可获得粒径较小、 分布均匀的聚合物载药纳米粒， 也提高了包裹效率， 所以乳液 - 扩散法具。
20、有工业上的应用 的前景。 0023 本发明公开的紫杉醇纳米粒， 因其粒径控制在 80-120nm， 可用于静脉注射， 用于修 饰纳米粒的表面活性剂为 TPGS 或 HS15， 其中 TPGS 是维生素 E 的水溶性衍生物， 已经广泛 应用于食品和医药行业， 对人体的安全性高。TPGS 或 HS15 的 PEG 链段为纳米粒的长循环 提供了条件， 可以增加纳米粒表面的空间位阻， 纳米粒彼此之间接触变少， 也就避免了纳米 粒之间的团聚作用， 增加了纳米粒在循环过程中的稳定性。另据报道 TPGS 对抑制肿瘤细胞 的耐药性也具有一定的作用， 其独特的分子结构可以抑制药物的泵出效应， TPGS 对 P-。
21、 糖蛋 白有抑制作用。HS15 是一种新型的高性能、 极低毒性的增溶剂或乳化剂， 其优越性体现在 ： 1)高增溶乳化能力 ； 2)低组胺释放效应 ； 3)低溶血作用 ； 此外HS15还具有较高的生理耐受 说 明 书 CN 103263672 A 5 4/8 页 6 性、 较低的粘度， 并且可以采用蒸汽灭菌法， 无需昂贵的无菌制造工艺， 目前 HS15 已收入德 国药典， 在美国和加拿大己通过用于人体注射的审定。 0024 本发明的紫杉烷药物的纳米制剂， 将紫杉醇类药物包裹于在共聚物中， 很好地解 决了现有紫杉烷类药物因溶解度低而只能使用有机溶剂、 聚氧乙烯蓖麻油、 吐温 80 等不安 全物质的。
22、问题。 此外， 本发明的紫杉烷类药物纳米粒组合物在生产、 贮存和运输及给药过程 中能保持良好的稳定性， 而在进入体内后该纳米粒能迅速释放药物而产生药效。本发明的 纳米粒组合物成本低， 稳定性高， 安全性好， 符合临床用药的要求， 符合大规模生产的要求， 具备良好的市场前景。 0025 本发明还对纳米粒的抗肿瘤性能进行了考察， 以小鼠皮下接瘤为模型， 比较了在 相同剂量下本实验所制备的紫杉醇纳米粒与市场销售抗肿瘤制剂泰素 (Taxol) 之间的抑 瘤效果的差异。 紫杉醇纳米粒给药后， 纳米级别的紫杉醇与肿瘤组织接触并向其深处渗透， 对肿瘤组织进行特异性杀伤， 由于EPR效应粒径在50-200nm。
23、之间的纳米粒材料容易在肿瘤 部位聚集， 起到药物累积的效果， 可以 对肿瘤更好的杀伤， 由于 TPGS 等壳层的存在使得纳 米粒可以缓慢的释放药物， 起到很好的缓释效果。 附图说明 0026 图 1 为包载紫杉醇的纳米粒子的粒径分布图 0027 图 2 为包载紫杉醇的纳米粒子的扫描电镜图 ： (A) 低倍放大图 ； (B) 高倍放大图 0028 图 3 为包载紫杉醇的纳米粒子的体外释放曲线 0029 图 4 为包载紫杉醇的纳米粒子的体外细胞株的抑制率的影响 0030 图 5 为包载紫杉醇的纳米粒子的药物动力学曲线 0031 图 6 为包载荧光探针的纳米粒子在 A549 裸小鼠移植瘤模型中体内脏。
24、器分布的影 响 ： (A) 小鼠全身图 ； (B) 主要脏器分布图 ； (C) 纳米粒在主要脏器的荧光统计图 ； 0032 图 7 为包载紫杉醇的纳米粒子对人 A549 裸小鼠移植瘤肿瘤体积影响 0033 图 8 为包载紫杉醇的纳米粒子对人移植 A549 瘤的裸小鼠体重变化影响 具体实施方式 0034 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 以下实施例将有助于本领域 技术人员经一步理解本发明， 但不以任何形式限制本发明。 0035 实施实例 1 ： TPGS 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0036 80mg PLGA(50 50， 分子量 45000) 和 8mg 紫杉醇溶于 20mL 丙酮。
25、溶剂中作为油 相， 240mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相 以 1mL/min 的速度滴入含 TPGS 的混合溶液， 300r/min 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加完成后， 将纳米乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转除 去有机溶剂， 得到纳米粒。激光 动态散射仪测得的平均粒径为 105.12.3nm， 粒径分布如图 1 所示， 粒径分布系数 PDI 为 0.0470.025， 纳米粒的包封率为 92.52.2。用透射电镜对制备的纳米粒进行形貌分 析， 图 2 说明本实施例制备的紫杉醇纳米颗粒粒径在 100nm 左右， 且分布非常均匀。。
26、 0037 实施实例 2 ： TPGS 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0038 80mg PLGA(50 50， 分子量 15000) 和 8mg 紫杉醇溶于 20mL 丙酮溶剂中作为油 说 明 书 CN 103263672 A 6 5/8 页 7 相， 240mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相以 1mL/min 的速度滴入含 TPGS 的混合溶液， 300r/min 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加 完成后， 将纳米乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转除去有机溶剂， 得到纳米粒。 激光动态散射 仪测试的平均粒径为 102.32.4nm， 粒径分。
27、布系数 PDI 为 0.0730.012， 纳米粒的包封率 为 85.22.4。 0039 实施实例 3 ： TPGS 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0040 80mg PLGA(50 50， 分子量 100000) 和 8mg 紫杉醇溶于 20mL 丙酮溶剂中作为油 相， 240mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相以 1mL/min 的速度滴入含 TPGS 的混合溶液， 300r/min 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加 完成后， 将纳米乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转除去有机溶剂， 得到纳米粒。 激光动态散射 仪测试的平均粒径为 109.1。
28、2.2nm， 粒径分布系数 PDI 为 0.0620.018， 纳米粒的包封率 为 86.42.1。 0041 实施实例 4 ： TPGS 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0042 100mg PEG5000-PLGA(50 50， 分子量 28000) 和 10mg 紫杉醇溶于 20mL 丙酮溶 剂中作为油相， 120mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶 液 ； 将油相以 1.5mL/min 的速度滴入混合溶液， 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加完成 后， 将纳米乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转除去有机溶剂， 得到 纳米粒。激光动态散射仪 测试的平均粒径为 。
29、112.12.5nm， 粒径分布系数 PDI 为 0.0920.032， 纳米粒的包封率为 81.54.2。 0043 实施实例 5 ： TPGS 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0044 50mg PEG5000-PLGA(50 50， 分子量 15000)、 50mg PLGA(50 50， 分子量 45000) 和 12mg 紫杉醇溶于 20mL 丙酮溶剂中作为油相， 240mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相以 1mL/min 的速度滴入混合溶液， 300r/min 低速 搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加完成后， 将乳剂转移到旋转蒸发仪真。
30、空旋转除去有机溶 剂， 得到纳米粒。激光动态散射仪测试的平均粒径为 106.14.2nm， 粒径分布系数 PDI 为 0.0920.045， 纳米粒的包封率为 84.23.8。 0045 实施实例 6 ： TPGS 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0046 100mg PLGA(50 50， 分子量 45000) 和 10mg 紫杉醇溶于 20mL 四氢呋喃溶剂中作 为油相， 240mgTPGS溶于40mL水与乙醇体积比例为11的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相 以 1mL/min 的速度滴入混合溶液， 300r/min 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加完成后， 将纳米乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转。
31、除去乙醇和四氢呋喃， 得到纳米粒。激光动态散射 仪测试的平均粒径为96.18.9nm， 粒径分布系数PDI为0.1050.037， 纳米粒的包封率为 87.14.5。 0047 实施实例 7 ： HS15 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0048 80mg PLGA(5050， 分子量45000)和8mg紫杉醇溶于20mL丙酮溶剂中作为油相， 240mgHS15 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相以 1mL/ min 的速度滴入混合溶液， 300r/min 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加完成后， 将乳剂 转移到旋转蒸发仪真空旋转或者经过溶液循环系统除去。
32、有机溶剂， 便得到纳米粒。激光动 态散射仪测试的平均粒径为104.52.6nm， 粒径分布系数PDI为0.0830.029， 纳米粒的 说 明 书 CN 103263672 A 7 6/8 页 8 包封率为 96.52.1。 0049 实施实例 8 ： TPGS 与 HS15 乳化紫杉醇纳米粒的制备 0050 160mg PLGA(50 50， 分子量 45000) 和 15mg 紫杉醇溶于 20mL 丙酮溶剂中作为油 相， 120mgTPGS和120mg HS15溶于40mL水与乙醇体积比例为11的共溶剂中形成混合溶 液 ； 将油相以 1mL/min 的速度滴入混合溶液， 300r/min 。
33、低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴 加完成后， 将乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转， 得到纳米粒。 激光动态散射仪测试的平均粒 径为121.74.3nm， 粒径分布系数PDI为0.0730.032， 纳米粒的包封率为81.15.2。 0051 实施实例 9 ： TPGS 乳化多烯紫杉醇纳米粒的制备 0052 40mg PLGA(50 50， 分子量 45000) 和 4mg 多烯紫杉醇溶于 20mL 丙酮溶剂中作 为油相， 240mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油 相以 1mL/min 的速度滴入混合溶液， 300r/min 低速搅拌下形成淡。
34、蓝色的纳米乳， 滴加完成 后， 将乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转除去有机溶剂， 便得到纳米粒。激光动态散射仪测 试的平均粒径为 104.42.1nm， 粒径分布系数 PDI 为 0.0980.026， 纳米粒的包封率为 94.52.2。 0053 实施实例 10 ： TPGS 乳化多烯紫杉醇纳米粒的制备 0054 80mg PEG5000-PLA(50 50， 分子量 45000) 和 8mg 紫杉醇溶于 20mL 丙酮溶剂中 作为油相， 120mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将 油相以用注射器以 10mL/min 的速度快速注入到混合溶液中。
35、， 500r/min 低速搅拌下形成淡 蓝色的纳米乳， 滴加完成后， 将乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转除去有机溶剂， 便得到纳米 粒。激光动态散射仪测试的平均粒径为 110.54.5nm， 粒径分布系数 PDI 为 0.120.031， 纳米粒的包封率为 85.33.2。实施实例 11 ： HS15 乳化多烯紫杉醇纳米粒的制备 0055 80mg PLGA 和 8mg 紫杉醇溶于 20m 丙酮溶剂中作为油相， 180mgHS15 溶于 40mL 水 与乙醇体积比例为 1 1 的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相以 1mL/min 的速度滴入混合溶 液， 300r/min 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米。
36、乳， 滴加完成后， 将乳剂转移到旋转蒸发仪真空 旋转除去有机溶剂， 得到纳米粒。 激光动态散射仪测试的平均粒径为145.13.2nm， 粒径分 布系数 PDI 为 0.0820.041， 纳米粒的包封率为 87.52.8。 0056 实施实例 12 ： TPGS 乳化多烯紫杉醇纳米粒的制备 0057 80mg PLGA和8mg紫杉醇溶于20mL四氢呋喃溶剂中作为油相， 80mgTPGS溶于40mL 水与乙醇体积比例为11的共溶剂中形成混合溶液 ； 将油相用注射器以10mL/min的速度 快速注入混合溶液， 500r/min 低速搅拌下形成淡蓝色的纳米乳， 滴加完成后， 将乳剂转移到 旋转蒸发仪。
37、真空旋转除去有机溶剂， 便得到长循环纳米粒。激光动态散射仪测试的平均粒 径为156.23.8nm， 粒径分布系数PDI为0.0750.024， 纳米粒的包封率为82.54.2。 0058 实施实例 13 ： 纳米粒包封率的测定 0059 采用液相高效色谱测紫杉醇的含量 ： 色谱柱 ： 安捷伦 C18 柱 ； 流动相 ： 乙腈水 (5050(vv) ； 检测波长227nm ； 流速1.0mL/min ； 进样量20L。 分别取浓度为0.05 50ug/mL 的紫杉醇或多烯紫杉醇标准品溶液， 按照色谱条件进行测试， 以峰面积对紫杉醇或 多烯紫杉醇浓度进行曲线拟合， 建立回归方程。 0060 将得到。
38、的纳米粒混悬液过 0.22um 的膜， 将过膜后的混悬液加入同等体积的乙腈 破乳， 将破乳得到的溶液按照色谱条件测定紫杉醇或多烯紫杉醇的含量。同时取未经任何 说 明 书 CN 103263672 A 8 7/8 页 9 处理的纳米粒混悬液加同样体积的乙腈破乳， 按照 HPLC 条件测紫杉醇或多烯紫杉醇的含 量 ： 0061 包封率 ( ) 纳米粒包封的药物的量 / 投入药物总的量 100 0062 所得纳米粒的平均包封率为 80 95。 0063 实施例 14 ： 含紫杉醇药物纳米粒的体外药物释放实验 0064 将制备好的载药纳米粒 ( 实施例 1、 实施例 2 和实施例 3) 溶于适量 PB。
39、S 缓冲液 (pH7.4， 含 0.5吐温 -80)， 稀释至紫杉醇 1mg/mL， 混匀。取 5mL 置于透析袋中， 扎紧透析 袋。将透析袋放入 50mL PBS 缓冲液 (pH7.4， 含吐温 -80 0.5 )， 37， 100r/min， 于不同 时间点取透析袋外 PBS 液 0.5mL。分别测定紫杉醇含量 ( 色谱柱 ： ODS(Lichrospher-C18， 2504.6mm， 5m) ； 流动相 ： 甲醇-乙腈-水(304032) ； 流速 ： 1.0mL/min， 检测波长 ： 226nm ； 柱温 ： 30 )， 结果见图 3。 0065 实施实例 15 ： 纳米粒的体外细。
40、胞毒性实验 0066 毒性实验前预先培养人肺癌细胞 A549， 在细胞生长对数期将细胞以每孔 6000 细 胞的数量接种于 96 孔板， 对实施例 1 所制备的纳米粒以及实施例 1 不载药纳米粒与市场销 售抗肿瘤制剂泰素进行体外抑瘤实验， 保证载药纳米粒和泰素之间药物的浓度一致。细胞 继续培养 48 小时， 以细胞存活率作为评价指标， 比较他们之间的抗肿瘤活性， 结果见图 4。 0067 实施实例 16 ： 包载紫杉醇纳米粒的体内药物动力学实验 0068 对实施例1制得的包载紫杉醇的PLGA纳米粒子进行体内药代动力学实验， 以泰素 为正对照。取健康的雌性 SD 大鼠 (20010) 克共 8 。
41、只， 随机分成 2 组， 每组 4 只， 给药前禁 食一夜。分别以 10mg/kg 的剂量对每组大鼠尾静脉给药， 分别在 5 分钟、 15 分钟、 30 分钟、 45 分钟、 1、 2、 4、 8、 12、 24 小时后取血 200L， 5000rpm 离心分离。乙腈处理后用高效液相色 谱检测血浆中的紫杉醇含量。图 5 是得到的药时曲线， 与泰素相比， 实施例 1 制备的紫杉醇 纳米粒， 具有长循环作用。 0069 实施实例 17 ： 包载荧光探针的纳米粒子在 A549 裸小鼠移植瘤模型中体内脏器分 布实验 0070 80mg PLGA(50 50， 分子量 45000) 和 0.8mg 荧光。
42、探针 DiR(1， 1- 双十八烷基 -3， 3， 3， 3 四甲基碘化 ) 溶于 20mL 丙酮溶剂中作为油相， 240mgTPGS 溶于 40mL 水与乙醇体积比 例为11的共溶剂中形成共溶剂相 ； 将油相以1mL/min的速度滴入共溶剂相， 300r/min低 速搅拌下形成纳米乳， 滴加完成后， 将乳剂转移到旋转蒸发仪真空旋转除去有机溶剂， 得到 纳米粒。 0071 A549 细胞接种裸小鼠， 当肿瘤体积长到约 500mm3随机分为 3 组， 每组 3 只老鼠， 尾 静脉注射后， 分别在 2 小时、 8 小时、 24 小时时间点， 对小鼠全身进行活体成像， 见图 6A。然 后将裸鼠处死后。
43、， 取出主要的脏器(心、 肝、 脾、 肺、 肾)和肿瘤， 用小鼠活体成像系统检测包 裹DiR荧光的纳米粒在这样组织中的分布情况， 见图6B。 纳米在肿瘤部位有明显的聚集， 具 有被动靶向功能。 根据活体成像仪测得的荧光强度信号， 进行统计分析， 得到定量的荧光数 据， 见图 6C。 0072 实施实例 18 ： 紫杉醇纳米粒的抗肿瘤动物实验 0073 为了更好的评价我们纳米粒的抗肿瘤性能， 以下用紫杉醇纳米粒 ( 实施例 1 和实 施例 7) 同现有的临床用紫杉醇注射液 ( 泰素 )， 在小鼠肺癌细胞 A549 细胞系皮下瘤模型 说 明 书 CN 103263672 A 9 8/8 页 10 。
44、上， 对抑瘤效果进行了观察比较， 如同 7 所示。 0074 实验结果显示 ： 紫杉醇纳米粒剂型(紫杉醇剂量为10mg/kg)与紫杉醇注射液剂型 (紫杉醇含量为10mg/kg)相比， 紫杉醇纳米粒对A549细胞系皮下瘤模型有较好的抑制肿瘤 生长的作用。 另外， 紫杉醇纳米剂型对小鼠体重变化没有明显的影响(图8)， 说明新的紫杉 醇纳米剂型毒性很低。 说 明 书 CN 103263672 A 10 1/5 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103263672 A 11 2/5 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103263672 A 12 3/5 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103263672 A 13 4/5 页 14 图 6 说 明 书 附 图 CN 103263672 A 14 5/5 页 15 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103263672 A 15 。