技术领域
本发明涉及电子工程、合成生物学、光遗传学等多学科交叉领域，具体涉及一种通过在体内植入光学模块集诊断和治疗糖尿病为一体的糖尿病超远程智能诊疗系统及其在糖尿病治疗中的应用。
背景技术
糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病，是当前威胁全球人类健康的最重要的慢性流行性疾病之一。随着患者病情的加重，将会累及身体各个重要脏器及全身组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害，引发多种并发症。其中1型糖尿病，多发生在儿童和青少年，也可发生于其他年龄。一般由于胰腺中分泌胰岛素的胰岛β细胞遭到自身反应性T细胞的靶向性破坏，导致体内胰岛素绝对不足，容易发生酮症酸中毒，患者通常需要终身接受胰岛素治疗，否则将危及生命。2型糖尿病多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。2型糖尿病患者的胰岛素缺乏源于胰岛β细胞功能失活或者胰岛素抗性，即胰岛素作用的靶器官、组织对其生物学效应的反应性降低或丧失，机体需要分泌更多的胰岛素来代偿这种缺陷，2型糖尿病可以通过注射胰高血糖素样肽(GLP‐1‐Fc)使病情得到缓解。目前的医疗水平仍不能将糖尿病彻底治愈，糖尿病患者需每天口服降血糖药物或注射胰岛素来维持血糖稳定，且注射胰岛素无法达到可控地释放胰岛素，极易造成低血糖风险。因此，能够实时智能化的自我监控体内血糖浓度并且能够准确的对血糖浓度及时进行调整对于治疗糖尿病非常重要。目前市场上出现了少数智能血糖监测仪，只能简单的给出血糖值，且智能化程度并不高，患者仍需根据给出的血糖值调整治疗方案和生活习惯，还没有能够集诊断和治疗为一体的糖尿病超远程智能诊疗系统。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提出一种通过在体内植入光学模块集诊断和治疗糖尿病为一体的糖尿病超远程智能诊疗系统，以及该智能诊疗系统在糖尿病治疗中的应用，本发明植入体内的光学模块受体内血糖浓度反馈调节和用户手机直接超远程控制双重调控，具有超远程控制、对糖尿病病情判断准确，治疗迅速，操作简便，智能化程度高，治疗绝缘性好以及无毒副作用等特点，能达到自动化、精准化、个体化治疗糖尿病的目的，在人工智能定制细胞与疾病的诊疗中，具有巨大的潜在应用价值，未来可以广泛应用于临床治疗。
本发明提出了一种糖尿病超远程智能诊疗系统，所述设备包括：血糖数据自动控制系统、血糖数据远程控制系统、无线供电模块、光学模块；所述血糖数据自动控制系统包括血糖浓度检测仪和血糖数据处理单元；所述血糖数据自动控制系统通过所述血糖浓度检测仪获取血糖浓度值后，生成血糖浓度数据；所述血糖数据处理单元从所述血糖浓度数据中提取血糖浓度值，根据血糖浓度值输出对应电压的电流到所述无线供电模块；所述血糖数据远程控制系统包括安装有应用终端的移动设备和智能远程控制器；所述移动设备向所述智能远程控制器发送指令，所述智能远程控制器与所述血糖数据处理单元通信，所述血糖数据处理单元依据指令输出对应电压的电流；所述无线供电模块根据所输入电流的电压值输出对应发射功率的正弦波信号；所述光学模块包括串联设置的感应接收线圈、电容、LED和含有工程化细胞的移植载体；所述感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节所述LED的发光亮度，诱导所述移植载体中的工程化细胞产生不同量的降血糖药物。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述血糖浓度测试仪包括：血糖试纸条、血糖浓度传感器模块、手机蓝牙无线传输模块及其客户端软件。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述血糖数据处理单元对血糖浓度范围作出判断，根据设定的血糖浓度阈值划分来控制继电器单元中不同的继电器开关，通过继电器调控该系统开关电源的输出电压来输出相应的电流到所述无线供电模块。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述血糖数据自动控制系统进一步设有直流电源供电模块；用于显示血糖浓度值、输出电压值、光学模块LED亮度值液晶显示模块；开关电源；无线供电模块。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述血糖浓度检测仪通过蓝牙无线传输将血糖浓度数据传送至血糖数据处理单元。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述血糖数据远程控制系统中的所述移动设备具有无线接收模块，所述移动设备获取血糖浓度数据并利用应用终端读取血糖浓度值；所述智能远程控制器与所述移动设备之间通过无线信号远程通信。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述血糖数据远程控制系统进一步设有微控制器；继电器驱动模块；继电器组；电源适配器和开关电源。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述无线供电模块进一步设有低压差线性稳压芯片、电磁振荡电路、功率放大电路和发射回路。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述LED发射光包括紫光、蓝光、绿光、红光、近红外光和远红光。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述移植载体含有工程化细胞，所述工程化的细胞为受光诱导调控基因表达的定制化细胞，包括多种原核细胞和真核细胞。
本发明提出的所述糖尿病超远程智能诊疗系统中，所述移植载体的形式包括水凝胶、半透膜透析袋、中空纤维管、微胶囊。
本发明还提出了该糖尿病超远程智能诊疗系统在糖尿病治疗中的应用。
本发明糖尿病超远程智能诊疗系统通过血糖浓度测试仪对血糖浓度进行测试，测试数据可通过血糖数据处理单元及无线供电模块回馈至体内光学模块的LED，根据设定的血糖浓度阈值(血糖浓度范围对应LED的亮度)，患者血糖浓度越高，体内光学模块的LED亮度越强，受光调控的工程化的细胞分泌的降血糖药物越多，降血糖效果越明显；当患者血糖浓度恢复正常或偏低时，系统会关闭光学模块，停止产生降血糖药物，以防止患者血糖过低。
附图说明
图1为糖尿病超远程智能诊疗系统的整体工作原理；
图2为糖尿病超远程智能诊疗系统的电路原理图；
图3为血糖数据自动控制系统的血糖浓度测试仪、蓝牙无线发射模块、直流电源供电模块实物图；
图4为血糖数据自动控制系统液晶显示模块实物图；
图5为无线供电模块和光学模块远红光LED线圈同处一定范围内实物图；
图6为血糖数据远程控制系统智能控制器实物图；
图7为血糖数据远程控制系统智能控制器配套APP截屏图；
图8为光学模块实物图；
图9为光学模块结构模式图；
图10为光学模块的感应接收线圈、电容、远红外LED实物图；
图11为在体外验证不同浓度的葡萄糖溶液可控制体内光学模块远红光LED的不同亮度从而诱导不同的SEAP表达量的实验结果图；
图12为在体外验证从野生型小鼠和糖尿病小鼠体内取出不同血糖浓度的血液样品控制体内光学模块远红光LED的不同亮度从而诱导不同的小鼠胰岛素表达量的实验结果图；
图13为在体外验证从健康人和糖尿病患者体内取出不同血糖浓度的血液样品控制体内光学模块远红光LED的不同亮度从而诱导不同的GLP-1-Fc表达量的实验结果图；
图14为以SEAP为报告基因，在野生型小鼠和2型糖尿病小鼠体内验证糖尿病超远程智能诊疗系统针对于不同血糖浓度的数字化自我回馈功能的实验结果图；
图15、16、17为在2型糖尿病小鼠体内验证糖尿病超远程智能诊疗系统对于2型糖尿病的诊断和治疗功能结果图：
其中，图15为糖尿病超远程智能诊疗系统对2型糖尿病小鼠进行诊断治疗诱导的GLP-1-Fc在24h、48h、72h的表达量结果图；
其中，图16为糖尿病超远程智能诊疗系统对2型糖尿病小鼠进行诊断治疗，在24h、48h、72h测得的血糖浓度结果图；
其中，图17为糖尿病超远程智能诊疗系统对2型糖尿病小鼠进行诊断治疗，在各个血糖监测时间点的光学模块远红光LED的亮度以及其对应的血糖浓度结果图。
具体实施方式
以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅用于举例说明发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本发明的实施过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公认常识，本发明没有特别限制内容。以下实施例中所用的试剂、仪器等，以及未注明具体条件的实验方法，按照常规或商品供货商所建议的条件进行。
本发明糖尿病超远程智能诊疗系统由血糖数据自动控制系统、血糖数据远程控制系统、无线供电模块和光学模块组成。血糖数据自动控制系统包括血糖浓度检测仪和血糖数据处理单元；血糖数据自动控制系统中的血糖浓度检测仪获取血糖浓度值后，生成血糖浓度数据；通过血糖数据自动控制系统中的血糖数据处理单元从血糖浓度数据中提取血糖浓度值，根据血糖浓度值输出对应电压的电流到无线供电模块；
血糖数据远程控制系统包括安装有应用终端的移动设备和智能远程控制器；二者通过接入同一无线局域网WLAN，由移动设备向智能远程控制器发送指令，通过智能远程控制器输入至血糖数据处理单元中输出对应电压的电流；
无线供电模块根据所输入电流的电压值输出对应发射功率的正弦波信号；光学模块包括串联设置的感应接收线圈、电容、LED和含有工程化细胞的水凝胶；感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块LED的发光亮度，诱导水凝胶中的工程化细胞产生不同量的降血糖药物。同时远程调节光学模块LED的发光亮度，诱导水凝胶中的工程化细胞产生不同量的降血糖药物。
本具体实施方式中所用的血糖浓度测试仪购自中国北京怡成生物电子技术有限公司，对其进行了改造，将其与手机蓝牙无线发射接收模块进行数据对接，完成对血糖浓度数据的无线传输,传输的测试距离为10m之内。血糖浓度检测仪中采用3.7V聚合物可充电锂电池给血糖读取仪器以及蓝牙发射模块供电。
本具体实施方式中的血糖数据自动控制系统进一步包括直流电源供电模块、血糖数据处理单元、液晶显示模块、继电器单元、开关电源。直流电源供电模块为AC-DC电源适配器，完成对AC220V的交流电进行转换，转换的直流电压给开关电源模块，血糖数据处理单元，蓝牙无线发射接收模块，液晶显示模块，继电器单元供电。血糖数据处理单元为美国德州仪器公司的低功耗系列血糖数据处理单元芯片MSP430，其与蓝牙无线发射接收模块连接，通过标准的通用串行异步收发总线接收蓝牙无线发射模块传输的血糖浓度数据。血糖数据处理单元MSP430根据通信协议，对接收的血糖数据进行提取，并将数据传输给显示模块显示，同时对血糖浓度范围作出判断，根据浓度的阈值划分来控制不同的继电器开关，据此调控该系统开关电源的输出电压来达到对体内光学模块的亮度调控。
血糖浓度阈值划分为<6.1mM、6.1-11.1mM、11.1-16.8mM、>16.8mM，分别对应的远红光LED的亮度为0mW/cm2，0.2mW/cm2，1.0mW/cm2，5.0mW/cm2。
以下是血糖浓度控制程序设计：
以上血糖浓度阈值及其伪代码为本发明的具体实施方式之一，本发明对于上述阈值不做限定。
本具体实施方式中的血糖数据远程控制系统包括：安装有应用终端的移动设备、智能远程控制器、微控制器、继电器驱动模块、继电器组、电源适配器、开关电源。
上述具体实施方式中，开关电源的输入电压:5～23V，最高23V，20V内使用为优，输入防接反(输入的电压须比输出电压高1V以上)；可调输出电压范围0V～16.5V连续可调，自动保存上次设定电压；峰值电流3A，在2A内使用为优。精度1％，最小显示0.01A；转换效率高，可达95％(效率与输入、输出电压、电流、压差有关)；负载调整率S(I)≤0.8％，电压调整率S(u)≤0.8％。移动设备的为一部或者多部智能手机，应用终端为相应的客户端软件App。智能远程控制器支持手机远程控制，支持WiFi，2G/3G/4G控制模式，最大允许10A大电流，支持多路控制，每路可独立控制，控制效果实时推送至移动设备，并于应用终端内显示；智能远程控制器还可支持定时开关、场景模式，实现定时开关和一键开关功能，支持安卓、苹果手机及平板，软件支持自定义属性，同一款软件支持多个设备、多个开关，并可进一步支持数据备份和数据恢复，支持扫描二维码导入设备，也可与其他人员分享设备，操作方便捷。
无线供电模块包括：低压差线性稳压芯片、电磁振荡电路、功率放大电路和发射回路。低压差线性稳压芯片提供模块所需的稳定的电压，电磁振荡电路产生频率180KHz的正弦波信号，功率放大电路提供频率180KHz的正弦波信号发射所需的功率，发射回路将正弦波信号发射到空间，形成一个电磁环境。其中，发射回路选用纯铜导线绕制而成的外径为20cm的发射线圈并采用多个发射线圈构成一个相对均匀的无线电磁环境。
光学模块包括：感应接收线圈、电容、LED和含有工程化细胞的水凝胶。LED为两个贴片式3535封装的远红光LED。进一步地，水凝胶LED中包裹了受远红光调控的工程化的哺乳动物细胞HEK-293，具体制备过程如下：将经转染过远红光系统的HEK-293细胞悬浮在1.5％(w/v)的海藻酸钠缓冲液中(海藻酸钠是溶解在DMEM中的)，达到细胞终密度为每毫升4×106个细胞，相当于每个水凝胶LED中包裹2×106个经上述转染过的HEK-293细胞。将光学模块的远红光LED线圈正面向上放置于24孔板孔底部，用移液器吸取500μl上述细胞悬浮液滴加到远红光LED线圈上。然后加500μl聚合缓冲液(100mM CaCl2,10mM MOPS,pH＝7.2)固化10min以上，最后放置于在0.05％的多聚赖氨酸溶液(0.05％poly-L-lysine,MW:15,000-30,000,10mM MOPS,0.85％NaCl,pH＝7.2)中再孵育10min。
分子克隆
分子克隆技术构建本发明所有表达质粒，步骤为业内常识。
所有用于PCR的引物均由金唯智生物科技有限公司合成。本发明实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由金唯智生物科技有限公司完成。本发明实施例中所用的Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。核酸内切酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。同源重组酶购自和元生物技术(上海)股份有限公司。PhantaMax Super-Fidelity DNA聚合酶购买时附带有相应的聚合酶缓冲液和dNTP。核酸内切酶、T4DNA连接酶、同源重组酶购买时附带有相应的缓冲液。酵母提取物(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Trypton)、琼脂粉、氨苄青酶素(Amp)购自上海生工生物工程技术有限公司。DNA Marker DL5000、DNAMarker DL2000(宝生物工程有限公司)；核酸染料EB(广东国奥生物技术公司)；质粒小抽提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司；实施例中提及的无水乙醇、NaCl等其余试剂均为国产分析纯产品。DNA片段的胶回收、纯化回收，其步骤根据DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)的操作说明书；质粒提取步骤根据质粒小抽(天根生化科技(北京)有限公司)提取试剂盒说明书。
细胞培养与转染
本发明实施例中用以下细胞系和PEI转染为例说明远红光调控转基因表达的基因环路远程调控系统在细胞及动物体内的工作情况，但不限制本发明发明保护范围。
用于细胞培养的10cm细胞培养皿、细胞培养板(24孔)、15mL和50mL的离心管均购自美国Thermo Fisher Scientific公司(Labserv)；使用的改良过的Eagle培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素溶液购自美国Gibico公司；转染所用的PEI购自Polysciences公司；细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司；其余耗材为普通国产耗材。
细胞培养：人胚胎肾细胞(HEK-293,ATCC:CRL-11268)培养于改良过的Eagle培养基中，培养基中加入10％(v/v)的胎牛血清和1％(v/v)的青霉素和链霉素溶液；细胞培养于37℃、含有5％二氧化碳浓度的培养箱中。
转染：所有细胞系转染使用优化后的PEI的操作步骤(Wieland M,Methods 56(3):351)。简单的说，即为在培养体系为10mL 10cm细胞培养皿中接种4×106个细胞，在培养16h后，将最优比例的DNA按照3:1(PEI:DNA)的质量比与PEI混合溶解于2mL的培养基中静置6h。
报告基因分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的检测
用于配置检测报告基因反应缓冲液的高精氨酸、氯化镁、二乙醇胺、HCl均购至生工生物工程(上海)股份有限公司；生色底物(pNPP:p-Nitrophenylphosphate)购至上海晶纯生化科技股份有限公司(阿拉丁)。
(1)试剂配置：
2xbuffer:
·20mM高精氨酸注：其作用是抑制内源性的碱性磷酸酶活性
·1mM氯化镁
·2％二乙醇胺
·用HCl调节pH至9.8
底物溶液：
·120mM生色底物(pNPP:p-Nitrophenylphosphate)
·In 2x assay buffer
(2)实验步骤：
1.吸取细胞培养液上清液，200μL到离心管中(注：一般要超过150μL，因为后续加热会损耗体积一部分)。
2.65℃水浴30min(注：加热主要是让内源性的碱性磷酸酶失活，而SEAP耐高温，在此温度下不会失活)。
3.吸取80μL(根据实验的情况自行稀释)到96孔板，快速加入事先预热好的2x buffer100μl和底物溶液20μl。
4.酶标仪405nm测10次，每次间隔1min(根据实验的情况可另设条件)。
(3)酶活的计算
碱性磷酸酶(SEAP)的酶活力定义是:37℃，pH 9.8时,在1min内与底物对硝基苯磷酸二钠(PNPP-Na2)反应生成1mol/L对硝基苯酚的碱性磷酸酶,定义为1个活力单位(1U)。对硝基苯酚本身有亮黄色，在波长405nm时，不同浓度的对硝基苯酚对应不同的吸光值。计算方法为：样品和底物反应过程中不同时间点所测OD值做成曲线的斜率*256.8即为酶活，单位U/L。
制备光学模块水凝胶远红光LED所用的海藻酸钠购自瑞士Buchi公司，多聚赖氨酸购自美国Sigma公司，氯化钠、氯化钙、MOPS(Morpholinopropanesulfonic acid)均购自上海生工生物工程技术有限公司。
胰岛素(Insulin)的检测方法
实验所用的胰岛素检测试剂盒(Mouse Insulin ELISAkit)购自瑞典Mercodia公司，具体测定方法详见产品说明书。
胰高血糖素(GLP-1-Fc)的检测方法
实验所用的胰高血糖素检测试剂盒(Millipore Corporation,Billerica,MA 01821USA,Cat.no.EGLP-35K,Lot.no.2639195)购自美国Millipore公司，具体测定方法详见产品说明书。
实施例1，糖尿病超远程智能诊疗系统的构成与制作
本发明中以附图2为例，说明糖尿病超远程智能诊疗系统的制作方法，但不限制本发明保护范围。
第一步，对血糖仪进行改造，加入蓝牙无线发射模块以及3.7V聚合物可充电锂电池。蓝牙串口发射接收模块型号为HC-05，主从机一体式蓝牙模块，集成通用串行异步收发总线，接口电平为国际标准的TTL电平，HC-05主从机一体式蓝牙模块与血糖浓度测试仪进行数据对接完成对血糖浓度数据的无线传输，传输的测试距离为10m之内；3.7V聚合物可充电锂电池给血糖浓度测试仪以及蓝牙发射模块供电。
第二步，将血糖数据处理单元和蓝牙无线接收模块连接。血糖数据处理单元即微控制器(MCU)，为美国德州仪器公司的低功耗系列微控制器芯片MSP430，和蓝牙无线接收模块连接，通过标准的通用串行异步收发总线接收蓝牙发射模块传输的血糖浓度数据。血糖数据自动控制系统的血糖浓度测试仪、蓝牙无线发射接收模块、直流电源供电模块实物图详见附图3。
第三步，将血糖数据处理单元和液晶显示模块连接。微控制器MSP430根据通信协议，对接收的血糖数据进行提取，并将数据传输给液晶显示模块显示。血糖数据自动控制系统液晶显示模块实物图详见说明书附图4。
第四步，将血糖数据处理单元和不同模式下的继电器连接。血糖数据处理单元对血糖浓度范围作出判断，根据血糖浓度的阈值划分来输出对应不同浓度范围下的高低电平信号，驱动不同模式下的继电器开关状态。
第五步，将继电器和无线供电模块连接，无线供电模块和光学模块同处于一定范围内。不同模式下的继电器开关状态决定无线供电模块的发射功率，从而调控系统开关电源的输出电压来达到对光学模块的亮度调节。无线供电模块和光学模块远红光LED线圈同处一定范围内实物图详见说明书附图5。
第六步，App客户端的实现。由购买的智能控制器生产厂家(具体见实验材料与方法)提供的相配套的App，其具体的设置及其使用方法详见厂家使用说明书。该App的功能包括控制光学模块远红光LED的亮度、照射时间、定时开关；还可显示当前患者体内的血糖浓度值、远红光LED的亮度值；并且可以将患者的血糖情况记录在案，发送给其监护人所持移动设备的该App客户端。血糖数据远程控制系统智能控制器配套App截屏图详见说明书附图7。
第七步，血糖数据远程控制系统的实现。本发明中的血糖数据远程控制系统(具体功能及参数详见实验方法与材料)购自智能家居工作室，通过其可以使用智能手机利用局域网WiFi或2G/3G/4G网络资源实现直接超远程控制远红光光源的亮度，从而控制不同的SEAP、胰岛素或GLP-1-Fc的表达量。血糖数据远程控制系统智能控制器实物图详见说明书附图6。
第八步，光学模块的制作。本发明中光学模块由感应接收线圈，电容，两个贴片式3535封装的远红外LED和包裹了受远红光诱导调控的工程化细胞的水凝胶构成。电容和远红外LED为并联关系。受远红光诱导调控的工程化细胞为经转染所需必要元件的HEK-293细胞。光学模块实物图详见说明书附图8，结构模式图详见说明书附图9，感应接收线圈、电容、远红外LED实物图详见说明书附图10。
实施例2,在体外验证不同浓度的葡萄糖溶液通过糖尿病超远程智能诊疗系统可控制光学模块远红光LED的不同亮度从而诱导水凝胶中工程化细胞产生不同的SEAP表达量
本实例以SEAP为报告基因，举例证明葡萄糖溶液的不同浓度可控制体内光学模块远红光LED的不同亮度，从而诱导不同的SEAP表达量，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，糖尿病超远程智能诊疗系统的制作(详见上文具体实施方式材料与方法及实施例1)
第二步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
第三步，接种细胞。将生长状态良好的HEK-293细胞用0.25％的胰酶消化后种于10cm细胞培养皿中，每皿种4×106个细胞，并加10mL含10％FBS的DMEM培养基。
第四步，转染。在接种细胞16到24h内，将4μg pWS46、4μgpGY32、4μg pXY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到10cm细胞培养皿中。其中每皿的配制总体积为2mL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入10mL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。
第五步，水凝胶远红光LED的制备(具体方法参照材料与方法)。
第六步，将上述制得的水凝胶远红光LED置于24孔板中进行培养，分别用配制的不同葡萄糖浓度阈值的葡萄糖溶液(浓度分别为2mM，4mM，6mM，7mM，9mM，11mM，12mM，14mM，16mM，18mM，20mM，22mM共12组)分别滴加在血糖试纸条上，血糖浓度检测仪获取血糖浓度值后，生成血糖浓度数据；通过血糖数据自动控制系统中的血糖数据处理单元从血糖浓度数据中提取血糖浓度值，根据血糖浓度值输出对应电压的电流到无线供电模块；无线供电模块根据所输入电流的电压值输出对应发射功率的正弦波信号；光学模块包括串联设置的感应接收线圈、电容、远红光LED和含有工程化细胞的移植载体；感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同SEAP表达量。
第七步，检测报告基因。分别在培养48h后取各组的细胞培养液上清测定SEAP的表达量(具体方法参照材料与方法)。
例如，将浓度为2mM，4mM，6mM的葡萄糖溶液滴加到血糖试纸条上，此浓度在<6.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP的表达量几乎为0；将浓度为7mM，9mM，11mM的葡萄糖溶液滴加到血糖试纸条上，此浓度在6.1-11.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0.2mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP的表达量为100U/L左右；将浓度为12mM，14mM，16mM的葡萄糖溶液滴加到血糖试纸条上，此浓度在11.1-16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为1.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP的表达量为200U/L左右；将浓度为18mM，20mM，22mM的葡萄糖溶液滴加到血糖试纸条上，此浓度在>16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为5.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP的表达量为300U/L左右。
结果显示，通过糖尿病超远程智能诊疗系统中的血糖数据自动控制系统可以根据输入的不同葡萄糖浓度阈值的葡萄糖溶液输出对应电压的电流到无线供电模块，光学模块的感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同SEAP表达量。本实施例以SEAP为报告基因，在体外验证了该糖尿病超远程智能诊疗系统的功能。实验数据详见说明书附图11。
实施例3，在体外验证从野生型小鼠和糖尿病小鼠体内取出不同血糖浓度的血液样品通过糖尿病超远程智能诊疗系统可控制光学模块远红光LED的不同亮度从而诱导水凝胶中工程化细胞产生不同的小鼠胰岛素表达量
本实例以小鼠胰岛素为报告基因，举例证明不同浓度的血糖可控制光学模块的不同亮度从而诱导不同的小鼠胰岛素表达量，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，糖尿病超远程智能诊疗系统的制作(详见上文具体实施方式材料与方法及实施例1)。
第二步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
第三步，接种细胞。将生长状态良好的HEK-293细胞用0.25％的胰酶消化后种于10cm细胞培养皿中，每皿种4×106个细胞，并加10mL含10％FBS的DMEM培养基。
第四步，转染。在接种细胞16到24h内，将4μg pWS46、4μgpGY32、4μg pWS213、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到10厘米细胞培养皿中。其中每皿的配制总体积为2mL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入10mL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。
第五步，水凝胶远红光LED的制备(具体方法参照材料与方法)。
第六步，将上述制得的水凝胶远红光LED置于24孔板中进行培养，分别用取自野生型小鼠和糖尿病小鼠体内的不同血糖浓度的血液样品，分别为5.7mM，8.4mM，14.8mM，21.2mM。滴加在血糖试纸条上，血糖浓度检测仪获取血糖浓度值后，生成血糖浓度数据；通过血糖数据自动控制系统中的血糖数据处理单元从血糖浓度数据中提取血糖浓度值，根据血糖浓度值输出对应电压的电流到无线供电模块；无线供电模块根据所输入电流的电压值输出对应发射功率的正弦波信号；光学模块包括串联设置的感应接收线圈、电容、远红光LED和含有工程化细胞的移植载体；感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同小鼠胰岛素表达量。第七步，检测报告基因。分别在培养48h后取各组的细胞培养液上清测定小鼠胰岛素的表达量(具体方法参照材料与方法)。
例如，将血糖浓度为5.7mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在<6.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中小鼠胰岛素表达量约为1.5ng/mL；将血糖浓度为8.4mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在6.1-11.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0.2mW/cm2，因而测得24孔板上清液中小鼠胰岛素表达量约为4.5ng/mL；将血糖浓度为14.8mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在11.1-16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为1.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中小鼠胰岛素表达量约为7.5ng/mL；将血糖浓度为21.2mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在>16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为5.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中小鼠胰岛素表达量约为12.5ng/mL。
结果显示，糖尿病超远程智能诊疗系统中的血糖数据自动控制系统可以根据输入的不同血糖浓度阈值的血液样品(取自野生型小鼠和糖尿病小鼠)输出对应电压的电流到无线供电模块，光学模块的感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同小鼠胰岛素表达量。本实施例以小鼠胰岛素为报告基因，在体外验证了该糖尿病超远程智能诊疗系统的功能。实验数据详见说明书附图12。
实施例4，在体外验证从健康人和糖尿病患者体内取出不同血糖浓度的血液样品控制体内光学模块远红光LED的不同亮度，从而诱导不同的GLP-1-Fc表达量
本实例以GLP-1-Fc为报告基因，举例证明不同浓度的血糖可控制光学模块的不同亮度从而诱导不同的GLP-1-Fc表达量，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，糖尿病超远程智能诊疗系统的制作(详见上文具体实施方式材料与方法及实施例1)。
第二步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
第三步，接种细胞。将生长状态良好的HEK-293细胞用0.25％的胰酶消化后种于10cm细胞培养皿中，每皿种4×106个细胞，并加10mL含10％FBS的DMEM培养基。
第四步，转染。在接种细胞16到24h内，将4μg pWS46、4μg pGY32、4μgp WS212、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到10cm细胞培养皿中。其中每皿的配制总体积为2mL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入10mL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。
第五步，水凝胶远红光LED的制备(具体方法参照材料与方法)。
第六步，将上述制得的水凝胶远红光LED置于24孔板中进行培养，分别用取自健康人和糖尿病患者体内的不同血糖浓度的血液样品，分别为6.0mM，8.3mM，13.6mM，18.4mM。滴加在血糖试纸条上，血糖浓度检测仪获取血糖浓度值后，生成血糖浓度数据；通过血糖数据自动控制系统中的血糖数据处理单元从血糖浓度数据中提取血糖浓度值，根据血糖浓度值输出对应电压的电流到无线供电模块；无线供电模块根据所输入电流的电压值输出对应发射功率的正弦波信号；光学模块包括串联设置的感应接收线圈、电容、远红光LED和含有工程化细胞的移植载体；感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同GLP-1-Fc表达量。
第七步，检测报告基因。分别在培养48h后取各组的细胞培养液上清测定GLP-1-Fc的表达量(具体方法参照材料与方法)。
例如，将血糖浓度为6.0mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在<6.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中GLP-1-Fc表达量约为40pM；将血糖浓度为8.3mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在6.1-11.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0.2mW/cm2，因而测得24孔板上清液中GLP-1-Fc表达量约为200pM；将血糖浓度为13.6mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在11.1-16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为1.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中GLP-1-Fc约为400pM；将血糖浓度为18.4mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在>16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为5.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中GLP-1-Fc约为570pM。
结果显示，糖尿病超远程智能诊疗系统中的血糖数据自动控制系统可以根据输入的不同血糖浓度阈值的血液样品(取自健康人和糖尿病患者)输出对应电压的电流到无线供电模块，光学模块的感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同GLP-1-Fc表达量。本实施例以GLP-1-Fc为报告基因，在体外验证了该糖尿病超远程智能诊疗系统的功能。实验数据详见说明书附图13。
实施例5,以SEAP为报告基因，在野生型小鼠和2型糖尿病小鼠体内验证糖尿病超远程智能诊疗系统针对于不同血糖浓度的数字化自我回馈功能
本实例以SEAP为报告基因，举例证明不同小鼠自身的不同血糖浓度可控制植入各小鼠体内的光学模块远红光LED的不同亮度，从而诱导不同的SEAP表达量，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，糖尿病超远程智能诊疗系统的制作(详见上文具体实施方式材料与方法及实施例1)。
第二步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
第三步，接种细胞。将生长状态的良好的HEK-293细胞用0.25％的胰酶消化后种于10cm细胞培养皿中，每皿种4×106个细胞，并加10mL含10％FBS的DMEM培养基。
第四步，转染。在接种细胞16到24h内，将4μg pWS46、4μgpGY32、4μg p XY34、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到10cm细胞培养皿中。其中每皿的配制总体积为2mL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入10mL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。
第五步，水凝胶远红光LED的制备(具体方法参照材料与方法)。
第六步，将上述制得的水凝胶远红光LED移植入野生型小鼠和2型糖尿病小鼠的腹腔中，分别对上述小鼠进行尾静脉取血，将取得的血液样品分别为5.9mM，9.4mM，14.2mM，17.2mM。滴加在血糖试纸条上，血糖浓度检测仪获取血糖浓度值后，生成血糖浓度数据；通过血糖数据自动控制系统中的血糖数据处理单元从血糖浓度数据中提取血糖浓度值，根据血糖浓度值输出对应电压的电流到无线供电模块；无线供电模块根据所输入电流的电压值输出对应发射功率的正弦波信号；光学模块包括串联设置的感应接收线圈、电容、远红光LED和含有工程化细胞的移植载体；感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同SEAP表达量。第七步，检测报告基因。在糖尿病超远程智能诊疗系统的自我回馈系统运行48h后，对小鼠进行眼球内眦取血，测定小鼠血中SEAP的表达量(具体方法参照材料与方法)。
例如，将血糖浓度为5.9mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在<6.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP表达量约为10mU/L；将血糖浓度为9.4mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在6.1-11.1mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为0.2mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP表达量约为100mU/L；将血糖浓度为14.2mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在11.1-16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为1.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP约为200mU/L；将血糖浓度为17.2mM的血液样品滴加到血糖试纸条上，此浓度在>16.8mM的阈值范围内，对应的远红光LED的亮度为5.0mW/cm2，因而测得24孔板上清液中SEAP约为300mU/L。
结果显示，糖尿病超远程智能诊疗系统中的血糖数据自动控制系统可以根据输入的不同血糖浓度阈值的血液样品(取自野生型小鼠和2型糖尿病小鼠)输出对应电压的电流到无线供电模块，光学模块的感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同SEAP表达量。本实施例以SEAP为报告基因，在2型糖尿病小鼠体内验证了该糖尿病超远程智能诊疗系统的功能。实验数据详见说明书附图14。
实施例6，在2型糖尿病小鼠体内验证糖尿病超远程智能诊疗系统对于2型糖尿病的诊断和治疗功能
本实施例以2型糖尿病小鼠为例，举例证明糖尿病超远程智能诊疗系统对于糖尿病的诊断和治疗功能，但不对本发明的保护范围有所限制。具体步骤如下：
第一步，糖尿病超远程智能诊疗系统的制作(详见上文具体实施方式材料与方法及实施例1)。
第二步，质粒构建。本实例中的质粒构建详见表1。
第三步，接种细胞。将生长状态良好的HEK-293细胞用0.25％的胰酶消化后种于10cm细胞培养皿中，每皿种4×106个细胞，并加10mL含10％FBS的DMEM培养基。
第四步，转染。在接种细胞16到24h内，将4μg pWS46、4μgpGY32、4μg pWS212、PEI转染试剂与无血清的DMEM混匀，室温静置15min后均匀滴加到10cm细胞培养皿中。其中每皿的配制总体积为2mL，质粒与PEI质量比为1:3。转染6h后换入10mL含10％FBS的DMEM培养基进行培养。
第五步，水凝胶远红光LED的制备(具体方法参照材料与方法)。
第六步，体内实验过程及实验结果测定。将上述制得的水凝胶远红光LED移植入已禁食8h的野生型小鼠和2型糖尿病小鼠(5只，分别编号为1，2，3，4，5)的腹腔中，在移植1h后(将此时记为第0小时)，分别对上述小鼠进行尾静脉和眼球内眦取血，用眼球内眦取血样品测小鼠血中GLP-1-Fc的量，将从尾静脉取得的血液样品滴加在血糖试纸条上，血糖浓度检测仪获取血糖浓度值后，生成血糖浓度数据；通过血糖数据自动控制系统中的血糖数据处理单元从血糖浓度数据中提取血糖浓度值，根据血糖浓度值输出对应电压的电流到无线供电模块；无线供电模块根据所输入电流的电压值输出对应发射功率的正弦波信号；光学模块包括串联设置的感应接收线圈、电容、远红光LED和含有工程化细胞的移植载体；感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同GLP-1-Fc表达量，并记录远红光LED的亮度，经远红光LED照射4h后，停止光照直至第16小时，再禁食8h，禁食结束时为第24小时，此时再分别对上述小鼠进行尾静脉和眼球内眦取血，用眼球内眦取血样品测小鼠血中GLP-1-Fc的量，将从尾静脉取得的血液样品滴加在血糖试纸条上，通过糖尿病超远程智能诊疗系统的运行将数据传输至光学模块输出相应的远红光LED亮度(具体原理同上，此处不再重复)，并记录远红光LED的亮度，经远红光LED照射4h后，停止光照直至第40小时，再禁食8h，禁食结束时为第48小时，此时再次分别对上述小鼠进行尾静脉和眼球内眦取血，用眼球内眦取血样品测小鼠血中GLP-1-Fc的量，将从尾静脉取得的血液样品滴加在血糖试纸条上，通过糖尿病超远程智能诊疗系统的运行将数据传输至光学模块输出相应的远红光LED亮度(具体原理同上，此处不再重复)，并记录远红光LED的亮度，经远红光LED照射4h后，停止光照直至第53小时，再禁食8h，禁食结束时为第72小时，此时再测第72小时的血糖值及血中GLP-1-Fc的量。测定小鼠血中GLP-1-Fc的表达量(具体方法参照材料与方法)。
在此实验中，要同时记录3组数据，分别是时间，小鼠在每个时间段的血糖浓度，及通过糖尿病超远程智能诊疗系统激发出的不同远红光LED的亮度。例如，在0h时，1，2，3，4号小鼠的血糖浓度均在18mM以上，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为5.0mW/cm2，5号血糖浓度为15mM，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为1.0mW/cm2，进而产生了不同程度的降血糖效果。24h检测血糖浓度，1，4号血糖浓度已降至14mM左右，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为1.0mW/cm2，3号血糖浓度已降至10.5mM左右，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为0.2mW/cm2，2，5号血糖浓度已降至18mM左右，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为5.0mW/cm2。48h检测血糖浓度，1，3，5号血糖浓度降至8.5mM左右，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为0.2mW/cm2，2，4号血糖浓度降至14mM左右，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为1mW/cm2。72h检测血糖浓度，1，3，4，5号血糖浓度降至8.5mM左右，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为0.2mW/cm2，2号血糖浓度降至13mM左右，通过该糖尿病超远程智能诊疗系统，激发出的远红光LED的亮度为1mW/cm2。测得24h，48h，72h小鼠血中GLP-1-Fc的表达量平均值分别为45pM，65pM，65pM左右。对照组血糖正常小鼠体内的远红光LED则始终处于关闭状态，血中GLP-1-Fc的表达量始终处于较低水平，约12pM左右。
结果显示，糖尿病超远程智能诊疗系统中的血糖数据自动控制系统可根据2型糖尿病小鼠自身的血糖水平输出对应电压的电流到无线供电模块，光学模块的感应接收线圈接收正弦波信号后生成感应电流以调节光学模块远红光LED的发光亮度，诱导水凝胶中的上述工程化细胞产生不同GLP-1-Fc表达量来降低2型糖尿病小鼠体内的血糖浓度，与对照组相比，表现出极显著差异，高血糖症状明显得到缓解，血糖浓度基本降至正常水平。本实施例以降血糖药物GLP-1-Fc为报告基因，将糖尿病超远程智能诊疗系统的光学模块移植到了2型糖尿病小鼠体内，在2型糖尿病小鼠体内验证了该糖尿病超远程智能诊疗系统的诊断和治疗功能，即测得血糖后，系统可以根据其血糖水平精准调节胰高血糖素样肽(GLP-1-Fc)的表达量，进行针对性的治疗，避免了传统降血糖方法产生的降血糖过度而带来的不良后果，从而达到自动化、精准化、个体化治疗糖尿病的目的。通过本系统的自我诊断和治疗功能，2型糖尿病小鼠的血糖基本回归正常水平。实验数据详见说明书附图15，16，17。
表1,质粒构建表
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
<110> 苏州欣赛生物科技有限公司
<120> 糖尿病超远程智能诊疗系统及其在糖尿病治疗中的应用
<160> 12
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
AGTGCCACCTGACGTCCGATCCAGACATGATAAGATACATT
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<210> 9
<211> 44
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<213> 人工序列
<400> 9
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<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
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<210> 11
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<213> 人工序列
<400> 11
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<211> 40
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<213> 人工序列
<400> 12
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