一、技术领域
本发明涉及生物技术，特别是涉及一种肿瘤特异性转移因子的制备方法。
二、背景技术
已今为止，医学界普遍采用外科手术的方法来治疗绝大多数恶性肿瘤。 然而，由于肿瘤发生的隐匿性和发展的侵袭性，半数以上肿瘤患者在确诊之 初实际上已出现了瘤细胞的远处转移或亚临床转移灶，患者最终还是被癌魔 夺去了生命。如何控制术后复发，消灭亚临床转移灶，克服放疗对扩散性病 灶的无效作用，减轻化疗对机体免疫功能抑制带来的不良影响，成为世纪性 一大课题。继常规的手术、放疗、化疗之后，肿瘤的生物治疗已成为肿瘤治 疗的新模式，肿瘤生物治疗的主体是肿瘤免疫治疗，它的作用机制：一是诱 导肿瘤细胞自身生长的停滞或凋亡，二是激活机体内具有抗肿瘤特异性和细 胞毒活性的T细胞的产生，达到特异性杀伤肿瘤的目的。然而，肿瘤不仅是 系统性疾病，也是全身性疾病，肿瘤的治疗除手术和放疗等局部治疗外，还 必须进行全身治疗。从目前国际发展状况来看，肿瘤主动特异性免疫治疗显 示了更为良好的临床应用前景。用肿瘤特异性转移因子来治疗肿瘤正是基于 上述的作用机理，肿瘤特异性转移因子能激活细胞毒活性的T细胞的产生及 细胞因子的分泌，重建、修复及调动机体免疫功能，主动特异性地激发机体 对肿瘤细胞的体液免疫和细胞免疫能力，特异性抑制、杀伤相应的肿瘤细胞， 对手术切除原发灶患者具有控制转移、消除残余癌细胞的作用，达到治疗恶 性肿瘤的目的。对淋巴细胞的特异性激活和对肿瘤细胞的专一性抑制和杀伤 作用的共同存在是肿瘤特异性转移因子的治疗依据及特点，使得肿瘤特异性 转移因子成为一种安全有效主动特异性免疫治疗理想的药物。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤特异性转移因子的制备方法，利用肿瘤 特异性转移因子对肿瘤细胞的专一性抑制和杀伤作用的特点，采用生物技术 制成高效、特异的抗肿瘤药物。
为达到上述目的，本发明采用的的技术方案的制备方法由以下几个步骤 组成：
A.制备抗原：制备所需的原料为癌症患者的癌组织，制备过程为：匀浆 后，以5000～10000转/分钟的速度离心20～60分钟后，弃沉淀，再以8000～ 12000转/分钟的速度离心20～60分钟，最后收上清液除菌，定性定量，分 装保存；
B.动物免疫：免疫过程为：采取腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射， 共8～12点，每周免疫1次，共免疫4次，首次免疫和第二次免疫采用抗原 加佐剂；第三、四次免疫只用抗原。
C.制备肿瘤特异性转移因子：将经癌细胞抗原免疫的动物脾脏、淋巴结 绞碎，匀浆后，冻融：冻结温度为-20～-70℃，融化温度为20～30℃，冻融2～ 5次，最后低温透析，定量定性，无菌分装。 四、具体实施方式
本发明的具体实施步骤为：
1.制备抗原：
取手术切下的新鲜癌标本，用1～3倍体积的匀浆液，匀浆分散，匀浆 液条件是：0.9％NaCL、20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺 四乙酸二钠(EDTA-2Na)(PH7.4)，或20mmol/L三羟甲基氨基甲烷·盐 酸(Tris·HCl)缓冲液(PH7.4)；离心：5000～10000转/分钟、20～60分 钟，弃沉淀；再离心：收上清，离心：8000～12000转/分钟、20～60分钟， 收上清除菌，定性定量，分装保存。
2.免疫动物：
选择符合规定之健康山羊，每只重约20Kg，采取腹股沟、颈背、腹腔 等多点皮下注射，共8～12点，每周免疫1次，共免疫4次。首次免疫抗原 10～30毫克/次，加等量完全福氏佐剂；第2次免疫：抗原10～30毫克/次， 加等量不完全福氏佐剂；第3、4次免疫：单用抗原50～100毫克/次。用皮 试法检查山羊的致敏状态。
3.制备肿瘤特异性转移因子：
将经肿瘤抗原免疫的山羊脾脏、淋巴结处理干净，绞碎匀浆，冻于-20～ -70℃低温下并于20～30℃温度下融化、如此反复冻融2～5次，对生理盐水 透析(5000～14000D透析袋)、在温度2～10℃条件下，收透析外液，无菌 抽滤，定性定量，并做生物活性检测，分装。
本发明的特点：1.制备过程采用二次离心，可提高抗原的纯度；2.配 制的匀浆液利于抗原的释放溶解及保护抗原的完整性；3.免疫的次数及用 量既可保证肿瘤特异性转移因子的质量又能提高其产量；4.透析条件能提高 肿瘤特异性转移因子的纯度。
本发明的优点：肿瘤特异性转移因子本身不具免疫原性，可长期反复注 射，使用安全、效果明显，是目前预防和治疗恶性肿瘤的一个安全有效实用 的新方法新技术，具有广泛的市场应用前景及一定的社会价值。且对于消化 系统肿瘤、肺癌、肾癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、颅内易复发性肿瘤等均有 较好疗效。
本发明的实施例：
1.制备抗原：收集手术切下的新鲜癌标本，剔除癌灶周围的正常组织， 以PH7.4，20mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)-1mmol/L乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-2Na)缓冲液清洗、浸泡、匀浆分散，在4℃、7000转/分钟条件 下离心30分钟；收上清，再次在4℃、12000转/分钟条件下离心50分钟， 收上清液除菌，留少部分测蛋白量，分装，-20℃冻存备用。
2.免疫动物：选择符合《实验动物管理规程》山羊，每只20公斤， 采用腹股沟、颈背、腹腔等多点皮下注射，共8～12点、每点0.5毫升，每周 免疫1次，共免疫四次。首次免疫取20毫克/次癌抗原加等量完全福氏佐剂； 第二次免疫取20毫克/次癌抗原加等量不完全福氏佐剂；后二次免疫用80 毫克/次癌抗原。用皮试法检查山羊的致敏状态。
3.制备肿瘤特异性转移因子：取经免疫的山羊脾脏、淋巴结，剪除包 膜、脂肪、纤维组织、用灭菌生理盐水反复洗涤后剪碎，匀浆，-70℃至30 ℃反复冻融5次，镜检破碎细胞达90％以上，离心弃沉淀取上清液，收上 清液装透析袋4℃生理盐水透析30～40小时，透析袋分子量5000D以下， 收透析外液过滤除菌，以最高吸收峰处(251nm)8.0abs为1个肿瘤特异性 转移因子单位(单位/毫升)，按生物制品分装规程分装，每支2毫升含2单位。
肿瘤特异性转移因子成品检定：
外观：无异物无沉淀无色或淡黄色透明、澄清的液体
无菌试验：按2000年版二部《中国药典》附录XIH检查，应符合定。
PH值：PH6.0～7.2，依2000年版二部《中国药典》附录VIH检查，应 符合规定。
多肽含量：Folin-酚法，1.0～1.5毫克/毫升
核糖含量：3.5-二羟甲苯比色法0.6～0.7毫克/毫升
E252±2nm：有特征吸收峰
E250nm、1cm：15～18
E260/280nm：E260/280＝2.0～2.3
蛋白质：取本品2毫升加20％磺基水杨酸2毫升振摇，不得产生浑浊
热源：按2000年版二部《中国药典》附录XIE检查，应符合规定
过敏试验：取体重250～350克的健康豚鼠5只，连续次隔日腹腔注射本 品0.5毫升，放置2周后，再自股静脉注射本品1.0毫升，注射后15分钟内，观察 动物不得有连续次干咳、连续3次前爪抓鼻、明显竖毛、四肢发软、躺卧、 呼吸困难、痉挛、虚脱及死亡等现象。
异常毒性：取体重17～20克的健康小白鼠5只，分别由尾静脉注射本 品0.5毫升，72小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重18～19克的小 鼠10只复试，全部小鼠在72小时内不得有死亡。
急性毒性试验：小鼠40只，随机分成二组。一组肌肉注射20毫升/公 斤受试药(分二次给药)，另一组一次性静脉注射30毫升/公斤受试药，受 试药量分别相当于临床成人拟用剂量的250倍和375倍，连续观察7天。结 果表明：40只小鼠全部存活，给药后亦未观察到明显的毒性反应。小鼠生 长良好，饮食如常，体重增加，行为活动未见异常，毛色光滑。试验结束， 将小鼠脱颈处死尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，未见明显 病理变化。
活性测定及结果：
E-玫瑰花结实验：取相同小试管4支，2支分别加入Hanks液0.2毫 升作对照管，另2支分别加供试液0.2毫升作测定管。每管加入淋巴细胞悬 液0.1毫升，混匀，置37℃恒温水浴活化60分钟。取出，离心(200g，10 分钟)，弃去上清液，加0.5％绵羊红细胞悬液0.1毫升，摇匀。置37℃温育 10分钟，离心(100g，5分钟)，弃去上清液，将细胞轻轻水平旋转混匀， 加固定液0.1毫升，轻轻混匀。置4℃冰箱15分钟。取出，每管取1滴分别 置于载玻片上，用预先布匀染色液的盖玻片复盖于待染液滴上染色。用高倍 镜镜检计数。凡淋巴细胞表面粘附4个以上绵羊红细胞者，即计算为玫瑰花 结细胞的百分率，求出各组的平均值。结果：样品管的活性玫瑰花结百分率 比对照管的活性玫瑰花结百分率提高10％以上。
MTT-LAI实验：实验分组：对照组为单加培养液、单加普通转移因子、 单加肿瘤抗原及普通转移因子+肿瘤抗原；实验组为肿瘤特异性转移因子+ 相应肿瘤抗原。实验步骤：将小鼠脾淋巴细胞用含10％小牛血清的 RPMI-1640液稀释成1×106个/毫升，于96孔细胞培养板中每孔加入细胞液 100微升。按实验分组向每孔再加入培养液或各样品。加样完毕，将孔板于 37℃培养2.5小时，翻转孔板，弃去孔内上清。然后向各孔内加入180微升 不含小牛血清的RPMI-1640液和20微升的MTT溶液(5毫克/毫升)，37℃ 再孵育4小时。离心(1000g，15分钟)微孔板，弃上清，每孔加入200微 升二甲基亚砜以溶解细胞内形成的蓝色化合物(Formazan)，室温放置15分 钟。于ELISA-reader DYNATECH MR4000 570nm比色。每组设复孔三份。 粘附抑制指数按下式计算：
结果：肿瘤特异性转移因子+相应肿瘤抗原组的白细胞粘附抑制效应 (LAI指数％)远高于其它各对照组(P＜0.01)，结果相差非常显著，提示肿瘤 特异性转移因子转移的LAI效应是针对相应肿瘤抗原的。说明：肿瘤特异性 转移因子+相应肿瘤抗原，如胃癌特异性转移因子+胃癌抗原、肺癌特异性转 移因子+肺癌抗原、乳腺癌特异性转移因子+乳腺癌抗原等等。