技术领域
本发明涉及一种生物型杀菌制剂，具体地说，涉及一种用于预防和治 疗奶牛子宫内膜炎的生物制剂及其制备方法。
背景技术
子宫内膜炎是养牛业中常见的生殖器官疾病，是造成母牛不孕的主要 原因之一。严重地影响牛的繁殖和经济效益。其主要病因是人工授精、分 娩或助产时消毒不严，产后护理不当等侵入细菌引起感染，此外阴道炎、 子宫脱出、胎衣不下以及布氏杆菌病等，都可继发子宫内膜炎。其主要症 状有：急性一般发生与流产后或产生胎衣不下时，体温升高，食欲减退， 精神沉郁。严重时，拱背，努责，常作排尿状，慢性由急性继发而来，发 情周期不正常。
奶牛子宫内膜炎发病率一般在30％以上，可见患牛比例大，难孕牛 较多。在其主要的致病物质中多为细菌、病菌、真菌、支原体混合感染造 成。其中主要的细菌有链球菌占48.89％、大肠肝菌：26.7％，葡萄球菌 13.3％，其次是螺形杆菌，棒状杆菌及其它细菌。
目前国内外对奶牛子宫内膜炎的治疗仍以抗生素为主，但是抗生素治 疗存在许多不利因素。如(1)容易使细菌产生耐药性；(2)单一药物抗 菌谱不广；(3)容易造成抗生素残留；(4)其它副作用。“有抗奶”主要 来自奶牛饲料添加剂中使用抗生素或治疗奶牛临床型、隐性型乳房炎和奶 牛子宫内膜炎等疾病的治疗过程中使用青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉 素、新霉素等，将这些使用过抗生素的奶牛所挤出的牛奶混入食用牛奶中 造成的后果是极其严重的。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO) 建议，在奶牛接受抗生素治疗停药后至少3天(最好停药5-7天)内挤出 的奶汁不直接作为食用的奶原料。存在于奶中或肉内的残留物，可引起人 们的过敏反应，也可使人发生皮疹等。抗生素在奶中的残留，作为重大的 社会公害，在欧美国家早已禁止上市，且实施残留期挤出的牛奶全部丢弃 的管理办法。如美国的食品和药品局(F.D.A)规定，每毫升牛奶中的抗 生素的含量不得超过0.006国际单位，使用抗生素的牛奶在96小时内应废 弃。目前各国颁布的《食品卫生法》均规定，使用抗生素治疗乳房炎的牛 奶，5天内不得作为食品销售。发达国家还对各场产鲜奶每月抽查一次， 如发现残留抗生素者罚，同时规定兽医使用抗生素时必须告之畜主不得将 鲜奶出售食用的期限，否则一旦查出兽医应负责任。
中医、中兽医学应用天然药物(中草药)来治疗人类和动物的疾病， 现被誉为天然医学。如CN1302634A(治疗子宫炎症的药)，但是由于中药 的药效作用慢，以致病情迁延不愈，或反复发作，因而临床使用效果并不 好。
US 4692452(Method for treatment of endometritis in mammalian females)，报道了用化学制剂治疗动物(尤其是奶牛)的子宫内膜炎，但 是化学制剂往往对子宫内膜具有刺激性，会造成子宫内膜纤维化，以致于 形成疤痕，不利于奶牛进一步的配种受孕。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于奶牛子宫内膜炎的生物 杀菌制剂及其制备方法，以克服现有技术存在的杀菌效果不理想，细菌易 产生耐药性，易产生药物蓄积和残留，病情易反复发作并影响后续的受孕 配种的缺陷。
本发明提供了一种生物制剂，该制剂包括溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)、 溶菌酶(Lysozyne)、抑菌肽(Antimicrobial Peptide)和医学上可接受的载 体。
其中的溶葡萄球菌酶为野生类型、重组产生、突变异种或保留抗葡萄 球菌细胞壁肽聚糖的含甘氨酸交联键的任何重组或有关的酶中的一种或一 种以上；溶葡萄球菌酶来源于Staphylococus Simulans分泌于胞外的蛋白产 物，其基因的核酸组成有1486个核苷酸；蛋白分子量6803Da，由244个 氨基酸组成，WO0129201(Expression of recombinant muture lysostaphin) 和DE4425645(New lysostaphin gene with deletion in pro-segment repeat region)分别报道了重组的溶葡萄球菌酶和突变的溶葡萄球菌酶，但是其 杀菌活性保持不变。溶葡萄球菌酶的杀菌机理是通过专一性的切断胞壁肽 聚糖中的甘氨酸键，达到快速杀死致病菌的效果。所用的溶葡萄球菌酶是 上海高科生物工程有限公司通过基因重组技术产生，由枯草杆菌扩增分泌 的，其酶的比活性范围为300-1200单位/毫克。
溶菌酶为细菌胞壁溶解酶、酵母菌胞壁溶解酶、霉菌胞壁溶解酶中的 一种或一种以上；所用的溶菌酶是从蛋清中提取的活性成分，是符合中国 药典标准的原料药，溶菌酶是通过作用于胞壁中的β-1，4糖苷键或β-1，3 葡聚糖而杀死细菌。
抑菌肽是从动植物或微生物中提取的天然抑菌肽或通过固相化学法或 基因工程技术生产的具有杀菌作用的多肽，所用的抑菌肽是上海高科联合 生物技术研发有限公司采用固相化学合成法，用多肽合成仪合成的GK-1 号多肽，所述及的抑菌肽的详细资料可参见CN1398897A。小分子多肽具 有分子量小，杀菌渗透性强，毒副作用小的特点，抑菌肽的杀菌机理是通 过在细菌的细胞膜上穿孔而发挥作用。
其中溶葡萄球菌酶的重量百分比含量为0.001-10％；
溶菌酶的重量百分比含量为0.01-30％；
抑菌肽的重量百分比含量为0.0001-10％。
优选的重量百分比含量为溶葡萄球菌酶为0.001-5％，溶菌酶为0.1- 10％，抑菌肽为0.01-1％。
该复配制剂中还包括重量百分比含量为0.2-60％的蛋白质稳定剂和重 量百分比含量为0.5-50％的渗透促进剂。
蛋白质稳定剂是聚乙二醇类物质或壳聚糖、甲壳素、N-乙酰-D-氨基 等药用高分子化合物，可以包裹蛋白质或多肽，免受其他物质的破坏，从 而增强蛋白质或多肽的稳定性。
渗透促进剂包括乙醇、饱和或不饱和脂肪酸及其酯、表面活性剂、螯 合剂中的一种或几种，不仅可以增强制剂向子宫内膜的渗透，增强其杀菌 作用的有效发挥，而且可增强生物酶的稳定性。
其中所述及的聚乙二醇类物质包括是聚乙二醇400、聚乙二醇1000、 聚乙二醇1500、聚乙二醇4000或聚乙二醇6000中的一种或一种以上。
饱和或不饱和脂肪酸及其酯包括月桂酸、肉豆蔻酸、月桂酸酯中的一 种或一种以上。
表面活性剂包括吐温(Tween)、胆盐、司盘(Span)中的一种或一种 以上。
螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸 铁钠等。
该制剂可做成水剂、粉剂、栓剂、膜剂、凝胶、软膏或乳膏剂。根据 不同剂型的需要，制剂中需添加不同的基质或载体，其中基质或载体的百 分比含量均是医学上常见的剂量。
栓剂常用的基质为半合成脂肪酸甘油酯、可可豆油、聚氧乙烯硬脂酸 酯、氢化植物油、甘油明胶、聚乙二醇类中的一种或一种以上。
膜剂中需加入一种或几种成膜材料，成膜材料可为天然或合成高分子 化合物，如淀粉、糊精、纤维素、明胶、琼脂、甲壳素、纤维素衍生物、 聚乙烯胺类、聚乙烯醇、羟丙纤维素等，还可加入增塑剂如甘油、山梨醇 等。
凝胶中所用的基质可为甘油明胶、淀粉、纤维素衍生物、聚乙二醇中 的一种或一种以上。
软膏中加入的基质可为羟类、油脂类或类脂中的一种或一种以上，其 中羟类如凡士林、固体石蜡、液体石蜡、硅酮等；油脂类如花生油、棉子 油、氢化植物油等；类脂如羊毛脂、蜂蜡、胆固醇等。
乳膏剂中加入的乳化剂可为天然乳化剂或合成乳化剂中的一种或一种 以上，其中的天然乳化剂如阿拉伯胶、动物胶、海藻酸盐、卵磷脂等；合 成乳化剂如纤维素衍生物、硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯类、吐温(Tween) 等。
本发明还公开了该制剂的制备方法，根据不同的剂型，将采取不同的 制备方法，但是总体的制备方法就是将几种成分，根据其比例，混合均匀， 待成型后即可用。水剂可直接灌注到子宫内，粉制剂用蒸馏水或纯净水稀 释后直接灌注到子宫内，栓剂等则直接从阴道塞进子宫内。
该制剂具有如下特点：
1.杀菌效果强，杀菌谱广。该制剂对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以 及部分病毒和真菌均有效，尤其是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌(无 乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌)、克雷伯氏杆菌、表皮葡萄球菌、 绿脓杆菌、白色念珠菌等，体外实验作用5分钟即可达到99.9％的杀菌率， 如果作用10分钟甚至20分钟，可使杀菌率达到100％，上述细菌均是奶 牛子宫发生感染时常见的细菌。(见表1～4)。
2.几种生物制剂复配，稳定性强，54℃存放2周杀菌活性不变。本发 明是首次将生物酶和小分子抑菌肽进行复配，不仅保留了各自的杀菌活 性，而且因为各种成分之间可以互相作用，实验证明，复配后不仅杀菌活 性较三者各自的杀菌活性大大增强(10-40倍于三者杀菌效果的简单叠 加)，而且使生物酶的稳定性增强，54℃存放2周后(相当于常温保存两 年)，该制剂对金黄色葡萄球菌的杀菌活性保持不变，仍在99.9％以上，作 用20分钟即可达100％。(见表5)。
3.本发明为纯生物制剂及医学上可接受的载体，克服了传统化学类制 剂对子宫粘膜具有刺激性，细菌容易产生耐药性的缺点。易被机体所接受， 且没有任何毒副作用。经上海市疾病预防控制中心消毒科进行的急慢性毒 理试验结果显示，该制剂为无毒无刺激的产品。
4.本发明中将生物酶和抑菌肽首次用于奶牛子宫内膜炎的预防和治 疗，可避免传统的抗生素治疗奶牛子宫内膜炎对奶牛本身和牛奶所造成的 影响，避免“有抗奶“对人类身体健康的影响，并且可以节约成本，具有 广阔的市场前景和应用前景。
5.本制剂采用局部用药的方式，较常用的全身性治疗具有治疗作用快， 毒副作用小的特点，且使用方便，易于被兽医和奶牛所接受。
6.本发明的制剂不仅可用于预防和治疗奶牛的子宫内膜炎，还可以用 于预防和治疗奶牛或其他动物的急慢性乳腺炎、阴道炎、口蹄疫、口腔炎、 皮肤溃疡、皮肤外伤、全身性感染、外耳道炎症等细菌感染性疾病。
附：一.杀菌实验数据：
表1对金黄色葡萄球菌的杀灭效果
稀释浓度 作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围
(％) 2 5 10 20
原液 99.83 99.97 100 100
(99.82-99.84) (99.96-99.98)
50 99.25 99.83 99.92 99.99
(99.19-99.31) (99.82-99.84) (99.90-99.94) (99.99-100)
25 98.05 99.34 99.70 99.96
(97.80-98.30) (99.31-99.38) (99.68-99.71) (99.95-99.98)
注：阳性对照组平均菌数及范围为7.25×105cfu/片(7.15-7.35×105cfu/片)
阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细菌生长。
表2对大肠杆菌的杀灭效果
稀释浓度 作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围
(％) 2 5 10 20
原液 99.73 99.95 99.99 100
(99.70-99.77) (99.95-99.96) (99.99-100)
50 99.28 99.67 99.89 99.94
(99.23-99.31) (99.64-99.70) (99.88-99.90) (99.94-99.95)
25 97.02 98.98 99.4 1 99.83
(96.83-97.21) (98.87-99.08) (99.36-99.48) (99.82-99.84)
注：阳性对照组平均菌数及范围为6.00×105cfu/片(5.80-6.20×105cfu/片)
阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细菌生长。
表3对链球菌的杀灭效果
稀释浓度 作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围
(％) 2 5 10 20
原液 99.88 99.96 100 100
(99.87-99.89) (99.96-99.96)
50 99.53 99.89 99.99 100
(99.49-99.57) (99.88-99.90) (99.99-99.99)
25 98.92 99.59 99.79 99.98
(98.84-99.01) (99.56-99.63) (99.75-99.81) (99.98-99.98)
注：阳性对照组平均菌数及范围为7.00×105cfu/片(6.80-7.20×105cfu/片)
阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细菌生长。
表4对克雷伯氏杆菌的杀灭效果
稀释浓度 作用不同时间(min)的平均杀灭率及范围
(％) 2 5 10 20
原液 99.87 99.95 99.99 100
(99.86-99.91) (99.94-99.97) (99.99-100)
75 97.95 99.88 99.97 99.99
(97.85-98.08) (99.86-99.95) (99.96-99.99) (99.99-100)
50 92.05 99.03 99.89 99.99
(91.94-92.84) (98.98-99.07) (99.86-99.93) (99.99-99.99)
注：阳性对照组平均菌数及范围为1.86×106cfu/片(1.82-1.89×106cfu/片)
阴性对照组：中和剂、PBS、培养基无细菌生长。 二.稳定性试验
表5 54℃存放2周后对金黄色葡萄球菌杀灭效果
保存温度 对照组平均菌落数 作用不同时间(min)平均杀灭率及范围(％)
及时间 及范围
(℃、d) (cfu/片) 2 5 10 20
54 14 5.80×105 99.69 99.93 99.98 100
(5.70-5.90×105) (99.69-99.70) (99.93-99.94) (99.97-99.99)
注：阴性对照组无细菌生长。 三.毒理实验(检测单位：上海市疾病预防控制中心消毒科)
1、急性经口毒性试验：
小鼠LD50＞5000mg/kg
属实际无毒级
2、皮肤刺激试验：属无刺激性。
3、阴道粘膜刺激试验：属无刺激性。
4、眼刺激试验：属无刺激性。
5、蓄积毒性试验：蓄积系数K＞5，属弱蓄积性。
6、微核试验：无致微核作用。 四.临床实验
在上海、天津、北京、广州、沈阳、武汉等20多个地区临床试用效果 显示：产后奶牛连续应用2-3次，临床有效率达90％左右。
具体实施方式
实施例1
溶葡萄球菌酶 0.01克
溶菌酶 2克
GK-1号抑菌肽 0.5克
甲壳素 2克
EDTA 20克
将上述物质用蒸馏水或纯净水稀释到100毫升，即成可直接灌注到子 宫内的水制剂。
实施例2
溶葡萄球菌酶 0.01克
溶菌酶 1克
GK-1号抑菌肽 0.05克
醋酸氯己定 0.03克
单硬脂酸甘油脂 5克
壳聚糖 1克
将上述物质混合，分剂量包装，为粉制剂。使用时，再用蒸馏水或纯 净水将之稀释到100-200毫升，即成可直接灌注到子宫内的水制剂。
实施例3
溶葡萄球菌酶 10克
溶菌酶 0.05克
GK-1号抑菌肽 0.2克
甘油 1克
Tween 2克
聚乙二醇1000 20克
聚氧乙烯硬脂酸酯 50克
水 适量
将上述物质混匀，可做成栓剂。