技术领域
本发明涉及一种水产动物的人工授精，特别是涉及一种适用冷冻保存或者活力较差的水 产动物精子的自由扩散人工授精法。
背景技术
随着现代生物技术的发展，人们越来越多地使用精子冷冻保存的方式来使得时间上或地 点上隔离的精子和卵子能够正常授精，这种方法在水产动物的繁殖操作中尤其常用。但在实 际操作时常出现卵子的授精率和孵化率普遍降低的现象。众多科研人员从精子冷冻保存液的 配方入手以期提高授精卵的授精率和孵化率，但改良精子冷冻保存液配方也只能小幅度地提 高授精卵的授精率和孵化率。另一个值得关注的是人工授精的方法。目前常用的授精方法有 以下几种：1、干法授精，将水浴解冻后的精液与卵子混合，当精子与卵子混合充分后再加入 海水(适用于海水生物，下同)或淡水(适用于淡水生物，下同)激活精子，同时完成授精； 2、半干法授精，将水浴解冻后的精液直接用海水或淡水混匀、激活，再加入新鲜的卵子完成 授精；3、湿法授精，将水浴解冻后的精液直接用海水或淡水混匀、激活，同时将新鲜的卵子 用海水或淡水激活，最后将激活后的精子与卵子混合完成授精。以上3种方法中都忽略了经 过冷冻保存后精子的活力不同程度有所降低这一现象。根据对实验结果的分析我们认为，解 冻后的精液中存在大量受损或不健全的精子，这些精子若与正常的卵子相遇，可能导致卵子 无法正常授精并且使卵子失去与正常精子再结合的能力，这是导致冷冻保存后的精子与卵子 结合授精率孵化率降低的主要原因之一。在这种观点的指导下，我们发明了自由扩散的人工 授精法。
王鑫在公开号为CN1415194的发明专利申请中提供一种杂交蛙人工繁殖的方法，首先选 择一种(含一种)以上的纯种性成熟的雄蛙剖腹取出其睾丸，置于盛有生理盐水的器皿中，用 工具挑去其皮膜，夹破睾丸，释放精子，制得精子混悬液；再选择另外一种不同于上述任何 一种蛙种的、性成熟的雌蛙剖腹取出其卵巢，置于盛有生理盐水的器皿中，用工具挑去其外 的皮膜，释放卵团，待卵团分裂后，即滴入上述制得的精子混悬液，使卵受精；最后将受精 卵移入孵化池或孵化箱中进行胚胎发育和孵化。
中国科学院海洋研究所在公开号为CN1418542的发明专利申请中提供一种橘红壳色皱纹 盘鲍新品系的制种方法，利用皱纹盘鲍橘红壳色突变体间的单交或群交，获得壳色性状一致 的皱纹盘鲍新品系；可按如下步骤操作：1)种鲍选择：取自然地理群体或人工繁育群体中的 性成熟皱纹盘鲍橘红壳色突变体作为种鲍；2)种鲍促熟：取大小为中等偏上的性成熟个体， 置于16～20℃的海水中，培育密度为25～80枚/m3，饲以天然饵料，每天全量换水一次，充 天然空气，有效积温900～1400度·日，培育环境照度为20～100Lux，至性腺发育成熟；3) 催产：将性腺发育成熟的个体采用阴干、升温和紫外线照射海水刺激方法进行催产，具体为： 在18～20℃、空气湿度为50～90％的条件下阴干60～120分钟，然后将雌雄种鲍分别置于 不同的容器内，雌雄个体严格分离，注入升温至22～23℃、照射强度为300～1000mwh/L的 紫外线处理海水，40～90分钟后可获得雌雄配子；4)将分别获得的雌雄配子以单交或群交 方式进行人工授精；5)按常规孵化及后期培育方法即可获得橘红壳色皱纹盘鲍新品系苗种。
董文治在公开号为CN1135834的发明专利申请中提供一种人工杂交和驯养家鲫鱼的方 法，选用健康无病、性成熟的父本鱼和母本鱼，然后对母本鱼进行人工催产，采用人工方法 授精，脱粘流水孵化，待孵化的幼鱼长出腰点时下塘，进行颗粒饵料驯化培育，父本鱼选用 红鲫鱼，母本鱼选用锦鲤鱼。
湖南师范大学和湘阴县东湖渔场在公开号为CN1263704的发明专利申请中提供一种四 倍体鱼的培育方法，以红色鲫鱼为母本，湘江野鲤为父本，用人工授精方法获得杂交一代F1， 选择4.67％可育的F1代雄性个体的精子，用人工授精的方法，与F1代的卵子结合，获得 F2代，在F2代的雄性个体中，选择二倍体的大头精子，以及经二倍体精子诱导雌核倍加的 卵子，用人工授精的方法，使二倍体的精子与二倍体的卵子结合，从而获得异源四倍体鱼。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的水产动物人工授精方法忽略了经过冷冻保存后精子的活力 不同程度有所降低这一现象等问题，提供一种采用与其他3种人工授精法有本质区别的自由 扩散人工授精法。
本发明的步骤如下：
1)将冷冻保存的水产动物精液从液氮或冰箱中取出并解冻，谨防精液遇水激活；
2)用柔软物体将精液迅速、均匀涂抹在湿润的容器底部，防止操作过程中精液受到机械 损伤或干燥；
3)在精液中加入淡水或海水将精子激活，操作过程要防止淡水或海水将精液冲起；
4)健康的精子将迅速游到溶液中，将上层含有健康精子的溶液倒出与新鲜卵子混合，完 成授精；
5)授精结束后，用海水漂洗授精卵，洗去多余精液。
所述的柔软物体可采用羽毛等。在精液中加入淡水或海水的数量按体积比精液∶淡水或 海水＝1∶(100～200)，在将精子激活的过程中最好静置片刻，操作过程要防止淡水或海水 将精液冲起，静止放置的时间随精子种类的不同而不同。
由于经过冷冻保存的精子其活力有不同程度的降低，受损或不健全的精子若与正常的卵 子相遇，可能导致卵子无法正常授精并失去与正常精子再结合的能力，因此快速有效地区别 正常与不健全的精子是本发明的关键，正常与不健全精子的显著区别在于两者的运动能力不 同。由于采用羽毛等柔软物体将精液均匀涂抹在敞口的容器底部，加入水或海水将精子激活， 静置片刻，健康的精子将游到溶液中，因此再将上层精液倒出与卵子授精就可以显著提高授 精率和孵化率，特别是冷冻保存后活力较差的精液的授精率。
具体实施方式
实施例1
将装有1mL大黄鱼精液的冷冻管从液氮中取出，放置在室温海水中快速解冻。将解冻后 的精液倒在潮湿的容器底部迅速用羽毛涂匀。缓慢向容器中倒入150mL室温海水，静置2min。 将上清含有大量健康精子的海水缓慢倒入盛有新鲜卵子的容器中，轻轻搅拌完成授精。授精 后10min，用大量海水漂洗授精卵，洗去多余精液。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于将装有1mL大黄鱼精液的冷冻管从冰箱中取出，放置在室 温海水中快速解冻。将解冻后的精液倒在潮湿的容器底部迅速用羽毛涂匀。缓慢向容器中倒 入100mL室温淡水，静置3min。
实施例3
与实施例1类似，其区别在于将装有1mL大黄鱼精液的冷冻管从液氮中取出，放置在室 温海水中快速解冻。将解冻后的精液倒在潮湿的容器底部迅速用羽毛涂匀。缓慢向容器中倒 入200mL室温海水，静置3min。
实施例4
与实施例1类似，其区别在于采用其它水产动物，例如鲫鱼等。