技术领域
本发明属于药物制剂领域，特别涉及一种聚电解质修饰的氧化石墨烯用于抗癌药物口服转运的药物制剂及其制备方法。
背景技术
GO是亲水性物质，其表面具有羟基，羧基和环氧基团以及大量的含氧极性基团，是亲水性材料，表面改性的GO可在高盐溶液和生理溶液中稳定。GO结构中的碳原子与药物结构形成稳定的化学键，所以通过π-π共轭和疏水相互作用可以吸附大量的生物活性分子。目前，研究重点是GO的生物相容性，GO与机体之间的相互作用的机制仍处于起步阶段。GO在机体内具体的生理机制尚待进一步研究，特别是作为抗癌药物的口服载体，其在胃肠道的稳定性、生物相容性等方面的探究具有非常重要的意义。
大多数纳米给药系统经口服后，由于空间阻塞或黏附性而被黏液层截留，然后随着黏液层的更新在数分钟至数小时内被清除，严重影响制剂在局部的滞留时间。因此，纳米粒子必须避免黏蛋白纤维网的空间阻隔，渗透并穿过黏液层，才能到达胃肠道表面。
以壳聚糖为代表的聚电解质是一种十分有效的肠道吸收促进剂。其作用机制可能是其阳离子部分与细胞表面的糖蛋白阴离子部分相互作用，或与上皮紧密连接内部的负电荷区相互作用，导致紧密连接蛋白的结构重组而打开紧密连接。这类聚电解质与生物膜的黏附一般靠的是弱的非共价键。最近，研究人员将聚电解质与半胱氨酸(CYs)结合，这些结合在聚电解质上的CYs能与黏膜糖蛋白的CYs富集区域形成共价键结合，与原来聚电解质相比，巯基聚电解质具有毒性小、酶活性抑制更强的黏膜黏附能力、口服后不易被消化道吸收、能长时间发挥吸收促进作用等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚电解质修饰的氧化石墨烯用于抗癌药物口服转运的药物制剂及其制备方法，该方法操作简单，反应条件温和。能显著提高药物的载药率，稳定性好，起到了缓控释效果，借助PAA-CYs打开肠道黏膜上皮细胞间隙的紧密连接从而增加药物的细胞旁路转运，能够显著提高水溶性药物口服生物利用度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种聚电解质修饰的氧化石墨烯抗癌药物制剂，在负载抗癌药物X的氧化石墨烯GO表面依次包裹带正电荷的聚烯丙基胺盐酸盐PAH及带负电荷的聚丙烯酸PAA和半胱氨酸CYs，得到所述的聚电解质修的氧化石墨烯抗癌药物制剂PAA-CYs/PAH-GO-X。
优选的，上述的聚电解质修饰的氧化石墨烯抗癌药物制剂，所述的抗癌药物X为平阳霉素(PYM)或阿霉素(DOX)或紫杉醇(PTX)或阿法替尼(AF)。
聚电解质修饰的氧化石墨烯抗癌药物制剂的制备方法，制备方法包括如下步骤：
1)搅拌下，将氧化石墨烯GO的PBS溶液滴加到抗癌药物X的水溶液中，超声将抗癌药物X负载到氧化石墨烯GO上，10000rpm离心，除去游离的药物沉淀物，复溶后冻干，得到GO-X；
优选的，超声反应时间为5-60min；按质量比，抗癌药物X:氧化石墨烯GO＝1:(0.2-2)；离心时间5-30min。
2)将GO-X水溶液加热至45℃，加入聚烯丙基胺盐酸盐PAH和缩合剂EDC，搅拌反应，获得PAH-GO-X；
优选的，GO-X水溶液的浓度为0.5-3mg/mL。
优选的，每200mg GO-X加入78mg PAH。
3)调节聚丙烯酸PAA水溶液的pH，加入缩合剂EDC(碳二亚胺)，20-35℃，搅拌下，逐渐加入半胱氨酸Cys，将所得反应物透析，除去过量CYs，冻干，得到PAA-Cys；
优选的，调节聚丙烯酸PAA水溶液的pH为3.5-4.5；每1mol聚丙烯酸PAA加入10-20mol的缩合剂EDC，1-4mol的半胱氨酸CYs。
优选的，透析采用的透析袋为Mw＝8000Da，透析时间为每2h更换透析介质，透析48h。
4)将PAA-CYs与PAH-GO-X混合，在搅拌下，滴加少量冰醋酸，溶解后，加入到维生素E琥拍酸酯反应液中，加热搅拌反应1h，之后室温反应12h，得聚电解质修的氧化石墨烯抗癌药物制剂PAA-CYs/PAH-GO-X。
优选的，每200mg GO-X加入78mg PAA-Cys。
上述的聚电解质修的氧化石墨烯抗癌药物制剂PAA-CYs/PAH-GO-X在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明，以GO作为口服给药载体，依靠π-π共轭吸附作用，将抗癌药物装载于GO表面，GO巨大的比表面积能显著提高药物的载药率。同时，为了防止抗癌药物在消化道内被降解和破坏，利用层层自主装技术，在GO表面分别包裹带正电荷的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)和带负电荷的PAA-CYs，最终得到PAA-CYs/PAH-GO-X。
本发明的有益效果是：
1、本发明，聚电解质PAH和PAA-CYs以非共价键形式包裹在GO表面，不改变其原有物理化学及生物学性质。复合材料载药量高，生理溶液中稳定性好。
2、本发明，药物具有PH敏感的释放特性，聚电解质的双层包裹明显使PYM在强酸环境下的耐酸能力得到了改善，药物在胃中稳定，在肠道中释放，提高药物的靶向性，从而增强其抗肿瘤疗效。
3、本发明，PAA-CYs与肠黏膜上的糖蛋白形成的二硫键能提供较强的肠道黏附性，大大延缓了机体的清除作用。双层聚电解质包裹，显著提高药物在消化道内稳定性的同时，延缓了药物的释放速度，起到了缓控释效果。
4、本发明，PAA-CYs能够打开上皮细胞的紧密连接，增加粒子的细胞旁路转运，显著提高药物的口服生物利用度。
5、本发明，PAA-CYs是一种非常好的pH敏感型聚电解质肠道吸收促进剂，当外界环境pH>4.5时，PAA去质子化带负电荷，大量负电荷相互排斥，开始吸水发生显著溶胀产生黏性。PAA-CYs与黏蛋白混合后溶液黏度增加6倍，与PAA相比，PAA-CYs的黏膜黏附性提高25倍。
附图说明
图1为实施例1中PYM的标准曲线。
图2为实施例1中游离巯基的标准曲线。
图3为实施例1中PAA-CYs在扫描电子显微镜下的结构。
图4为实施例1中PAA-CYs粒径分布图。
图5为实施例1中PAA-CYs Zeta电位图。
图6为实施例2中PCPGP的粒径图。
图7为实施例2中PCPGP的Zeta电位图。
图8为实施例2中PCPGP的透射电镜图。
图9为实施例2中GO-PYM在不同pH介质中的释放曲线。
图10为实施例2中PCPGP在不同pH介质中的体外释放曲线图。
图11为实施例2中PYM、GO-PYM、PCPGP大鼠在体肠吸收试验。
图12为实施例2中空白血浆色谱图。
图13为实施例2中PYM和内标DOX的高效液相色谱图。
图14为实施例2中PYM体内药动标准曲线图。
图15为实施例2中大鼠口服灌胃PYM、GO-PYM、PCPGP后测得的药时曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但需要指出的是，本发明的保护范围不应受这些实施例的任何限制。
实施例1
(一)GO载药平阳霉素(PYM)
1、制备方法包括如下步骤：
1)称取200mg的氧化石墨烯GO于EP管中，加入100mL PBS缓冲液，通过超声使其充分溶解。
2)称取100mg PYM加入到盛有1000mL蒸馏水的烧杯中溶解。
3)在磁力搅拌的条件下，将EP管中的GO的PBS溶液滴入烧杯中的PYM的水溶液中，通过超声将药物负载到氧化石墨烯GO上。
4)溶液用高速离心机在10000rpm下高速离心20min，除去游离的PYM。收集下层沉淀物，并复溶，即可得到GO-PYM。
2、包封率的计算
GO-PYM载药体系的包封率，采用高效液相色谱法测定药物含量。
1)PYM液相色谱条件为：色谱柱：色谱柱为Waters Materials C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以己烷磺酸钠溶液(己烷磺酸钠钠7.53g和乙二胺四乙酸3.72g，加0.08mol/L醋酸溶液并稀释，加入氨水至1000mL并调整pH值4.3)为流动相A；甲醇-乙腈(7:3)为流动相B。流速：1.0mL/min；柱温：25℃；检测波长：291nm；进样量：20μL
2)PYM标准曲线的建立
精密称取PYM标准品20mg于500mL的容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度线，制备成浓度为40μg/mL的母液。将上述母液逐渐稀释成浓度为40μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.8μg/mL，0.4μg/mL，在1)的液相条件下进样分析，得到标准曲线：y＝28168x-1108.8，R＝0.9999，如图1。日内、日间精密度测量RSD值均小于2％，说明方法精密度良好。方法回收率在95％-105％的区间，且RSD值也符合要求，说明此方法的可行性。
3)包封率测定：取已知体积的上清液置于25mL容量瓶中，加水至刻度线，并取1mL置于10mL的EP管中待测定。在2.3.1的高效液相色谱条件下进行测定，记录数据，并代入标准曲线公式，计算出的上清液的药物浓度为C1，总药量则为C0。包封率按照如下公式计算。
包封率(EE)＝(C0-C1)/C0×100％
3、GO-PYM的处方工艺考察
以包封率为考察指标，将GO-PYM的制备过程进行优化筛选。通过单因素考察(超声时间和药质比)来确定载药试验的最佳处方工艺。
1)超声时间对包封率的影响
如表1改变制备方法中步骤3)的超声时间，并分别做4批次。在试验的超声环节，通过选择不同的超声时间，分别为(5min，15min，30min和60min)。超声结束后将各溶液以10000rpm离心20min，取上清液并测定其药物含量以计算试验包封率。其包封率结果如下表1。
表1超声时间对药物包封率的影响
由表1可知，超声时间对于载药的包封率有显著的影响，超声时间为30min时，达到最大包封率，因此选用超声时间为30min。
2)药物/载体比例对包封率的影响
如表2改变PYM和GO的质量比，并分别做4批次。在试验的投料环节，通过选择不同的药物/载体比例分别为(1:2,1:1,1:0.5,1:0.2)。超声30min，将各溶液以10000rpm离心20min，取上清液并测定其药物含量，并计算包封率。其包封率结果如下表2。
表2药质比对药物的包封率和载药量的影响
由表2可见，在药物与载体的质量比为2:1时，包封率为82.05％，达到良好的载药效果，故选择药物与载体的质量比为2:1为最佳处方工艺。
(二)巯基修饰的聚丙烯酸(PAA-CYs)的合成及表征
1、PAA-CYs的制备
1)将720mg(0.01mol)PAA溶于10ml水中，调节PAA水溶液的pH到3.5，再加入1910mg碳二亚胺(EDC)(0.1mol)。
2)将反应混合物在20-35℃下，磁力搅拌器搅拌15min，并逐渐向混合物中加入1210mg的CYs(0.01mol)，反应过程中搅拌不停止。
3)所得反应物放入处理后的透析袋内，然后将透析袋放入盛有0.2mmol/L盐酸的大烧杯中，将大烧杯放入磁力搅拌器下搅拌透析2h，然后将透析液换成蒸馏水，继续透析，每隔2h换一次透析液，共透析48h。
4)最后将产物冻干，将冻干粉末于4℃的环境下储存，备用。
2、PAA-CYs的合成条件的优化筛选
通过上述的PAA-CYs的制备，将其中的EDC的量，pH的条件，温度以及CYs的量分别作为变量，进行合成条件筛选，具体参数如下表3。二硝基苯磺酸(TNBS)测共轭物中游离的CYs的含量；Ellman试剂反应，二硝基苯甲酸(DTNB)在紫外下测得PAA-CYs中游离的巯基的含量，最后用马尔文激光粒度分析仪测共轭物的粒径及Zeta电位大小来检验聚合物是否稳定，从而选出最优的制备工艺。
表3PAA-CYs高分子聚合物的制备
2.1TNBS测游离CYs
将制得的PAA-CYs 100mg溶于10mL溶剂中，分别取不同体积溶液于试管中。向每个试管里加入蒸馏水1mL。将每个试管里加入1mL的硼酸缓冲液(0.1mol)，最后向每个试管里加入1mL的TNBS溶液，将溶液混匀并在温水浴40℃下反应100min，在420nm紫外下测得光谱。
对7组方法分别进行游离CYs检测，当透析时间为48h时，几乎测不到各组中有游离的CYs。此结果说明透析时间为48h最佳，可以将混合物中的游离CYs等小分子物质更彻底的透析除去。
2.2游离巯基含量的测定：
1)三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-Hcl)缓冲液(0.25mol/L)：称取3.0285g三羟甲基氨基甲烷，加入蒸馏水，用盐酸调节pH为8.3定容至100mL；
2)CYs标准溶液(0.2mol/L)的配制：准确称取2.42g CYs(MV＝121)，用1mL甲酸溶解，用DDW定容至100mL。
3)DTNB(Mw 396.35)标准溶液(0.1mol/L)的配制：准确称取1.9817g的DTNB，用50mmol Na2HPO4(PH＝7.0)配制成50mL Ellman溶液，存放于棕色瓶中，放于暗处低温的环境下保存备用。
4)用Tris缓冲液稀释CYs标准溶液配制成浓度梯度分别为0.025mol/L，0.05mol/L，0.075mol/L，0.1mol/L，0.125mol/L的标准溶液。取上述各浓度溶液1mL分别加入到5mL的预先恒温于25℃水中的Ellman溶液溶液中，摇匀，静止10min，于412nm处测定其吸光度值(A)。计算得到游离巯基的标准曲线y＝4.616x+0.1138，R＝0.99916。如图2。
按照上述方法测定，计算得到PAA-CYs上游离的巯基的浓度如表4所示：
表4PAA-CYs上游离的巯基的浓度
由表4可以看出，7组所得游离的巯基并无太大差别，故选用更经济的方法，即E组制备PAA-CYs要在pH为4.5的弱酸环境下，加热至35℃，加入1.91g的EDC活化羧酸根离子，并且PAA与CYs的加入的摩尔比为1:1，所制得的PAA-CYs的制备工艺为最优方案。
2.3PAA-CYs的表征与实验结果
PAA与CYs之间的共价结合是通过CYs上的氨基与聚合物上的羰基形成酰胺键而完成的。获得的产物是白色的并且成纤维状结构。
1)扫描电镜
将样品分散在DMSO溶液中，浓度为0.1mg/mL，然后滴入溶解的分散液，通过离子溅射仪对表面进行喷金处理后观察。扫描电镜的加速电压为8.0kv。如图3所示。从图中可以看出，PAA-CYs在未经染色的情况下，是白色的类球状的结构且连接紧密，这与PAA-CYs的理论结构相一致。
2)Zeta电位与粒径
称取PAA-CYs置于EP管中，加入蒸馏水使之充分溶解，测粒径及Zeta电位，如图4、图5所示，平均粒径在300nm左右，Zeta电位平均值在-39mV左右。
实施例2PAA-CYs/PAH-GO-PYM(PCPGP)的合成
(一)PAA-CYs/PAH-GO-PYM的合成方法
1)称取200mg的氧化石墨烯GO于EP管中，加入100mL PBS缓冲液，通过超声使其充分溶解。称取100mg PYM加入到盛有1000mL蒸馏水的烧杯中溶解。在磁力搅拌的条件下，将EP管中的GO溶液滴入PYM的烧杯中，超声30min，所得溶液用高速离心机在10000rpm下高速离心20min，除去游离的PYM。收集下层沉淀物并复溶后冻干得到GO-PYM。
2)称取GO-PYM 200mg溶于90mL蒸馏水中，加热至45℃，加入78mg聚烯丙基胺盐酸盐PAH和1910mg缩合剂EDC，搅拌反应，通过透析法将溶液透析36h，获得PAH-GO-PYM；
3)将720mg(0.01mol)PAA溶于10ml水中，调节聚丙烯酸PAA水溶液的pH为4.5，加入1910mg(0.1mol)缩合剂EDC(碳二亚胺)，35℃，搅拌下，逐渐加入1210mg(0.01mol)半胱氨酸Cys，反应物透析除去过量CYs，冻干，得到PAA-Cys；
所述的透析采用的透析袋为Mw＝8000Da，透析时间为每2h更换透析介质，透析48h。
4)将78mg PAA-CYs与步骤2)获得的PAH-GO-PYM混合，在搅拌下，滴加少量冰醋酸，使之溶解后，加入到500ml维生素E琥拍酸酯反应液中，70℃加热搅拌反应1h，之后室温反应12h，得聚电解质修的氧化石墨烯抗癌药物制剂PAA-CYs/PAH-GO-PYM(PCPGP)。
(二)粒径与Zeta电位
将PAA-CYs/PAH-GO-PYM溶解于蒸馏水中，振摇混匀。测量粒径和Zeta电位以及PDI值。结果如下图6、图7所示。由图可知，PAA-CYs/PAH-GO-PYM的粒径在750nm左右，且PDI值约为0.23，小于0.3，粒径均匀，分布良好。Zeta电位为-34.1mV，说明表面带有负电荷能侧面说明制剂外层为PAA-CYs显负电性。并且其绝对值大于20mV，由于具有较大的静电斥力，药物粒子不易聚沉，因此稳定性良好。
(三)透射电镜试验
制样：取约1mLPAA-CYs/PAH-GO-PYM溶液，将其稀释20倍，用枪头吸取100μL，滴到200目的铜网上；并配置2％的磷钨酸，用氢氧化钠调节pH至6.4-7.0，然后吸取100μL磷钨酸，缓慢的滴到铜网上，凉干，测定。结果如图8所示。从图中可以看出，GO-PYM以黑色片状存在，外层包裹物的黑色片层为聚电解质片层，粒径大约在750nm左右，未出现聚集现象。
(四)自由巯基检测稳定性
取PCPGP溶液1mL分别加入到5mL的预先恒温于25℃水中的DTNB分析溶液中，摇匀，静止10min，在波长412nm处测定吸光度值(A)。通过检测未检测出游离的巯基，说明制剂组PCPGP溶液中不含有未结合的CYs，证明制剂组PCPGP的稳定性。
(五)PAA-CYs/PAH-GO-PYM的体外释放研究
通过透析法来探究PCPGP的体外释放情况。其中采用高效液相色谱法测定释放介质中PYM浓度。分别取1mL制备好的PCPGP和GP于透析袋中(MWCO:8000Da)，在不同pH条件下(pH 2.3，pH 5.8，pH 7.4，pH 8.0，模拟溶酶体的内环境，肿瘤部位，血液以及胃肠道处的pH值)的10mL含有0.1％(w/v)SDS的PBS缓冲液作为透析介质，转速设为100r/min，分别在0.25h，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，36h，48h，60h取样1mL，同时补充同样的新鲜释放介质1mL。并用0.45μm的滤头进行过滤，按照实施例1进样测定，测量PYM的含量，并计算出相应时间点的累积释放量。做出时间-累积释放量曲线如下图9、图10。由图可知，将4种不同pH条件的累积释放量作为对比，GP中药物在酸性条件下释放量高于中性条件，表现出了一定的pH敏感性。其原因主要可能是：PYM具有羟基，氨基等官能团，而GO有羟基、羧基，在酸性条件下，使药物与GO形成的氢键断裂，所以药物释放量大于其他环境。pH 7.4中性条件，PYM上的羟基、氨基可与GO上羟基、羧基形成氢键，结合稳定。而PCPGP中PYM被包裹上聚电解质后，使得其在pH 2.3的条件下与pH 8.0与pH 7.4的累计释放量相当。在酸性条件下累积释放率降低13.60％，pH 5.8的环境下药物的累计释放率并没有下降，基本维持在80％以上的释放溶出率。不同pH条件下的释放变化情况一致，说明在双层的聚电解质包裹下，使PCPGP制剂组中的PYM得到了很好的保护。在胃酸等强酸的环境下，有了聚电解质的双层包裹明显使药物的耐酸性得到了改善，从而提高了药物的口服生物利用度。
(六)PAA-CYs-PAH/GO-PYM在体肠吸收实验和药代动力学研究
大鼠禁食12h，不禁水。腹腔内注射20％的乌拉坦溶液麻醉(约1.0g/kg)。将大鼠固定在手术台上并保持体温。沿着肚腹线打开腹腔，取小肠约10cm，由一端切开插管，切口两端用预热至37℃的KR溶液冲洗，轻轻清洗肠内容物。之后再插管结扎于出口处。用吸收盐水的脱脂棉将大鼠伤口覆盖，在红外线下保温。通过入口管灌注，流速大致保持为0.5mL/min，每间隔10min于出口处用EP管收集灌流液，持续1h。在测试结束后处死大鼠，将肠断剪下，分别测定PYM和酚红的浓度。酚红不被小肠吸收，给定时间测定酚红的浓度，就可以计算出不同时间供试液的体积，再根据测定的药物浓度，就可以得出不同时间小肠中剩余的药量或被吸收的药量。
1)PYM的测定：取样品0.5mL置5mL EP管中，加入1mol/L HCl 1mL，摇匀，然后加0.1％Na2NO2 1mL，摇匀，放置3min再加0.5％NH2SO3NH4 1mL，摇匀，在291nm的波长处利用高效液相进行检测。
2)酚红的测定：取样品0.5mL置5mL EP管中，加0.2mol/L NaOH 2mL，摇匀，在215nm的波长处用高效液相测定其峰面积。
3)通过分别测定0.17h、0.33h、0.5h、0.67h、0.83h、1h时间点的药物浓度，求出剩余药物百分比，再比较PYM、GO-PYM、PCPGP的在体肠吸收情况，如图11所示。由图可以看出，通过试验能够看出，PYM组、GO-PYM组、PCPGP组都有一定的在体肠吸收能力，同时PCPGP组表现出更好的吸收效果达到了27.84％高于PYM组的18.29％和GO-PYM组的19.56％，说明聚电解质包裹的药物对肠吸收有一定黏附作用。
(七)PAA-CYs-PAH/GO-PYM药代动力学研究
1)血浆样品处理
将每个取血点的血浆样品置于肝素润湿的离心管中，10000r/min高速离心10min，取出血浆样品(上层)100μL置于新的离心管中，并向其中加入15μL内标溶液(DOX：50μg/mL)，再向其中加入200μL甲醇溶液，混匀并涡旋振摇5min，用15000r/min低温(4℃)离心10min，取出上清液进液相进行分析(单次进样20μL)。
2)色谱条件
色谱柱为WatersMaterialsC18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；以己烷磺酸钠溶液(取己烷磺酸钠7.53g与乙二胺四醋酸二钠3.72g，加0.08mol/L醋酸溶液使溶解并稀释至1000mL，用氨溶液调节pH值至4.3)为流动相A；以甲醇-乙腈(7:3)为流动相B，按进行线性梯度洗脱，检测波长为291nm。
3)专属性考察
取出100μL空白血浆，按照1)的血浆样品处理方法处理，并进样20μL记录色谱图得到的色谱图如图12。取出100μL空白血浆，向其中加入内标DOX溶液15μL和PYM标准溶液100μL，按照如上1)的血浆样品处理方法处理并进样20μL记录色谱图得到的色谱图如下图13。从这两个图可以看出，内标DOX的保留时间为10.79min左右，PYM的出峰时间为7.16min左右。血浆中的内源性物质对于PYM和DOX的测定并不干扰。
4)标准曲线
取PYM约10mg于100mL容量瓶中，精密称重，蒸馏水定容至刻度，稀释得到浓度分别为10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL，40μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的系列溶液，根据1)项下的血浆处理方法处理样品。根据2)项下的色谱条件检测样品浓度。得到标准曲线如图14，纵坐标用APYM/A内表示，横坐标用C表示，标准曲线的线性方程为APYM/A内＝0.0795c-0.2809(r＝0.9991)，定量限为10ng，检测限为3ng。
5)精密度试验
分别精密量取100μL大鼠空白血浆，并分别向其中加入不同量(高，中，低)的PYM的标准储备溶液，将其制备成高、中、低(10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)三种不同浓度，然后按照1)血浆样品处理方法进行样品处理，再进行液相分析，在一天之内重复测定五次，最后计算日内精密度；连续测定五天，每天测定一次，然后计算此方法的日间精密度。日内及日间精密度RSD(％)均小于5％，因此，可采用该法对PYM进行测定。同样的方法处理PYM得到的日间日内精密度检测结果RSD(％)均小于5％，因此，可采用此法测定血浆样品中的PYM的浓度。
6)稳定性试验
用大鼠的空白血浆和PYM储备液配制浓度分别为10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的PYM样品。然后分别在室温(放置0h，2h，4h，6h和8h)；冻融(冻融1，2，3次)条件下进行稳定性试验。结果表明，在室温和冻融两种条件下，稳定性试验的RSD≤5％。因此在大鼠血浆样品的处理、储存、进样等过程中，样品的稳定性均不会受到影响。
7)回收率试验
取100μL大鼠空白血浆将PYM储备液分别稀释成浓度为10μg/mL，50μg/mL，100μg/mL三种样品，按照1)项下的操作进行血浆样品处理，进行分析，将得到的数据代入标准曲线，计算浓度，以最后所得的测量值/理论值作为方法回收率，PYM方法回收率均大于85％，且RSD均小于5％，所以上述方法符合生物样品方法学考察的要求。
8)PCPGP制剂组口服给药研究
将试验用的250±20g的SD大鼠，在温度25℃左右的条件下，每日自由饮食饮水，喂养7天左右，试验前将大鼠分为3组，每组6只，在给药的前12h禁食，给药剂量为60mg/kg，其中A组口服灌胃给予PYM原料药，B组灌胃给予GO-PYM，C组给予PCPGP。三组大鼠在灌胃给药后，分别于时间点0.083h、0.167h、0.25h、0.333h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h采用眼眶静脉取血，每次取血量至少为0.5mL，置于经肝素钠润湿后的离心管中，立即离心，在温度为4℃下，10000rpm，离心10min，取出上层分离出的血浆样品，并储存在-20℃的冰箱中待测，含量测定时按照1)样品处理方法进行处理并分析。
9)试验结果
将PYM原料药，GO-PYM，PCPGP制剂组分别对大鼠进行灌胃后，三者的血药浓度随着时间的变化如图15，药动学参数如表5。由图表可知，AUC大小依次为PAA-CYs/PAH-GO-PYM>GO-PYM>PYM，通过聚电解质与药物的结合，将PYM的AUC值由88.72增加到了154.29，T1/2由2.559h增加到3.078h，使得药物的体内释放时间得到提高。
表5PYM，GO-PYM和PCPGP的药动学参数
本实施例的抗癌药物平阳霉素(PYM)也可以替换成阿霉素(DOX)或紫杉醇(PTX)或阿法替尼(AF)，制成相应的聚电解质修饰的氧化石墨烯抗癌药物制剂。