一种以叶绿素酶作为烟草加工辅助的酶制剂及制备、使用方法 【技术领域】
本发明属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的多酶复合制剂及制备和使用方法。
背景技术
叶绿素酶(E.C.3.1.1.14)是植物生理重要的生理性功能酶，作为地球上最重要的光合色素，叶绿素降解与农作物衰老、果实成熟和树木落叶等植物生理现象密切相关。自1912年报道叶绿素酶后，在高等植物叶片及藻类中叶绿素酶及绿素酶与叶绿素降解之间关系广泛得以研究。通过30％、35％丙酮和60％、75％硫酸铵沉淀组分可得较高叶绿素酶活性；经40％～60％硫酸铵沉淀、透析、葡聚糖G-100凝胶过滤等处理后可得纯化86倍的叶绿素酶。近年来的研究确定了叶绿素酶是叶绿素降解中的关键酶，克隆出的叶绿素酶基因共有4种并且均在大肠杆菌中表达成功，分别是黎叶绿素酶CaCLH、柑桔叶绿素酶CHLASE1和拟南芥叶绿素酶AtCLH1、AtCLH2。叶绿素酶在植物和藻类中有着广泛的分布，分子量从27～65不等，这种差异来源于植物种类的不同或同功酶的存在。至少有一种叶绿素酶存在于质体中。CaCLH和AtCLH1存在于细胞器而非叶绿体中。植物衰老促进剂甲基茉莉酸(methyl jasmonate)可增加AtCLH1 mRNA的浓度，以及相应蛋白质含量和叶绿素酶活力[唐蕾。叶绿素酶研究的新进展。生命的化学，2002，22(4)：373～374]。作为植物生理涉及的酶，关日强等研究了二氯苯醚菊酯对黄瓜光合色素及有关酶活性的影响。用二氯苯醚菊酯(PER)处理黄瓜幼苗48h，叶绿素酶活性比对照升高4.72％～22.61％，叶绿素总量比对照下降5.55％～46.43％，PER处理6d后的类胡萝卜素含量分别下降36.47％[关日强，等。二氯苯醚菊酯对黄瓜光合色素及有关酶活性的影响。华南农业大学学报2001，22(2)：52～55]。在烟草质量的诸多研究中，高春亮等认为质体色素和多酚的降解使烟叶外观质量明显改善，这是由于多酚作为一种深棕色色素，能够在多酚氧化酶的作用下降解生成一种铁-蛋白质-绿原酸芸香苷复合物，多酚的降解促使叶色由陈化前的浅黄、正黄色向金黄、深黄及棕黄色转变；质体色素的降解导致烟叶颜色变浅，色泽均匀[高春亮等 陈化期间空气湿度对山东和贵州烟片质量的影响 中国烟草科学，2008，29(5)：32～36]。
在叶绿素含量及酶的测定上，由于叶绿素在不同溶剂中的吸收谱有差异，用不同溶剂提取色素，测定计算公式也有所不同。叶绿素a、b在95％乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm[李合生，等。植物生理生化实验原理和技术。北京：高等教育出版社，2000，p130～137]。植物叶绿素含量测定大致可分为分光光度计和活体叶绿素仪两大类，第一类，分光光度计法包括：①国际上被广泛应用，作为Arnon法的丙酮法。有提取量大、叶绿素易受光氧化破坏大量样品不适宜等麻烦；②在丙酮法的基础上形成的更为麻烦的乙醚法(也叫Smith-Benitoz法)；③二甲基亚砜法和④二甲基甲酰胺法；还有⑤无水乙醇法，⑥丙酮乙醇混合法及⑦丙酮无水乙醇等量混合而成提取液，直接浸泡提取叶绿素的丙酮乙醇混合液法，此法1985年由张宪政提出，比丙酮乙醇水混合液法、二甲基亚砜法的叶绿素提取液稳定，不易受光氧化破坏，按丙酮法的公式计算叶绿素含量。第二类主要用于活体叶绿素测定的有⑧透射型活体叶绿素仪法，在670～675nm波长的光有一吸收高峰，其吸收值与叶绿素含量成正相关。因植物不同活体叶片吸光系数不同，需经校正仪器才可对生长状态的叶片进行非破坏性快速测定；⑨反射型活体叶绿素仪，是80代后发展的主要以800nm和550nm两波长光反射率的比(ρ801/ρ550，x或y)对单位叶面积的叶绿素含量(μg/cm，y或x)，研究y＝ax+b及相关性[苏正淑，等。几种测定植物叶绿素含量的方法比较。植物生理学通讯，1989，(5)：77～78]。
对于植物叶绿素含量的测定中多以分光光度计的丙酮乙醇混合法，不同样品丙酮和乙醇混合比有所不同。对叶绿素酶是将样品研磨后，用丙酮多次洗脱尽量除去叶绿素的方法进行叶绿素酶的活性测定：取一定量的植物组织样品研磨后，用丙酮多次洗脱除去叶绿素，室温干燥粉碎。加入2mL底物和1mL磷酸缓冲液(pH8.0)于25℃下保温12h，立即加入3mL石油醚，充分振荡后3500r/min离心15min。计量上清液的体积，并取上清液体在667nm下测定吸光度。整个测定过程在黑暗中进行[郁志芳，等。鲜切芦蒿贮藏过程中叶绿素、纤维素及相关酶的变化。中国野生植物资源，2003，22(4)：61～64；甘志军，等。小麦叶绿素酶生化动力学特性研究。西北植物学报，2003，23(5)：750～754]。
叶绿素酶与其它酶的测活体系的区别在于在有机溶剂或去垢剂中，室温下叶绿素酶即可表现活性，而在以水为微环境的反应体系中，其表现活性的温度较高(65℃～75℃)。叶绿素酶在微碱性(7.5～8.0)环境中催化活性高，橄榄(Oleae Uropaea L.)叶绿素酶的最适pH值是8.5，柑桔叶片叶绿素酶最适pH值是7.8。对叶绿素酶的Km、Vmax值的研究表明，不同物种来源的叶绿素酶的Km值是3.1～278μmol/L，以叶绿素b为底物，叶绿素酶的Km值比以叶绿素a为底物时的Km值小，这表明叶绿素酶对叶绿素b的亲合性较高，而以脱镁叶绿素a为底物时，叶绿素酶催化其反应的速率比以脱镁叶绿素b为底物快[甘志军，等。叶绿素酶的研究进展。生命科学研究，2002，(1)：21～24]。作为生理学涉及地酶，韦凤杰等采用盆栽方法研究了饼肥对烤烟叶片发育过程中色素降解及相关生理变化。表明饼肥处理的叶绿素、叶绿素酶活性、总类胡萝卜素整个生育期含量均较高，饼肥处理促进叶绿素a的代谢，对新黄质前中期起促进积累作用，中后期起促进代谢作用[韦凤杰，等。饼肥对烤烟叶片发育过程中质体色素降解及相关酶类活性的影响。作物学报，2006，32(5)：766～771]。
【发明内容】
本发明目的首先是率先提出一种提取叶绿素酶而变废为宝的方法，即以植物废弃物烟草顶杈为原料，提取叶绿素酶用于将残留于烟叶中的质体色素，主要是叶绿素等质体色素转化为烟草品级提高和改善的重要前体物，对片烟复烤后的醇化起到积极的辅助调制作用。
本发明另一目的是提出一种较为快速简易的叶绿素酶活力测定方法，并将该方法作为原料抽样及提取过程和烟草加工辅助添加的叶绿素酶酶制剂的检测方法。
本发明的目的通过以下方式实现：
(一)作为产品的本发明叶绿素酶制剂
该制剂具有叶绿素酶，其酶活力为250～450U/mL。
所述制剂叶绿素酶的最佳酶活力为370U/mL。
所述制剂中含有PMSF蛋白酶活性抑制剂和去除金属离子EDTA络合剂。
PMSF是抑制蛋白酶活性表现的常用生化试剂。
EDTA化学名为乙二胺四乙酸二钠，是常用的金属离子络合剂。
(二)本发明叶绿素酶活力测定方法
(1)在10mL无水乙醇中加入1.0g直径D≤1mm的鲜活烟叶片，加盖振荡浸泡60min，取上清液2.5mL与2.5mL蒸馏水混合作为叶绿素底物液；或贮存的干品烟叶粉末2.0g，用30mL 95％乙醇浸提120min，所得过滤深绿色清液2.5mL与2.5mL蒸馏水混合为叶绿素底物液；
(2)在8mL的比色杯中加入1mL待测酶液，加入5.0mL提取制备的叶绿素底物液，混匀后在分光光度计720nm波长下即刻读取起始A＝OD720nm值，读取A值起准确计时20min时，读取B＝OD720nm值；
定义每分钟反应体系在720nm波长下变化0.001 OD720nm值为1个酶活力单位1U；
样品酶活力通过计算式：E(U)＝N(A-B)/20得到，其中N为样品稀释倍数。
所述的测定方法所用叶绿素底物可以是取新鲜的烟叶叶片，在105℃下杀青，再于80℃下烘干，研成粉末密闭贮存；使用时，称取2.0g于小烧杯中，加30mL 95％乙醇浸提120min，浸泡搅拌，待乙醇液呈深绿色，收集过滤液即得叶绿素底物液。
酶活力测定时，将需检样品稀释成适宜酶测定的稀释倍数，所用缓冲液每100mL中补加有0.3g Ca(NO3)2、0.3g MgSO4和0.1g ZnSO4作为基本的酶稳定与激活剂，以释放酶活性而检测，检测结果计算为产品浓缩液酶活。
上述检测方法中的叶绿素底物制取与预备是依据[李合生，等。植物生理生化实验原理和技术。北京：高等教育出版社，2000，p131]的新鲜菠菜原料修改为新鲜烟叶叶片。对于本发明的产品酶制剂中叶绿素酶检测所用叶绿素底物，为了在较长时间内生产的产品检测稳定而保证质量，我们事先制取一定数量的干粉。
(三)制备以叶绿素酶作为烟草加工的辅助酶制剂的方法
(1)以烟草顶杈叶作为提取叶绿素酶的原料，抽样检测叶绿素酶酶活力，合并酶活力相近的顶杈叶；
(2)用pH8.0缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂，使其浓度为0.01mol/L后加入顶杈叶，顶杈叶与含有PMSF的缓冲液的比为1g∶4mL，打碎匀浆，过滤，收集滤液，静置1h；
(3)静置液以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH4)2SO4，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h后补加(NH4)2SO4使终浓度为80％，静置过夜，再4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH4)2SO4过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；
(4)将沉淀用初始缓冲液总量的一半充分溶解后，用0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，检测上清液的酶活力，兑配上清液，使酶活力为250～450U/mL。
所述步骤(4)获得的上清液中加入浓度0.01％的蔗糖低聚物，上清液与蔗糖低聚物体积比为100∶1，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍得浓缩酶原液制剂。
所述步骤(2)进一步为在滤渣中加入缓冲液，以起始顶杈叶质量与含有PMSF的缓冲液体积比为1g∶5mL，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h。
按照本发明提供的酶活力测定方法，上述浓缩酶液经恢复活性后在浓缩原液中的叶绿素酶酶活力为250～450U/mL之间，最佳为370U/mL。
(四)本发明酶制剂的使用方法
将叶绿素酶制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其酶活力范围为1～1.8U/mL。
所述的使用方法进一步是将叶绿素酶制剂稀释后作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其最佳酶活力为1.46U/mL。
以上所用的缓冲液可选择pH8.0Britton-Robinsion缓冲液，详见[印永嘉。大学化学手册。济南：山东科学出版社，1985]配制方法。改进和调制成pH8.0的方法参照[刘士清，等。农业生物环境中基础酶技术研究法修建探讨。农机化研究，2008，(10)：162～166，175]使用。
本发明具有下述积极效果：
1.叶绿素酶是植物普遍存在的生理性酶。虽然茄科中其它植物含有的叶绿素酶较烟叶含有的高，但其原料量不能满足生产需求。另一方面，在烟叶种植中，上部成熟烟叶在封顶打杈后会产生大量废弃的顶杈叶，堆沤腐烂。这部分烟叶包括上二棚叶和顶叶约占单株产量的40％，是烟叶原料重要资源，但一般在烘烤后外观质量不够疏松，叶片僵硬，杂色烟和挂灰烟多，油分少其内在质量表现为烟碱含量偏高刺激性大，杂气较重，香气量不足，在卷烟配方中不便利用，甚至无法利用，因而封顶打杈下来的部分多作为废弃物扔掉。[许自成，等。不同采收方式对烤烟上部叶内在品质的影响。西北农林科技大学学报(自然科学版)，2005，33(11)：13～17]。为利用烟叶顶杈叶，本发明率先将其作为叶绿素酶提取原料，变废为宝，提高了烟草的生物质利用率。
2.本发明率先提出了以叶绿素酶作为烟叶烘烤后，在复烤前的加工过程中辅助添加的酶制剂，进一步催化氧化促进残留于烟叶中的叶绿素等转化，成为烟草品级提高和改善所需的香气香韵物质产生的反应重要前体物。
3.以简便的方法来提取叶绿素底物及测量叶绿素酶酶活力。为了保证在较长时间内制剂产品的检测数据稳定性和可靠性，提出了专门测定制剂产品的检测方法。
4.本发明用处理烟草顶杈为原料提取制备叶绿素酶，无需纯化叶绿素酶的工艺，提取酶可作为本发明的申请人“一种烟草品质改善与提高的烟草加工活性复合酶制剂”的调配复合酶制剂基础或酶组分之一。
5.烟草顶杈不仅能制备叶绿素酶制剂，可用于提取其它酶。如，保留在植株上余留3～5个上部叶的部分，是作为制备类胡萝卜素氧化酶(脂氧合酶，LOX)的提取原料(见申请人“以脂氧合酶作为烟草加工的辅助酶制剂”)。
6.本发明不仅适用于烟草加工，也可用于生物质等领域的研发与应用。
本发明也可以与其它烟草加工活性酶制剂配合使用，或成为申请人“一种烟草品质改善与提高的烟草加工活性复合酶制剂”的酶组分或调制复合酶制剂的基础物。
【附图说明】
图1是本发明酶制剂的制备工艺流程示意图。
以下结合具体实施方式做进一步说明，但本发明保护范围包括但不限于具体实施方式列举的内容，还应当包括与本发明相关的酶的临时混合液体或固体制剂，以及临时配比调整。
【具体实施方式】
(一)制备本发明叶绿素酶制剂及测定叶绿素酶酶活力方法
剪取烟草顶杈叶，按田块分别收集存放阴凉3天后抽样检测叶绿素酶酶活力，合并酶活力相近顶杈叶作为起始原料；用pH8.0缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂浓度为0.01mol/L后，将之加入顶杈叶，顶杈叶质量与含有PMSF的缓冲液体积的比为1g∶4mL，充分打碎匀浆，过滤，收集滤液。以顶杈叶质量与PMSF的缓冲液体积比1g∶5mL，再次向滤渣加入缓冲液，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h后，以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH4)2SO4，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h，补加(NH4)2SO4使终浓度为80％，静置过夜，4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH4)2SO4过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；用初始缓冲液总量的一半充分溶解沉淀，用0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，得到去除金属离子酶上清液。上清液加入浓度0.01％的蔗糖低聚物，即上清液与蔗糖低聚物体积比为100∶1，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍得浓缩酶制剂，检测酶活力，用多批次酶制剂相互兑配，调整制剂酶活力为250～450U/mL，最佳酶活力为370U/mL。
以上叶绿素酶酶活力测定方法是：
取新鲜的烟叶叶片，在105℃下青，再于80℃下烘干，研成粉末密闭贮存于棕色瓶中。用时称取2.0g于小烧杯中，加30mL 95％乙醇浸提120min，浸泡过程中随时搅拌，最终乙醇液应为深绿色，过滤即得叶绿素底物液。
待测用酶液用pH8.0缓冲液，并且所用缓冲液每100mL中补加有0.3gCa(NO3)2、0.3g MgSO4和0.1g ZnSO4作为基本的酶稳定与激活剂。用此缓冲液将样品稀释到适当浓度，同时释放酶活性而检测。
在8mL的比色杯中加入1mL待测酶液，加入5.0mL提取制备的叶绿素底物液，混匀后在721分光光度计，720nm波长下即刻读取起始A＝OD720nm值，读取A值起准确计时20min时，读取B＝OD720nm值；
定义每分钟反应体系在720nm波长下变化0.001OD720nm值为1个酶活力单位1U；
样品酶活力通过计算式：E(U)＝N(A-B)/20得到，其中N为样品稀释倍数。
按照以上制备方法得到的浓缩液酶制剂相当于370U/mL的叶绿素酶活力。该浓缩液酶制剂以叶绿素酶为主，同时还含有脂氧合酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶及烟碱脱氢酶。
(二)本发明的使用及效果
处理方式：以云南玉溪红塔区有代表性的云85品种B2F(上橘二)等级为处理对象，在实验室条件下模拟烟叶片烟复烤醇化过程，考察浓缩酶制剂对醇化(自然发酵)前期的影响。将370U/mL的浓缩叶绿素酶制剂用自来水稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，叶绿素酶最佳酶活力为1.46U/mL。对照用相同量的自来水作为润叶水。打叶、复烤后，各个包装500g烟叶，处理平行重复不少于3次，在相对湿度65％的室温下自然醇化60天，分别制成烟丝混匀，取样分析和卷成卷烟评吸。各处理烟叶常规分析为：
经云南烟草科学研究对样品的“烟草致香成份分析表”结果：与对照样相比，处理样中定量检出对照样不存在的物质增加了29种成份；处理样品中比对照减少了5种成份，分别是3，8，8-三甲基四氢萘、Cis-3，5-二甲基苯甲醇、苯乙烯、二环[7.1.0]癸二炔、香橙烯和朱栾倍半萜2。处理样与对照共同含有的成份，除烟碱大幅度下降外，均有不同幅度的增加，特别是新植二烯增加2倍多。常规分析中除蛋白质无明显变化外，其它成份的量均有不同程度的下降。在专业评吸中，与对照相比青杂气和刺激性得到了较好的控制。