一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片及方法.pdf

一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片及方法，复合芯片包括DNA芯片、微流控芯片；DNA芯片由多种点突变PKU特异性诊断基因探针固定在玻璃芯片上形成；微流控芯片带有通道的一面与玻璃芯片带有点突变PKU特异性诊断基因探针的一面以反应区与基因探针区为对接点对接并自动吸附粘牢。方法包括步骤：抽提孕妇血浆和白细胞中的DNA，对其外显子基因进行扩增并对引物进行反应而得样品；在上述的复合芯片的样品池、冲洗液池、洗涤液池中分别加入样品、冲洗液和洗涤液；将复合芯片进行离心处理；把玻璃芯片上的微流控芯片揭开弃去，观察样品与反应区反应的结果。本发明能够实现PKU的产前快速诊断。

1、  一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片，包括DNA芯片、微流控芯片；所述DNA芯片由若干种不同的点突变PKU特异性诊断基因探针固定在玻璃芯片上形成，所述的若干种不同的点突变PKU特异性诊断基因探针形成基因探针区，所述微流控芯片包括冲洗液池、洗涤液池、样品池、反应区、废液池，反应区分别通过液体通道与冲洗液池、洗涤液池、样品池、废液池连通；其特征在于：所述的点突变PKU特异性诊断基因探针都固定在玻璃芯片的一面上，微流控芯片带有通道的一面与玻璃芯片带有点突变PKU特异性诊断基因探针的一面以反应区与基因探针区为对接点对接并自动吸附粘牢。

2、  根据权利要求1所述的用于PKU的产前快速诊断的复合芯片，其特征在于：所述点突变PKU特异性诊断基因探针为五种不同的点突变PKU特异性诊断基因探针。

3、  一种用于PKU的产前快速诊断的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：抽提孕妇血浆和白细胞中的DNA，对DNA的外显子基因进行扩增并对其引物进行反应而得到样品；
步骤2：在权利要求1所述的复合芯片的样品池、冲洗液池、洗涤液池中分别加入样品、冲洗液和洗涤液；
步骤3：将步骤2准备好的复合芯片进行离心处理1-2分钟后取出；
步骤4：把位于权利要求1所述的玻璃芯片上的微流控芯片揭开弃去，把玻璃芯片置于DNA芯片扫描仪中检验样品与权利要求1所述的反应区的情况并观察样品与反应区反应的结果即可。

4、  根据权利要求3所述的用于PKU的产前快速诊断的方法，其特征在于：在步骤1中，采用PCR方法对DNA的外显子基因进行扩增并对其引物进行反应。

5、  根据权利要求4所述的用于PKU的产前快速诊断的方法，其特征在于：在步骤1中，采用PCR方法对DNA的3、6、7、11、12五个外显子基因进行扩增并对其引物进行反应。

6、  根据权利要求3所述的用于PKU的产前快速诊断的方法，其特征在于：在步骤3中，将步骤2准备好的复合芯片放置于离心机上并以预设的速度离心处理1.5分钟后取出。

一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片及方法
技术领域
本发明涉及一种用于遗传疾病的产前快速诊断的设备及方法，更具体地说，涉及一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片及方法。
背景技术
经典型的苯丙酮尿(Phenyketon uria简PKU)是由苯丙氨酸羟化酶(PAH)的遗传性缺陷引起的一种先天性代谢病。PKU患儿在刚出生时，由于无苯丙氨酸的摄入，因此无临场表现，但是，随着患儿的退食而连续出现智力进行性下降，皮肤色素浅，肌张力高，惊厥发生，汗和尿中有特殊的臭味，患者生活不能自理，智力严重障碍，同时，给患者家庭造成严重的身心负担和经济压力。因此，对此病行产前诊断是非常必要的。
PKU是一种常染色体隐性遗传病，患儿的父母为致病基因的携带者而患儿为纯合子。引起PKU的基因的PAH，该基因位于12q22-24.2全长约90kb，包括13个外显子和12个内含子。迄今已经发现PKU有440多种致病突变(http://www.mcgill.ca/pahdb)，国内仅发现30余种突变。PAH基因的突变大部分位于编码区的小的遗传学变化，在苯丙氨酸羟化酶基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置。根据对苯丙氨酸羟化酶酶活性有无影响，突变又可分为致病突变和沉默突变。致病突变大多位于外显子或内外显子的交接区，严重影响苯丙氨酸羟化酶基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响苯丙氨酸羟化酶的催化活性。沉默突变对苯丙氨酸羟化酶活性无影响。
苯丙氨酸羟化酶的基因突变位点和形式多种多样，具有明显人种和地域的差异。但大部分位于外显子区，63％是错义突变，其次为剪接位点突变(占13％)。欧洲人PKU患者的常见突变位于外显子12和内含子12，分别为R408Q(31％)和IVS12nt G2＞A(11％)；东方PKU患者的常见的突变位于外显子12和7，分别为R413P(25％)和R243Q(18％)。这些苯丙氨酸羟化酶基因常见突变位点的研究有利于建立PKU的基因诊断，以便于实现PKU的早期诊断和产前诊断。
产前诊断是指直接或间接地对孕期胎儿情况进行检测，为了提高人口素质而采取一些必要的措施防止严重遗传病，先天性畸形和智力障碍患儿的出生。90年代初，用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其高效、敏感、经济、高阵列、自动化等特点，已成为一项现代化诊断新技术，它减少了PCR错配所造成的假阳性和假阴性，同时克服了PCR技术无法一次性多位点扩增的问题。尽管拥有如此多优点，但该技术中的DNA杂交时间需要耗时12小时以上，使快速诊断受到限制。微流控芯片技术(又称微全分析系统，μ-TAS或芯片实验室lab on a chip)指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。微流控芯片已被公认为是21世纪最为重要的前沿技术之一，但是，目前微流控芯片技术还有待完善和提高。
目前，分子细胞生物学技术作产前诊断根据其取材方式分有创和无创两种。通过羊膜腔穿刺、绒毛采取和脐静脉穿刺获取胎儿细胞进行产前诊断的方法称为有创。这些手段对于胎儿有一定的风险性，有导致流产发生的可能。因而许多学者致力于非侵入性无创产前诊断的研究，且已经取得了可喜的进步。非侵入性无创产前诊断主要有以下两种方法：
1.孕妇外周血分离富集胎儿细胞：孕妇外周血中存在胎儿细胞，通过分离、富集这些细胞可用于产前诊断。这些细胞包括滋养细胞、淋巴细胞、颗粒细胞及有核红细胞。目前的研究认为，有核红细胞是用于产前诊断的最理想的细胞。但孕妇外周血中胎儿细胞的数目极少。要进行无创性产前诊断，须首先将胎儿细胞从孕妇外周血中分离纯化出来。常用于富集、分离胎儿细胞的方法包括：(1)密度梯度离心法；(2)流式细胞计数法(flow cytometry)；(3)磁场激活细胞分选法(magnetic activated cell sorting，MACS)；(4)显微操作分离法；(5)选择性细胞培养技术等。目前，分离和富集的胎儿细胞能用于基因诊断或染色体诊断。但由于其胎儿细胞数量稀少且不同孕期的含量不同，分离及纯化胎儿细胞等难点技术尚未解决，且费用昂贵，敏感性低，使其难以成为临床实用的无创伤性产前诊断方法。
2.孕妇外周血分离胎儿DNA：近年来，有学者对母血浆中的游离胎儿DNA予以极大关注。这主要根据在肿瘤患者血浆及血清中发现有肿瘤来源DNA报道的启示。有学者认为胎盘与恶性肿瘤间存在较大的相似性，将胎盘部分的行为称为“伪恶性”。由于不需要经过繁琐的DNA提取过程，节省了时间及费用，为非侵入性产前诊断提供了一种新途径。虽然孕妇血中胎儿游离DNA较胎儿完整细胞含量丰富，但其绝对量仍然极其微少，需要非常敏感的方法才能获得稳定可靠的检测结果。然而，PCR技术的发展使微量的胎儿DNA不再是限制产前基因诊断的因素。近年报道用于产前基因诊断的PCR技术，有套式PCR法、引物延伸预扩增(PEP)-PCR法以及实时荧光定量(QF)-PCR法等等。由于孕妇外周血分离胎儿DNA方法不经过繁琐的细胞核DNA提取过程，因此明显缩短检测时间，节省检测费用且采血量也降至2ml，即可获得足够PCR扩增的模板量(每次4μl)，为无创伤性产前基因诊断进入临床应用提供了良好的前提条件。但是，上述检测方法仍存在两个主要的问题：1.DNA的提取和检测仍需进一步简化，尤其对女胎DNA的检测，用STRs分析至少需要3～5个位点，耗费高，仍需探索一种准确廉价的检测方法。2.PCR技术本身存在的问题。由于可能存在DNA的污染、等位基因脱扣等问题，故通过PCR扩增可出现假阳性或假阴性。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片，采用该复合芯片，能够实现遗传疾病的产前快速诊断。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种用于PKU的产前快速诊断的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用了以下技术方案：
一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片，包括DNA芯片、微流控芯片；所述DNA芯片由若干种不同的点突变PKU特异性诊断基因探针固定在玻璃芯片上形成，所述的若干种不同的点突变PKU特异性诊断基因探针形成基因探针区，所述微流控芯片包括冲洗液池、洗涤液池、样品池、反应区、废液池，反应区分别通过液体通道与冲洗液池、洗涤液池、样品池、废液池连通；所述的点突变PKU特异性诊断基因探针都固定在玻璃芯片的一面上，微流控芯片带有通道的一面与玻璃芯片带有点突变PKU特异性诊断基因探针的一面以反应区与基因探针区为对接点对接并自动吸附粘牢。
所述点突变PKU特异性诊断基因探针为五种不同的点突变PKU特异性诊断基因探针。
一种用于PKU的产前快速诊断的方法，其包括以下步骤，步骤1：抽提孕妇血浆和白细胞中的DNA，对DNA的外显子基因进行扩增并对其引物进行反应而得到样品；
步骤2：在复合芯片的样品池、冲洗液池、洗涤液池中分别加入样品、冲洗液和洗涤液；
步骤3：将步骤2准备好的复合芯片进行离心处理1-2分钟后取出；
步骤4：把玻璃芯片上的微流控芯片揭开弃去，把玻璃芯片置于DNA芯片扫描仪中检验样品与反应区的情况并观察样品与反应区反应的结果即可。
在步骤1中，采用PCR方法对DNA的外显子基因进行扩增并对其引物进行反应。
在步骤1中，采用PCR方法对DNA的3、6、7、11、12五个外显子基因进行扩增并对其引物进行反应。
在步骤3中，将步骤2准备好的复合芯片放置于离心机上并以预设的速度离心处理1.5分钟后取出。
本发明由于采用了上述结构及方法，将多种常见的点突变PKU特异性诊断基因探针固定在玻璃芯片上，并且，微流控芯片带有通道的一面与玻璃芯片带有点突变PKU特异性诊断基因探针的一面以反应区与基因探针区为对接点对接并自动吸附粘牢。采用抽提孕妇血浆和白细胞中的DNA作检测样品，利用微流控芯片试剂用量微少和可控等特点，同时通过离心力的作用完成样品和试剂在DNA芯片上的加入和混合等操作步骤，故本实用新型能够将杂交时间缩短至15分钟以内，从而能够克服DNA阵列芯片杂交时间长和假阴性的不利因素，实现PKU的产前快速诊断。
在结合附图阅读本发明的实施方式的详细描述后，本发明的特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1是本发明的一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片的部件的示意图。
具体实施方式
下面以一个实施方式对本发明作进一步详细的说明，但应当说明，本发明的保护范围不仅仅限于此。
参阅图1。一种用于PKU的产前快速诊断的复合芯片，包括DNA芯片、微流控芯片，所述DNA芯片由若干种不同的点突变PKU特异性诊断基因探针(未图示)固定在玻璃芯片7上形成，例如有5种常见的点突变PKU特异性诊断基因探针，上述点突变PKU特异性诊断基因探针形成基因探针区；所述微流控芯片包括冲洗液池1、洗涤液池2、样品池3、反应区5、废液池6，反应区5分别通过液体通道4与冲洗液池1、洗涤液池2、样品池3、废液池6连通；所述的点突变PKU特异性诊断基因探针都固定在玻璃芯片7的一面上，微流控芯片带有通道的一面与玻璃芯片7带有点突变PKU特异性诊断基因探针的一面以反应区与基因探针区为对接点对接并自动吸附粘牢。
在本实施方式中，常见的点突变位点如表一所示，其中，5种常见的点突变PKU特异性诊断基因探针是根据下述的点突变位点来制作。
表一：