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1、10申请公布号CN104186685A43申请公布日20141210CN104186685A21申请号201410145593022申请日20140411CGMCCNO870020140110A23C20/0220060171申请人向华地址410128湖南省长沙市芙蓉区湖南农业大学滨河小区34栋303室72发明人向华54发明名称腐乳产品及其制备方法57摘要采用总状毛霉发酵熟黄豆，制备具有湖南特色的腐乳产品。该菌适合用于湖南特定环境的发酵腐乳制品的生产，缩短发酵时间、提高其生产效率，确保产品生产过程的可控性，降低了产品风险，同时使其产品的营养成份更加全面。83生物保藏信息51INTCL权利要求书。
2、1页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页10申请公布号CN104186685ACN104186685A1/1页21腐乳产品，各原料成份以以下重量份组成4060干黄豆、18总状毛霉菌及其代谢物、510食盐、021辣椒面、14白酒，其余为水。2权利要求1的腐乳产品，各原料成份优选以下重量份组成4555干黄豆、1555总状毛霉菌及其代谢物、68食盐、0308辣椒面、1525白酒，其余为水。3权利要求1的腐乳产品，各原料成份优选以下重量份组成50干黄豆、35总状毛霉菌及其代谢物、7食盐、06辣椒面、25白酒，其余为水。4权利要求13所述腐乳。
3、产品的制备方法，其具体步骤如下1采用总状毛霉CGMCCNO8700采用PDA液体发酵制成液体发酵液，每毫升含微生物数量1107CFU以上；2将发酵液按照比例与熟黄豆搅拌拌匀，进行发酵，用量达到18，即为每100KG熟黄豆用总状毛霉1L8L；3控制发酵温度2532，湿度在8595之间，发酵周期为23天，使毛霉气生菌丝达到25CM即为发酵黄豆毛坯；4向发酵黄豆毛坯直接加入质量比510的食盐浓度，加入辣椒面、白酒，匀浆后装坛密封进行厌氧发酵，发酵温度2532，发酵时间在1520D完成后发酵，氨基酸态氮达到05以上，酸度在10以内，直接罐装密封即为腐乳产品。5根据权利要求4的方法，所述加入辣椒面的量K。
4、G，与发酵黄豆毛坯的重量KG比021。6根据权利要求4的方法，所述加入白酒的体积L，与发酵黄豆毛坯的重量KG比14。权利要求书CN104186685A1/7页3腐乳产品及其制备方法所属技术领域0001本发明属于食品发酵领域，涉及了一种腐乳产品，更具体地说是涉及了一种利用毛霉菌针对豆腐进行发酵加工方法。背景技术0002腐乳又称豆腐乳，是中国流传数千年的传统民间美食，因其口感好、营养高，深受中国老百姓及东南亚地区人民的喜爱，是一道经久不衰的美味佳肴。腐乳通常分为青方、红方、白方三大类。其中，臭豆腐属“青方”。“大块”、“红辣”、“玫瑰”等属“红方”。“甜辣”、“桂花”、“五香”等属“白方”。000。
5、3腐乳和豆豉以及其他豆制品一样，都是营养学家所大力推崇的健康食品。它的原料豆腐干本来就是营养价值很高的豆制品，蛋白质含量达1520，与肉类相当，同时含有丰富的钙质。腐乳的制作过程中经过了霉菌的发酵，使蛋白质的消化吸收率更高，维生素含量更丰富。因为微生物分解了豆类中的植酸，使得大豆中原本吸收率很低的铁、锌等矿物质更容易被人体吸收。同时，由于微生物合成了一般植物性食品所没有的维生素B12，素食的人经常吃些腐乳，可以预防恶性贫血。0004腐乳的原料是豆腐干类的“白坯”。给白坯接种品种合适的霉菌，放在合适的条件下培养，不久上面就长出了白毛霉菌们大量繁殖起来啦。这些白毛看起来可能有些可怕，实际上却大可不。
6、必担心，因为这些菌种对人没有任何危害，它们的作用只不过是分解白坯中的蛋白质、产生氨基酸和一些B族维生素而已。对长了毛的白坯进行搓毛处理，最后再盐渍，就成了腐乳。0005公开号为CN102885166A的中国专利公开了一种腐乳的生产工艺及腐乳，包括制坯步骤、前发酵步骤、装坛后发酵步骤，以及配料装瓶步骤，在所述装坛后发酵步骤中加入芳香类植物物质，参与后发酵。本发明的腐乳采用上述的腐乳生产工艺得到。本发明的腐乳生产工艺在后酵中加入了芳香类植物物质，例如玫瑰花瓣、桂花花汁或西柚糖浆等，参与到腐乳的后发酵过程中，使各种芳香类植物味道深入腐乳，最终制得风味独特且口味丰富的腐乳。并且本发明制得的腐乳具有一定。
7、的保健功能。0006公开号为CN102144754A的中国专利公开了一种腐乳的制造方法，在正常的腐乳制作完成后，把腐乳去湿化，然后烘、晒干，然后用纸类、塑料袋包装，直接上市出售。后期发酵工艺则由购买者在家装瓶、入水完成。利用本方法可以大大降低腐乳的包装成本，促使原始腐乳完成向碳经济、碳生活的转化，节约能源，运输方便。0007公开号为CN101828685A的中国专利公开了一种腐乳固态发酵工艺，采用在咸胚装瓶时直接加入香辛料及复合酶制剂对腐乳进行后期发酵，研究复合酶制剂、盐、酒、香辛料对腐乳口感，形态和发酵周期，保质期的影响，研讨复合酶制剂、盐、酒、香辛料对腐乳固态发酵过程的影响程度，寻求腐乳固。
8、态发酵的最佳生产工艺以解决传统的半液态半固态发酵存在的腐乳发酵周期长，产品易产生产气漏汁等问题，简化工艺流程，缩短发酵时间，加快资金周转率5060。说明书CN104186685A2/7页40008公开号为CN101301051的中国专利公开了一种腐乳的制备方法，采用黑豆为主要原料以制作腐乳工艺制成，与常规工艺比较，本发明在点浆工艺中豆腐成型用的凝固剂采用浓度为12的酸水；在前期培养发酵工艺中，采用低温培菌工艺，室温常年控制在2024，培养时间为3640小时；在后期制作工艺的后发酵过程中，所调配的盐酒水浓度低于常规，使制出的黑豆腐乳产品蛋白质和氨基酸含量较高、口感咸香、鲜甜、软糯。0009公开号。
9、为CN102197847A的中国专利介绍了一种多菌种混合发酵生产腐乳的方法，其包括以下步骤1豆腐乳坯制作取大豆制成豆腐乳坯；2前期培菌取含有毛霉、米曲霉和黑曲霉的混合菌种接种到豆腐乳坯中，进行前期培菌，得到豆腐乳毛坯；3食盐腌制将步骤2所得的豆腐乳毛坯，放入胶箱，逐层撒盐，进行食盐腌制成咸坯；4后期发酵将腌制好的豆腐乳咸坯装瓶后，在半成品的酒液中接种增香酵母菌，进行后期发酵；5得到腐乳成品。该方法可以丰富腐乳产品风味，并缩短了腐乳的发酵周期。0010公开号为CN103355432A的中国专利介绍了一种腐乳的快速生产方法，其特征在于包括以下步骤1称取5G新鲜的腐乳，加入到50ML无菌水中，用无菌。
10、玻璃棒将腐乳压碎，然后将腐乳溶液放在磁力搅拌器中搅拌23分钟，使其成为均匀的胶体溶液，放在4冰箱中，盖上保鲜膜，备用；2称取新鲜块状豆腐1000G，将其切成尺寸为3CM3CM2CM大小的豆腐块，切好后放在干净的瓷坛中；3称取50G红辣椒，将其切成丝末，均匀撒在豆腐块上，同时在豆腐块上均匀洒入食盐20G，十三香45G，姜丝35G；4从冰箱中取出保存的腐乳胶体溶液，均匀地加入到瓷坛中，并不时地倾斜瓷坛，保证豆腐块能与胶体溶液有接触；5将瓷坛盖子盖上，放在室温条件下培养，每天定期观察豆腐块的发酵情况，培养34天后即制得美味的腐乳；6将制得的腐乳高温加热35分钟，将微生物加热杀死后即可食用。0011公。
11、开号为CN102870852A的中国专利介绍了一种新型风味的腐乳饼制作方法，其特征在于，它包括以下生产步骤1取白肉丁49重量份、白砂糖49重量份、酒精度52度以上的白酒2重量份腌48小时，制成糖肉备用；2取糖肉50重量份，加入腐乳10重量份、花生碎15重量份、芝麻6重量份、大蒜4重量份、糕粉15重量份加清水10重量份混合均匀，制成馅料备用；3取糖浆25重量份，依次加入碱水1重量份、植物油10重量份、白砂糖9重量份、清水5重量份、低筋粉50重量份混合均匀，制成饼皮原料；在加入白砂糖之前，浆液必须搅拌至表面无明显浮油；加入低筋粉后先以1030R/MIN慢速搅拌1分钟，再以60100R/MIN快速搅。
12、拌34分钟，使饼皮原料柔软有光泽；4取之前制成的馅料和饼皮原料进行包馅、打饼，制成腐乳饼半成品；5将腐乳饼半成品放入热风旋转炉进行焙烤，焙烤温度为160190，烘烤时间为1525分钟，烘烤后于18的冰室内速冻1012分钟，然后自然解冻至常温；6取新鲜鸡蛋打散出蛋液，用软刷蘸取蛋液，对解冻后的腐乳饼半成品表面刷蛋液；7使用热风旋转炉对刷蛋液后的腐乳饼半成品进行高温烘烤，烘烤温度为260280，烘烤时间为1012分钟，烘烤后自然冷却至常温，制成成品；8使用枕式自动包装机对成品进行包装，制成产品。0012公开号为CN102742666A的中国专利公开了一种番茄汁豆腐乳及其制备方法，在豆腐乳制备过程中。
13、，在原料豆浆中添加重量百分比20的番茄鲜榨原汁，搅拌均匀后用于制作豆腐乳。本发明采用新鲜的番茄，经科学的配方和现代化设备制成番茄汁豆腐乳，含有大豆丰富的蛋白质及番茄中大量的维生素、碳水化合物和多种矿物质及微量元素。具有豆腐乳和蔬菜特有香气，优良菌群活化作用，增加了豆腐乳口感品味，丰富营养。说明书CN104186685A3/7页50013综上所述，利用毛霉针对黄豆和豆腐乳进行腐乳发酵的研究较多，主要以解决生产过程中的发酵条件为主，对利用毛霉发酵黄豆时所分解的营养成份方面关注度不高，所发酵得到的产品中氨基酸和不饱和脂肪酸含量不高，而且各个地域不同差别大分离得到的毛霉菌有差异，我们以熟黄豆为原料，直。
14、接采用分离到的毛霉进行发酵，形成以地方特色为主的腐乳产品。发明内容0014本发明的目的就是针对湖南特色的不同来源的腐乳，采用常规分离的方法，得到了既可以发酵腐乳又能够生产豆豉的一种特色的毛霉菌资源，将分离得到的微生物经过鉴定用于适合湖南特定环境的发酵豆制品的生产，缩短发酵时间、提高其产品的营养成份和其生产效率，确保产品生产过程的可控性，降低了产品风险。0015因此，本发明第一个发明目的是提供一种包含总状毛霉MUCORRACEMOSUS的分离筛选鉴定，其中所述菌株已于2014年01月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNO8700，保藏地址北京市朝阳区北辰西路。
15、1号院3号。0016其中，所述的总状毛霉的筛选过程从湖南本地不同地域民间收集的腐乳、豆豉的传统自然发酵的样品，采用选择性的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，通过分泌蛋白酶的能力为主要指标进行选择，得到产蛋白酶活力较高的菌株，委托中科院微生物所进行菌种鉴定，其RRNA基因序列的ITS158SITS2区序列测定结果见序列1。选育菌种的培养特征、显微特征、RRNA基因序列等数据分析其鉴定结论为总状毛霉MUCORRACEMOSUS，平皿生长可布满培养基，菌丝为薄棉絮状，浅黄褐色图1；孢囊具有短的、稀疏的假轴状分枝，孢子囊直径在20100M图2，囊轴近卵形，17601045M图3，孢囊孢子近球形、宽椭圆形。
16、，单个无色，聚集在孢囊中呈灰褐色，58547M图4。结合孢子未见，厚垣孢子形状、大小不一致，无色或者浅黄色图4。0017在一个具体实施方案中，所述的总状毛霉还包括该菌培养基质及该菌代谢产物。0018该总状毛霉菌株的斜面培养配制PDA斜面培养基，成分为马铃薯200克葡萄糖20克，琼脂1014克，加水配制1000ML，自然PH液体培养基不需要加入琼脂即可，常规灭菌，冷却接种，放入28培养箱中培养48H，保存备用。0019该总状毛霉菌的扩大液体培养麸皮液体培养基，成分为麦麸100克，红糖30克，琼脂12克，酵母12克，加水配制1000ML，自然PH，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，用接种扩大培养的毛。
17、霉孢子，28，培养24H进行扣瓶后，继续培养48H。0020本发明第二个发明目的是总状毛霉发酵熟黄豆获得的腐乳产品，各原料成份以以下重量份组成4060干黄豆、18总状毛霉菌及其代谢物、510食盐、021辣椒面、14白酒，其余为水。0021在另一个实施方案中，各原料成份优选以下重量份组成4555干黄豆、1555总状毛霉菌及其代谢物、68食盐、0308辣椒面、1525白酒，其余为水。0022在另一个实施方案中，各原料成份优选以下重量份组成50干黄豆、35总状毛霉菌及其代谢物、7食盐、06辣椒面、25白酒，其余为水。0023干黄豆加工处理经过100高温水煮20MIN分钟，获得熟黄豆，水份含量达到说明。
18、书CN104186685A4/7页640以上。0024本发明第三个发明目的是总状毛霉在腐乳产品加工中用于快速发酵的用途。0025其中所述的用途包括用总状毛霉发酵液直接接种熟黄豆的发酵工艺。0026其中，用总状毛霉发酵液拌料熟黄豆发酵工艺00271采用总状毛霉CGMCCNO8700采用PDA液体发酵制成液体发酵液，每毫升含微生物数量1107CFU以上；00282将发酵液按照比例与熟黄豆搅拌拌匀，进行发酵，用量达到18，即为每100KG熟黄豆用总状毛霉1L8L；00293控制发酵温度2532，湿度在8595之间，发酵周期为23天，使毛霉气生菌丝达到25CM即为发酵黄豆毛坯；00304向发酵黄豆毛坯。
19、直接加入质量比510的食盐浓度，加入辣椒面、白酒，匀浆后装坛密封进行厌氧发酵，发酵温度2532，发酵时间在1520D完成后发酵，氨基酸态氮达到05以上，酸度在10以内，直接罐装密封即为腐乳产品。0031在一个具体实施方案中，所述加入辣椒面的量KG，与发酵黄豆毛坯的重量KG比021。0032在一个具体实施方案中，所述加入白酒的体积L，与发酵黄豆毛坯的重量KG比14。0033技术效果00341、获得适合湖南特定腐乳制品发酵环境的总状毛霉，缩短发酵时间、提高其产品的营养成份和其生产效率，确保产品生产过程的可控性，降低了产品风险。00352、该菌适应于低盐发酵，发酵过程中食盐的含量不超过8，减少了食盐。
20、浓度过高对酶系的抑制作用，所得产品适合人群更广。00363、采用上述的总状毛霉发酵液直接接种煮熟的黄豆发酵工艺，可快速发酵黄豆，与传统发酵工艺比较，可以缩短发酵周期一半以上，同时减少了污染机会，保证发酵的成功率，提高生产效率，减少生物胺的形成，确保了产品质量稳定与安全，减轻了企业的资金压力。具体实施方案0037实施例1毛霉菌的筛选0038从各地采集自然发酵的腐乳、豆豉样品，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行蛋白酶分泌能力实验和生存温度较高2535之间，得到毛霉菌株，进行菌种鉴定。0039优良菌株分离筛选00401单菌分离样品来源于自然生霉的腐乳毛坯、腊八豆曲或浏阳豆豉曲样品，采。
21、用稀释平皿法和单孢子分离方法，在马铃薯琼脂平板上培养。选取生长速度快、菌丝致密发达、孢子量多的菌落，继续进行多次点种培养，直到纯化为止。然后用接种到PDA平皿上待长出单菌落移接斜面。00412干酪素培养基初筛采用透明圈法。将上述得到的纯种毛霉菌接入灭菌的麸皮培养基上培养72H，加入05无菌盐水的浸泡毛霉麸曲过滤得到粗提液酶液。取在说明书CN104186685A5/7页7直径9CM无菌培养皿注入15ML20ML干酪素琼脂培养基，凝固成平板。取直径10MM灭菌滤纸片，放入酶液中浸泡1H。取出凉干，贴在干酪素琼脂平板上。每个平皿贴4块滤纸片，每个处理4次重复。置40下保温6H，测定透明圈直径，选取透。
22、明圈直径较大的菌株进行复筛。00423三角瓶复筛取毛霉PDA琼脂平板菌种一小块，接入三角瓶麸皮培养基中，于25培养4D，提取酶液，测定蛋白酶活力。00434酶液制备称取5G培养好的毛霉麸曲，置于250ML三角瓶中，加入05灭菌盐水100ML，捣碎培养物，在40水浴中，不断搅拌，浸提1H，用滤纸过滤，取滤液测酶活力。00445蛋白酶活力测定用福林法测定中性蛋白酶活力。0045实施例2总状毛霉的生理生化特征0046选育菌种的培养特征、显微特征、RRNA基因序列等数据分析其鉴定结论为0047总状毛霉MUCORRACEMOSUS，平皿生长可布满培养基，菌丝为薄棉絮状，浅黄褐色图1；孢囊具有短的、稀疏的。
23、假轴状分枝，孢子囊直径在20100M，囊轴近卵形，17601045M，孢囊孢子近球形、宽椭圆形，单个无色，聚集在孢囊中呈灰褐色，58547M。结合孢子未见，厚垣孢子形状、大小不一致，无色或者浅黄色。0048实施例3毛霉发酵剂的制备00491菌株的培养0050配制PDA斜面培养基，接种，放入28培养箱中培养48H，保存备用。00512扩大培养0052麸皮培养基灭菌前分装三角瓶500ML瓶、装50G，常规灭菌，冷却后在超净工作台上，用接种扩大培养的毛霉孢子，28，培养24H进行扣瓶后。继续培养48H。00533毛霉在腐乳表面生长情况见表1。0054表1毛霉在豆腐表面生长情况表005500564该菌。
24、种的菌体脂肪酸检测。0057使用美国MIDIMICROBIALIDENTICATION公司SHEROLOCK全自动细菌鉴定系统对送检菌株进行菌体脂肪酸成分分析。溶液45G氢氧化钠溶于150ML甲醇及150ML蒸馏水；溶液190ML浓盐酸，275ML甲醇溶于135ML蒸馏水；溶液200ML正己烷与200ML说明书CN104186685A6/7页8甲基叔丁醚混合均匀；溶液108G氢氧化钠溶于900ML蒸馏水；溶液饱和氢氧化钠溶液。0058脂肪酸提取方法用接种环从培养基表面刮取适量细菌培养物。置于8ML螺口玻璃管中，加入1ML溶液，拧紧螺盖，沸水浴5MIN，取出振荡510S，再度拧紧螺盖，继续沸水浴。
25、25MIN。待样品管冷却后，加入2ML溶液，盖严振荡，随后精确控制801水浴10MIN，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏。在冷却样品管中加入125ML溶液，快速振荡10MIN左右，弃去下层水相。在剩余有机相中加入3ML溶液和几滴溶液，快速振荡5MIN左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。0059脂肪酸色谱分析条件采用HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器FID及HP气相色谱化学工作站HPCHEMSTATIONVERA505；色谱柱为UITRA2柱，长25M，内径02MM，液膜厚度033M；炉温为二阶程序升温起始温度17。
26、0，每分钟5升至260，随后以40/MIN升至310，维持15MIN；进样口温度250，载气为氢气，流速05ML/MIN，分流进样模式，分流比1001，进样量2L；检测器温度300，氢气流速30ML/MIN，空气流速216ML/MIN，补充气氮气流速30ML/MIN，检测结果见表2。0060表2毛霉菌菌丝脂肪酸含量表00610062实施例4毛霉发酵熟黄豆的发酵0063用总状毛霉发酵液拌料熟黄豆发酵工艺00641采用总状毛霉CGMCCNO8700采用PDA液体发酵制成液体发酵液，每毫升含微生物数量1107CFU以上；00652将发酵液按照比例与熟黄豆搅拌拌匀，熟黄豆含水量达到40，进行发酵，用量是每100KG熟黄豆用总状毛霉35L；00663控制发酵温度2532，湿度在8595之间，发酵周期为3天，使毛霉气生菌丝达到45CM即为发酵黄豆毛坯；说明书CN104186685A7/7页900674向发酵黄豆毛坯100KG直接加入7KG的食盐浓度，加入06KG辣椒面、25L白酒，匀浆后装坛密封进行厌氧发酵，发酵温度2532，发酵时间在20D完成后发酵，氨基酸态氮达到08，酸度在085，直接罐装密封即为腐乳产品。说明书CN104186685A1/1页10图1图2图3图4说明书附图CN104186685A10。