在水相中制备壳聚糖纳米颗粒的方法 【技术领域】
本发明涉及壳聚糖纳米颗粒的制造，特别涉及一种在水相中制备壳聚糖纳米颗粒的方法。
背景技术
纳米技术在现今医药领域的应用着重于医学预防、诊断、药物输送和疾病治疗的相关研究。纳米颗粒可作为药物输送系统的载体，其具备诸多优点，例如提高药物在肠胃道的稳定性，改善口服药物的吸收性和生物利用率，减少药物的使用剂量，因而降低因使用高剂量药物而产生的副作用，以及专一性地投药。然而，基于生物使用安全性考虑，诸如材料来源和所使用的试剂等因素往往限制纳米颗粒的应用范围。
壳聚糖是目前公认安全性极高(LD50＞4g/kg)的药物载体。壳聚糖通常制成微球体。例如，CN1698900揭示一种壳聚糖载药微球的制备方法，其特征在于将亲水性药物溶于壳聚糖的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，用压力通过微孔膜将水相压入油相中，得到尺寸均一的乳滴，然后用二步骤固化法对乳滴进行交联固化。前述“二步骤固化法”是指使用离子型胶凝剂(例如三磷酸盐(TPP))使壳聚糖发生分子链聚集成团，然后利用化学交联剂使其交联固化。这种方法并不能制得纳米级的壳聚糖颗粒。
由于壳聚糖与相邻分子以及诸如乳酸等有机酸之间会产生强的氢键，故难以溶解于水中。因此壳聚糖在水相中的溶解度即为决定其应用范围能否扩大的一项重要因素。已知可在特定反应条件下和在有机相中使壳聚糖与酸酐进行酰基化作用，产生具有不同去酰基化程度的壳聚糖，从而控制壳聚糖的水溶性。此外，所属领域的技术人员也建议制备壳聚糖的纳米颗粒。
US 2005/0226938 A1揭示一种由壳聚糖制备经交联的核心以及核-壳型纳米颗粒聚合物的方法，所述方法是使壳聚糖与至少一种其上具有至少两个羧酸基的羧酸反应，优选地使用碳二酰亚胺(carbodiimide)作为反应活化剂。
US 2006/0013885 A1揭示一种用于输送抗癌药物的水溶性壳聚糖纳米颗粒以及其制备方法，所述方法是使壳聚糖分子与甲基聚(乙二醇)对-氮基苯基碳酸酯链接，成为两性分子链，进而自组装形成壳聚糖纳米颗粒。
JP 2006241321揭示一种制备壳聚糖纳米颗粒的方法，所述方法包含将壳聚糖溶解于一种水性酸溶液中，以获得壳聚糖的水性酸溶液，并且将此壳聚糖的水性酸溶液加到一种碱性水溶液中，例如，3N的氢氧化钠水溶液。
CN1686560揭示一种壳聚糖季铵盐纳米粒子的制备方法，其是通过使壳聚糖和环氧丙烷-三甲基-氯化胺反应以制备壳聚糖季铵盐，然后将此壳聚糖季铵盐、待包埋的药物以及三聚磷酸钠混合并进行交联，而获得壳聚糖季铵盐纳米粒子。
US 4,996,307揭示一种水溶性乙酰化壳聚糖的制备方法，所述方法包括将呈任意共聚物形式且具有至少70％去乙酰化程度的水溶性壳聚糖溶解于一种水性酸溶液中，以水或者例如甲醇的水可混溶性溶剂稀释所述溶液，然后添加例如酸酐的乙酰化剂至所述溶液中，以产生乙酰化反应。根据此专利的实施例，进行上述乙酰化反应时，添加甲醇、乙醇或异丙醇等有机溶剂作为有机相。
JP 2000256403揭示一种部分乙酰化壳聚糖颗粒的制备方法，所述方法包括将壳聚糖溶解于一种水性酸溶液中，将此溶液分散在一种制粒用溶剂中，搅拌前述分散相使之形成颗粒。此外，经由在甲苯或异丙醇的有机相中进行乙酰化作用，形成经乙酰化的壳聚糖，加入碱并且加热，使所得产物部分乙酰化，最后通过交联作用使产物稳定。
JP 62079201揭示一种多孔性圆粒状N-乙酰化壳聚糖的制备方法，所述方法包括将低分子量的壳聚糖溶解于一种水性酸溶液中，将此溶液滴入一种碱性溶液中，使壳聚糖溶液产生凝集作用，进而形成所述多孔性圆粒状N-乙酰化壳聚糖。前述乙酰化作用是在例如甲醇或苯等有机相中进行。
CN 1367183揭示一种类玻尿酸壳聚糖的制备方法，所述方法包括使壳聚糖进行乙酰化作用，然后进行选择性氧化作用，以获得具有类似玻尿酸的结构的壳聚糖。前述乙酰化作用是在例如甲醇的有机相中进行。
此外，平野繁广(Shigehiro Hirano)和山口龙二(Ryuji Yamaguchi)于1976年发表于生物聚合物(BIOPOLYMERS)第15版第1685至1691页中、标题为“N-乙酰化凝胶：甲壳素的多水合物(N-Acetylation Gel：A Polyhydrate of Chitin)”的文献(以下称“1976年文献”)中，比较了壳聚糖醋酸溶液分别在甲醇相和水相中进行乙酰化作用所产生凝胶之间的差异。此1976年文献主要在探讨壳聚糖经过乙酰化后所产生的胶化现象，并且进一步探讨所形成的胶体的基本物理性质，例如可溶解于何种溶剂中和相关溶解度如何。但此1976年文献仅教示在水相中添加一定量的醋酸酐可以使得壳聚糖由于乙酰化作用而呈水胶化，其所产生的胶体颗粒往往过大，甚至凝集成团。此1976年文献的操作条件无法制得壳聚糖纳米颗粒。
另外的相关文献还包括李东元(Dong-Won Lee)等人于2004年发表于“碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)，58(2004)”中、标题为“酰基化壳聚糖纳米颗粒的物理化学性质和血液相容性(Physicochemical properties and blood compatibility ofacylated chitosan nanoparticles)”的文献，以及，颇特若·阿(A.Portero)等人于2002年发表于“微胶囊化(MICROCAPSULATION)，19(2002)”中、标题为“用于抗微生物剂至胃粘膜的控释给药的重乙酰化壳聚糖微球体(Reacetylated chitosan microspheres forcontrolled delivery of anti-microbial agents to the gastric mucosa)”的文献。其全文以引用的方式并入本专利案的说明书中。
上述已知壳聚糖颗粒的制备方法分别具有一或多种以下缺点：(1)未能制得纳米级壳聚糖颗粒，(2)涉及繁琐的化学修饰步骤，耗时又耗费人力，(3)制造过程中使用的有机溶剂会残留于所制得地壳聚糖颗粒中，因此，即使能够制得纳米级壳聚糖颗粒，其对于医疗应用的安全性仍令人担忧。
目前仍需要一种能够制备具有良好生物相容性又符合医疗应用的安全性考虑的纳米级壳聚糖颗粒的方法。
【发明内容】
本发明提供一种满足上述需求的纳米级壳聚糖颗粒的制备方法，其是在水相中进行壳聚糖溶液的化学性修饰，使壳聚糖分子链接成为两性分子链，进而于物理性分散力的作用下自组装成为壳聚糖纳米颗粒。本发明是在壳聚糖经由乙酰化修饰而产生胶体的过程中通过控制壳聚糖和醋酸酐的浓度并通过物理性分散而获得纳米级的壳聚糖颗粒，此可避免如同前述1976年文献般产生大团块胶体。
具体而言，本发明提供一种在水相中制备壳聚糖纳米颗粒的方法，其包含以下步骤：
(a)提供浓度为约0.05w/v％至约1w/v％的壳聚糖溶液，
(b)将水和醋酸酐依序加入所述壳聚糖溶液中，以进行乙酰化作用，其中，以整体溶液的体积计，所述醋酸酐的浓度为约10v/v％至约30v/v％，和
(c)使步骤(b)的溶液进行物理性分散。
在步骤(a)中所使用的壳聚糖是指β-[1→4]-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄吡喃糖，通常具有10-1,000kDa的分子量以及介于70％与90％之间的去乙酰化程度。壳聚糖可由任何已知来源获得，包括但不限于软体动物(例如乌贼)、昆虫外壳、藻类、甲壳类动物和真菌。甲壳类动物壳聚糖优选为虾或蟹壳壳聚糖，真菌壳聚糖优选为Actinomucortaiwanensis壳聚糖。根据本发明的壳聚糖溶液是指将壳聚糖溶解于溶剂后所形成的溶液，其中所述溶剂可为任何已知可用于溶解壳聚糖的溶剂，其包括但不限于醋酸水溶液、甲酸、丙酸、苹果酸、琥珀酸和乳酸，其中优选为约1v/v％的醋酸水溶液；且壳聚糖溶液的浓度优选为约0.05w/v％至约0.6w/v％，更优选为约0.1w/v％至约0.3w/v％。
在步骤(b)中所使用的无水醋酸酐可通过商业行为购得。以整体溶液的体积计，所述醋酸酐的浓度为约10v/v％至约30v/v％，优选为约12.5v/v％至约25v/v％，更优选为约17.5v/v％至约25v/v％。
本发明中的乙酰化作用是指将壳聚糖的氨基与醋酸酐的羧基形成乙酰基的反应，其可于任何所属领域已知的适当温度下进行。
在步骤(c)中所述的物理性分散是指以物理方式使溶液分子产生分散作用的处理，其可使用任何所属领域已知的方式进行，其包括但不限于以振荡器(Shaker)、液体喷洒器(Spray Sparger)、机械式搅拌和超声波震荡处理。如利用搅拌方式进行物理性分散时，可将磁石加入所述来自步骤(b)的溶液中，并且以适当搅拌速率搅拌一段超过约24小时的时间。搅拌速率取决于所反应的溶液体积大小，可为例如约150rpm至约1500rpm，优选为约175rpm至约1300rpm。如利用超声波震荡进行物理性分散时，根据本发明的一项优选实施例，是利用超声波振荡器(声波与材料公司(Sonic & Materials Inc.)型号：VC 134，功率：130W，容量：115V，50/60Hz)在下列条件下进行：震荡时间为约5分钟，脉冲间距为约4秒，且在震荡完毕后立即将溶液移入冰浴中。
步骤(c)的物理性分散可于任何所属领域已知的适当温度下进行，例如约20℃至约40℃，使用机械式搅拌(如磁石搅拌)进行物理性分散，优选地在约37℃下进行，如利用超声波震荡进行物理性分散，优选地在室温下进行。
根据本发明方法获得的壳聚糖纳米颗粒可具有约100nm至约500nm的平均粒径，优选地为约100nm至约300nm，最优选地为约100nm至约200nm。
本发明方法可于温和条件下获得壳聚糖纳米颗粒，而无须使用有机溶剂或者繁琐的化学性修饰步骤，其操作方式相当简单。由于本发明方法全程在水相中进行，故可避免常规壳聚糖颗粒中有机溶剂残留的问题。根据本发明方法获得的壳聚糖纳米颗粒更符合医疗应用的安全性考虑，并且具有良好生物相容性。
【具体实施方式】
以下实施例用于对本发明作进一步说明，而非用来限制本发明的范围。任何本发明所属技术领域的技术人员可轻易达成的修正和改变均包括于本案说明书揭示内容和所附权利要求书之内。
实施例1 壳聚糖纳米颗粒的制备(磁石搅拌)
(I)使用从不同来源获得并且具有不同平均分子量的壳聚糖
分别将秤重好的0.2g的获自虾蟹壳(购自台湾世展公司(Shin Era TechnologyCo.，Ltd))和真菌(购自财团法人食品工业发展研究所的Actinomucor taiwanensis菌株)并且具有不同分子量的壳聚糖，加入预先配制的1v/v％醋酸水溶液中，以使其溶解，然后将其定量至100mL，并且取10mL上述壳聚糖溶液进行后续反应。在所述10mL壳聚糖溶液中，先加入5mL Milli Q纯水，再加入5mL 100％醋酸酐(即纯水∶醋酸酐的体积比＝1∶1)，以进行乙酰化作用。此反应中，总反应溶液体积为20mL，以所述整体反应溶液的体积计，所述醋酸酐的浓度为25v/v％。将磁石加入上述溶液中，于37℃下，以1300rpm的搅拌速率搅拌一段超过24小时的时间后，获得壳聚糖纳米颗粒的水溶液。以纳米粒度仪分析其中的壳聚糖纳米颗粒，结果如表1所示，其平均粒径范围为195～326nm。
表1
壳聚糖来源 平均分子量(kDa) 平均粒径(nm) CC 68 68 233 CC 72 72 243 CC 95 95 247 FC 24 24 195 FC 190 190 299 FC 340 340 326
注：CC代表获自虾蟹壳的壳聚糖，FC代表获自真菌的壳聚糖，数字部分代表平均分子量(kDa)
(II)使用不同的壳聚糖浓度和醋酸酐浓度
中心混成设计(Central Composite Design(CCD))实验的实验条件是根据Design-Expert 6.0.2软件设计。首先，依据此软件所给的实验条件以小容器进行摇瓶试验(shaker test)，然后将试验结果输入此软件原本设计的实验表的结果栏位中，经由软件分析，便可得到许多探讨实验变量的具体结论。本发明在实验过程中使用的CCD设计实验能于一次实验中同时探讨所需的多个实验变量(而不像传统实验设计一次只能探讨一个变量)，再依据Design-Expert 6.0.2软件所规划出来探讨多变因子，需要实验的反应条件和组数，实验者即依软件所设计实验条件进行摇瓶试验，将摇瓶实验结果数据再输入回软件原先规划实验组数中，待填写的结果栏位。经由软件统计分析，将可以了解各单一变量分别对于实验结果的影响程度，或者也能探讨两两变量之间交互作用对实验结果的影响。
(1)本实例中选择获自虾蟹壳(购自台湾世展公司(Shin Era Technology Co.，Ltd))并且分子量为95kDa的壳聚糖(CC 95)进行上述CCD设计实验。
分别将秤重好的0.05～0.35g上述壳聚糖加入预先配制的1v/v％醋酸水溶液中，以使其溶解，然后将其定量至100mL，并且取5mL上述壳聚糖溶液进行后续反应。在所述5mL壳聚糖溶液中，先加入2.5mL Milli Q纯水，再加入2.5mL 100％醋酸酐(即纯水∶醋酸酐的体积比＝1∶1)，以进行乙酰化作用。此反应中，总反应溶液体积为10mL，以所述整体反应溶液的体积计，所述醋酸酐的浓度为25v/v％。在上述(I)中所描述的相同条件下进行乙酰化作用。结果证实在上述条件下可制得壳聚糖纳米颗粒的水溶液。以纳米粒度仪分析其中的壳聚糖纳米颗粒，结果如表2所示，其平均粒径范围为189～298nm。
表2
(2)本实例中选择获自真菌(购自财团法人食品工业发展研究所的Actinomucortaiwanensis菌株)并且平均分子量为24kDa的壳聚糖(FC 24)进行上述CCD设计实验。
分别将秤重好的0.4g与0.6g上述壳聚糖加入预先配制的1v/v％醋酸水溶液中，以使其溶解，然后将其定量至100mL，并且取5mL上述壳聚糖溶液进行后续反应。在所述5mL壳聚糖溶液中，先加入2.5mL Milli Q纯水，再加入2.5mL 100％醋酸酐(即纯水∶醋酸酐的体积比＝1∶1)，以进行乙酰化作用。此反应中，总反应溶液体积为10mL，以所述整体反应溶液的体积计，所述醋酸酐的浓度为25v/v％。将磁石加入上述溶液中，于37℃下以175rpm的搅拌速率搅拌超过24小时的时间后，获得壳聚糖纳米颗粒的水溶液。以纳米粒度仪分析其中的壳聚糖纳米颗粒，结果如表3所示，其平均粒径范围为196～206nm。
表3
表2以及3的结果证实，根据本发明方法，反应浓度为0.1w/v％～0.6w/v％的壳聚糖，可制得壳聚糖纳米颗粒。
(3)接续上述实验方式，将秤重好的0.2g壳聚糖(CC 95)加入预先配制的1v/v％醋酸水溶液中，以使其溶解，然后将其定量至100mL，并且取5mL上述壳聚糖溶液进行后续反应。在所述5mL壳聚糖溶液中，先加入不同反应体积Milli Q纯水，再加入100％醋酸酐，以进行乙酰化作用。此反应中，总反应溶液体积为10mL，以所述整体反应溶液的体积计，醋酸酐的浓度分别为17.5v/v％和25v/v％。在上述(2)中所描述的相同条件下进行乙酰化作用并获得壳聚糖纳米颗粒的水溶液。以纳米粒度仪分析其中的壳聚糖纳米颗粒，结果如表4所示，其平均粒径范围为170～245nm。因此在本发明方法中，在醋酸酐的浓度为17.5v/v％～25v/v％的条件下可制得壳聚糖纳米颗粒。
表4
实施例2 壳聚糖纳米颗粒的制备(超声波震荡)
(I)使用从不同来源获得并且具有不同平均分子量的壳聚糖
分别将秤重好的0.2g获自虾蟹壳(购自台湾世展公司(Shin EraTechnology Co.，Ltd))和真菌(购自财团法人食品工业发展研究所的Actinomucor taiwanensis菌株)且具有不同分子量的壳聚糖加入预先配制的1v/v％醋酸水溶液中，以使其溶解，然后将其定量至100mL，并且取3.6mL上述壳聚糖溶液进行后续反应。在所述3.6mL壳聚糖溶液中，先加入不同反应体积Milli Q纯水，再加入100％醋酸酐(纯水∶醋酸酐的体积比分别为1∶2，2∶3和1∶1)，以进行乙酰化作用。此反应中，总反应溶液体积为7.2mL，以所述整体反应溶液的体积计，所述醋酸酐的浓度分别为16.67v/v％、20v/v％和25v/v％。在反应过程中，同时利用超声波振荡器(声波与材料公司(Sonic & Materials Inc.)型号：VC 134)在输出功率为15W且脉冲间距为4秒的条件下于室温下震荡5分钟(震荡器被置入反应装置(试管)中)，以获得壳聚糖纳米颗粒的水溶液，震荡完毕后立即将溶液移入冰浴中。以纳米粒度仪分析其中的壳聚糖纳米颗粒，结果如表5所示，其平均粒径范围为138～213nm。
表5
注：表5的样本编号中，FC代表获自真菌的壳聚糖，CC代表获自虾蟹壳的壳聚糖，数字部分代表平均分子量(kDa)
由表5的结果可知，根据本发明方法，使用从不同来源获得并且具有不同平均分子量的壳聚糖(例如虾蟹壳壳聚糖和真菌壳聚糖)，在添加使醋酸酐的浓度为16.67v/v％～25v/v％的条件下，通过超声波振荡，可获得平均粒径范围为138～213nm的壳聚糖纳米颗粒。
(II)使用不同的醋酸酐最终浓度
选择获自真菌(购自财团法人食品工业发展研究所的Actinomucor taiwanensis菌株)并且平均分子量为340kDa的壳聚糖(FC 340)进行以下实验。
将秤重为0.2g的上述壳聚糖分别加入预先配制的1v/v％醋酸水溶液中，以使其溶解，然后将其定量至100mL，并且取2mL上述壳聚糖溶液进行后续反应。在所述2mL壳聚糖溶液中，先加入不同反应体积Milli Q纯水，再加入100％醋酸酐(纯水∶醋酸酐的体积比分别为1∶1，3∶5，1∶3)，以进行乙酰化作用。此反应中，总反应溶液体积为4mL，以所述整体反应溶液的体积计，所述醋酸酐的浓度分别为25v/v％、18.75v/v％和12.5v/v％。同时以如实施例2的(I)中所描述的相同方式通过超声波振荡器进行反应，以获得壳聚糖纳米颗粒的水溶液。以纳米粒度仪分析其中的壳聚糖纳米颗粒，结果如表6所示，其平均粒径范围为153～170nm。
表6
醋酸酐浓度(v/v％) 平均粒径(nm) 25 170 18.75 165 12.5 153
由表6的结果可知，根据本发明方法，使用真菌壳聚糖(FC 340)，在使醋酸酐的浓度分别为12.5v/v％、18.75v/v％和25v/v％的条件下，通过超声波振荡，可获得平均粒径范围为153～170nm的壳聚糖纳米颗粒。
综合上述实施例1和2的结果可知，使用获自不同来源并且具有不同平均分子量的壳聚糖(例如获自虾蟹壳的壳聚糖和获自真菌的壳聚糖)，在使醋酸酐的浓度为12.5v/v％～25v/v％的条件下，通过物理性分散(例如搅拌或超声波振荡)，确可获得壳聚糖纳米颗粒。