一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法.pdf

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1、10申请公布号CN104073530A43申请公布日20141001CN104073530A21申请号201410299787622申请日20140627C12P17/18200601C07D493/04200601C12R1/0120060171申请人陕西科技大学地址710021陕西省西安市未央区大学园1号72发明人龚国利马利云74专利代理机构西安通大专利代理有限责任公司61200代理人蔡和平54发明名称一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法57摘要本发明公开了一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，步骤为产抗癌物质埃博霉素B的纤维堆囊菌经种子活化培养，接入发酵罐发酵；在发酵罐中埃博霉素。

2、B和菌体浓度达到一定程度，即发酵4860H，处于对数生长的中后期时，将发酵液连续通过吸附柱，利用其内部的大孔吸附树脂吸附埃博霉素B，经吸附后的发酵液返回发酵罐中继续发酵，以补加的方式往发酵罐中补充葡萄糖，维持埃博霉素B的不断合成，最后终止发酵，取出大孔吸附树脂，萃取分离、提纯埃博霉素B。本发明实现了埃博霉素B的连续发酵，提高了产量，延迟发酵周期，简化后处理工艺，大大降低了生产成本。51INTCL权利要求书1页说明书8页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图1页10申请公布号CN104073530ACN104073530A1/1页21一种连续吸附耦合。

3、发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，包括以下步骤1将纤维堆囊菌经种子活化培养后，接入到装有发酵培养基的发酵罐中在2832下进行发酵；其中，纤维堆囊菌的接种量为发酵培养基体积的612；2发酵罐中纤维堆囊菌发酵4860H时，将发酵液连续通过吸附柱，经吸附柱后的发酵液返回发酵罐中继续发酵；发酵4860H后向发酵罐中补充用于维持埃博霉B合成的葡萄糖；其中，吸附柱内填有能够吸附埃博霉素B的大孔吸附树脂；3当发酵罐中纤维堆囊菌的浓度达到最大时，继续发酵1236H后终止发酵，取出吸附柱内的大孔吸附树脂，经萃取、提纯得到埃博霉素B。2根据权利要求1所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，。

4、所述装有发酵培养基的发酵罐中的发酵培养基的体积占发酵罐体积的5070。3根据权利要求1所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的PH为7276，并且经过灭菌，发酵培养基的组分为酵母粉2050G/L、玉米淀粉510G/L、磷酸二氢钠12G/L、磷酸氢二钠12G/L、MGSO47H2O25G/L、FESO47H2O0105G/L、CACL225G/L、MNCL20105G/L和葡萄糖1015G/L。4根据权利要求1所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的纤维堆囊菌为ATCC25532或ATCC25569；当发酵罐中纤维堆囊菌的浓度达到最。

5、大时，发酵的时间为57D。5根据权利要求1所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为经过预处理的树脂，预处理的具体过程为将大孔吸附树脂浸在体积分数为3060的甲醇水溶液中1224H。6根据权利要求1所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂的体积占吸附柱的容积的1020。7根据权利要求5或6所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为平均孔径为的非极性大孔树脂。8根据权利要求7所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的非极性大孔树脂为XAD16大孔吸附树脂。9根。

6、据权利要求1所述的一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，其特征在于，所述的吸附柱的材质为金属、陶瓷或玻璃。权利要求书CN104073530A1/8页3一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法技术领域0001本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法。背景技术0002埃博霉素EPOTHILONES是微生物粘细菌产生的一类十六元环抗肿瘤次级代谢产物，1987年REICHENBACH和等首次从黏细菌纤维堆囊菌中分离得到，其作用机制与著名的抗癌药物紫杉醇相同，即通过促微管聚合作用来抑制肿瘤菌体的增殖，但它在水溶性，安全性以及抗肿瘤活性等方面优于紫杉醇。埃博霉素化学结。

7、构简单，易于进行修饰，来源不受限制，可以通过大规模的工业发酵进行制备等，其有望成为继紫杉醇之后更为有效的抗肿瘤药物，具有广阔的市场前景，因此受到学术界和企业界的密切关注。但埃博霉素发酵产量较低及成本较高，极大地限制了该类抗肿瘤药的开发应用，因此如何提高生产菌株的产埃博霉素能力仍是目前该药物研发的一大热点。0003作为一种极具有发展前景的抗癌药物，埃博霉素B有望在不久的将来推广到商业界，但目前埃博霉素B的发酵产量很低，而且人工合成非常困难，因此如何实现埃博霉素B的高产有很重要的要求，也是埃博霉素B应用的屏障之一。目前关于如何提高埃博霉素B的发酵产量报道较少。发明内容0004本发明为克服现有技术中。

8、的不足，提供一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，该方法通过连续吸附耦合装置，原位吸附分离埃博霉素B产物，从而减除产物的反馈抑制，提高产物发酵产量，简化生产工艺流程。0005为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现00061将纤维堆囊菌经种子活化培养后，接入到装有发酵培养基的发酵罐中在2832下进行发酵；其中，纤维堆囊菌的接种量为发酵培养基体积的612；00072发酵罐中纤维堆囊菌发酵4860H时，将发酵液连续通过吸附柱，经吸附柱后的发酵液返回发酵罐中继续发酵；发酵4860H后向发酵罐中补充用于维持埃博霉B合成的葡萄糖；其中，吸附柱内填有能够吸附埃博霉素B的大孔吸附树脂；00083当发。

9、酵罐中纤维堆囊菌的浓度达到最大时，继续发酵1236H后终止发酵，取出吸附柱内的大孔吸附树脂，经萃取、提纯得到埃博霉素B。0009所述的装有发酵培养基的发酵罐中的发酵培养基的体积占发酵罐体积的5070。0010所述的发酵培养基的PH为7276，并且经过灭菌，发酵培养基的组分为酵母粉2050G/L、玉米淀粉510G/L、磷酸二氢钠12G/L、磷酸氢二钠12G/L、MGSO47H2O25G/L、FESO47H2O0105G/L、CACL225G/L、MNCL20105G/L和葡萄糖1015G/L。说明书CN104073530A2/8页40011所述的纤维堆囊菌为ATCC25532或ATCC25569。

10、；当发酵罐中纤维堆囊菌的浓度达到最大时，发酵的时间为57D。0012所述的大孔吸附树脂为经过预处理的树脂，预处理的具体过程为将大孔吸附树脂浸在体积分数为3060的甲醇水溶液中1224H。0013所述的大孔吸附树脂的体积占吸附柱的容积的1020。0014所述的大孔吸附树脂为平均孔径为的非极性大孔树脂。0015所述的非极性大孔树脂为XAD16大孔吸附树脂。0016所述的吸附柱的材质为金属、陶瓷或玻璃。0017与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明将大孔树脂吸附和发酵生产埃博霉素B相结合，发酵合成和吸附分离同时进行，通过埃博霉素B产物的吸附原位分离，可以有效减除产物对发酵过程的反馈抑制，大大提。

11、高埃博霉素B的发酵产量。并且，将发酵产物埃博霉素B吸附到大孔吸附树脂上，节省了后续分离工艺的时间和资源，产物的后续处理更简单、方便。本发明适合大规模生产使用，连续吸附耦合发酵过程将吸附过程和发酵过程分离，从而便于进一步对吸附和分离进行精细化控制，可以有效降低生产成本，提高生产效率。本发明采用的仪器成本低，并且发酵过程中循环流畅，操作方便，易于实现自动化。0018进一步的，吸附柱的材质为金属、陶瓷或玻璃，利于进行高温灭菌处理，还可以根据发酵液处理量大小，可以多个吸附柱并联、单独使用或交替使用。附图说明0019图1为本发明的工艺流程图；0020图中，1为发酵罐，2为吸附柱，3为空气压缩机，4为流加。

12、补料瓶，5为酸碱补料瓶，61为第一恒流泵，62为第二恒流泵，63为第三恒流泵，7为三通阀。具体实施方式0021下面结合附图和具体实施例做进一步的阐述。0022本发明涉及一种用于连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的装置，包括发酵罐1、补料瓶4和酸碱补料瓶5，所述发酵罐1的出口连接有吸附柱2的入口，吸附柱2的出口与发酵罐1相连，并且发酵罐的出口与吸附柱2的入口之间依次设置有三通阀7和第一恒流泵61，发酵罐1的入口还与流加补料瓶4、酸碱补料瓶5相连通，流加补料瓶4与发酵罐入口之间设置有第二恒流泵62，酸碱补料瓶5与发酵罐1的入口之间设置第三恒流泵63，发酵罐1还连接有空气压缩机3。其中，流加补料瓶4中装。

13、有葡萄糖，酸碱补料瓶5中装有1MOL/L的氢氧化钾溶液或盐酸溶液。0023本发明中的采用的仪器具体如下发酵罐采用上海高机生物工程有限公司BIOF6000B5L机械搅拌发酵罐，空气压缩机为上海锦欣SUNSOURCEOLF100AF低噪音空气压缩机，恒流泵为保定兰格BT100流动泵，灭菌器为日本三洋电子MLS3780高压蒸汽灭菌器，液相色谱仪为WATERS248724201525高效液相色谱仪。0024发酵菌株为美国WATERS公司的纤维堆囊菌SORANGIUMCELLULOSUM，ATCC25532或ATCC25569，大孔吸附树脂选用XAD16。0025本发明中将纤维堆囊菌经种子活化培养的具体。

14、过程为将纤维堆囊菌接种于M26说明书CN104073530A3/8页5固体培养基培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中振荡培养，之后将M26液体培养基培养得到的液体高速搅拌使菌体打匀，离心收集沉淀，加无菌水重悬得纤维堆囊菌种子液。M26培养基为土豆淀粉为79G/L、豆蛋白胨为23G/L、葡萄糖为23G/L、酵母粉为23G/L、MGSO4为25G/L、CACL2为25G/L、EDTAFE3溶液浓度为115ML/L，PH值为7275，并于115下灭菌30MIN。0026下面通过具体实施例进行详细说明。0027实施例10028如图1所示，一种连续吸附耦合发酵生产埃博霉素B的方法，包括以下。

15、步骤00291纤维堆囊菌种子活化培养将纤维堆囊菌ATCC25532接种于M26固体培养基培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中振荡培养，之后将M26液体培养基培养得到的液体高速搅拌使菌体打匀，离心收集沉淀，加无菌水重悬得纤维堆囊菌种子液。M26培养基为土豆淀粉为8G/L、豆蛋白胨为2G/L、葡萄糖为2G/L、酵母粉为2G/L、MGSO4为2G/L、CACL2为2G/L、EDTAFE3溶液浓度为1ML/L，PH值为72，并于115下灭菌30MIN。00302连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌向吸附柱2中加入经过预处理的平均孔径为的非极性大孔吸附树脂，非极性大孔吸附树脂的体积占吸附柱2容。

16、积的10；向发酵罐1中加入发酵培养基，发酵培养基的体积占发酵罐体积的50，发酵培养基的PH为72，发酵培养基的成分为酵母粉20G/L、玉米淀粉5G/L、磷酸二氢钠1G/L、磷酸氢二钠1G/L、MGSO47H2O2G/L、FESO47H2O01G/L、CACL22G/L、MNCL201G/L和葡萄糖10G/L。其中，预处理的具体过程为将非极性XAD16大孔吸附树脂在体积分数为30的甲醇水溶液中浸泡12H。0031将发酵罐1分别和流加补料瓶4、酸碱补料瓶5相连通，将发酵罐1的出口与吸附柱2的下端入口相连通，吸附柱2的上端开口和发酵罐1的入口相连通，使整个装置内部形成循环通路；各仪器的接口密封连接后。

17、，将整个装置进行高压蒸汽115灭菌30MIN。00323发酵罐放大培养将步骤1活化后的纤维堆囊菌通过注射的方法接种于发酵罐1中，纤维堆囊菌的接种量为发酵培养基体积的6，整个过程保持无菌操作；然后，开启搅拌、通气，通气量为25L/MIN，控制发酵温度为28，发酵罐内压力为001MPA。00334吸附耦合循环开启当发酵罐1中发酵48H，即菌体处于对数生长中后期，开启第一恒流泵61，将发酵液从发酵罐1输出，流速为10ML/MIN，通过管路自下而上通过吸附柱2，从而实现产物埃博霉素B、菌体及发酵液的分离，减除产物埃博霉素B对发酵的抑制作用，菌体和发酵液通过管路返回到发酵罐1，保持循环流畅。00345通。

18、过流加补料瓶4以及酸碱补料瓶5，从发酵60H起，每隔12H向发酵罐中补加一次葡萄糖，每次补加量为每升发酵液中加入1G，直到发酵结束；通过酸碱补料瓶定时向发酵罐中进行酸碱补料，使PH值维持在72。发酵过程可以通过三通阀7取样分析，判断生长速率。00356发酵结束，回收产物经较长时间5D连续发酵后，发酵埃博霉素B合成速率出现下降趋势，即菌体浓度达到最大，继续发酵12H后，将吸附柱2中XAD16大孔吸附树脂取出烘干；用有机溶剂甲醇将产物埃博霉素B萃取析出，采用高效液相色谱法HPLC取样检测，流动相，甲醇水6535体积比；上样体积20L；时间30MIN；流速1ML/MIN，检测波长249NM。本实施例。

19、中埃博霉素B的产量为39MG/L。说明书CN104073530A4/8页60036XAD16大孔吸附树脂经过预处理的方法处理后能够重复利用。0037实施例200381同实施例1；00392连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌向吸附柱2中加入预处理过的平均孔径为的非极性大孔吸附树脂，非极性大孔吸附树脂的体积占吸附柱2容积的15；向发酵罐中加入发酵培养基，发酵培养基的体积占发酵罐体积的60，发酵培养基的PH为74，发酵培养基成分为酵母粉30G/L、玉米淀粉6G/L、磷酸二氢钠15G/L、磷酸氢二钠2G/L、MGSO47H2O3G/L、FESO47H2O02G/L、CACL22G/L、MNCL202G/。

20、L和葡萄糖12G/L；其中，预处理的具体过程为将非极性XAD16大孔吸附树脂在体积分数为30的甲醇水溶液中浸泡12H。0040将发酵罐1分别和流加补料瓶4、酸碱平衡补料瓶5相连通，将发酵罐1的出口与吸附柱2的下端入口相连通，吸附柱2的上端开口和发酵罐1的入口相连通，使整个装置内部形成循环通路；将各仪器的接口密封连接后，将装置进行高压蒸汽115灭菌30MIN。00413发酵罐放大培养将步骤1活化后的纤维堆囊菌通过注射的方法接种于发酵罐1中，纤维堆囊菌的接种量为发酵培养基体积的12，整个过程保持无菌操作；然后，开启搅拌、通气，通气量为25L/MIN，控制发酵温度为30，发酵罐内压力为001MPA。。

21、00424吸附耦合循环开启当发酵罐中埃博霉素B和菌体浓度达到一定程度，即发酵60H，菌体处于对数生长中后期，开启第一恒流泵6，将发酵液从发酵罐1输出，流速为20ML/MIN，通过管路自下而上通过吸附柱2，从而实现产物埃博霉素B和菌体及发酵液的分离，减除产物对发酵的抑制作用，菌体和发酵液通过管路返回到发酵罐1，保持循环流畅。00435通过流加补料瓶4以及酸碱平衡补料瓶5，从60H起，每12H向发酵罐中补加一次葡萄糖，补加量为每升发酵液中加入1G，直到发酵结束；通过酸碱补料瓶定时向发酵罐中进行酸碱补料，使PH值维持在76。发酵过程可以通过三通阀7取样分析，判断生长速率。00446发酵结束，回收产物。

22、经较长时间6D连续发酵后，发酵接近埃博霉素B合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵24H时，将吸附柱2中XAD16大孔吸附树脂取出烘干；用有机溶剂甲醇将产物埃博霉素B萃取析出，采用高效液相色谱法HPLC取样检测，流动相，甲醇水6535体积比；上样体积，20L；时间，30MIN；流速，1ML/MIN，检测波长，249NM。本实施例中埃博霉素B的产量为45MG/L。0045烘干后的XAD16大孔吸附树脂经过预处理的方法处理后能够重复利用。0046实施例300471同实施例100482连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌向吸附柱2中加入预处理过的平均孔径为非极性大孔吸附树脂，非极性大孔吸附树脂的体积。

23、占吸附柱2容积的15；往发酵罐中倒入发酵培养基，发酵培养基的体积占发酵罐体积的75，所述的发酵培养基PH值为76，发酵培养基成分为酵母粉30G/L、玉米淀粉7G/L、磷酸二氢钠2G/L、磷酸氢二钠2G/L、MGSO47H2O4G/L、FESO47H2O03G/L、CACL23G/L、MNCL203G/L和葡萄糖15G/L，其中，预处理的具体过程为将非极性XAD16大孔吸附树脂在体积分数为30的甲醇水溶液中浸泡12H。说明书CN104073530A5/8页70049将发酵罐1分别和流加补料瓶4、酸碱平衡补料瓶5相连通，将发酵罐1的出口与吸附柱2的下端入口相连通，吸附柱2的上端开口和发酵罐1的入口。

24、相连通，使整个装置内部形成循环通路；将各仪器的接口密封连接后，将整个装置进行高压蒸汽115灭菌30MIN。00503发酵罐放大培养将活化后的纤维堆囊菌通过注射的方法接种于发酵罐1中，纤维堆囊菌的接种量为发酵培养基体积的8，整个过程保持无菌操作；然后，开启搅拌、通气，通气量为25L/MIN，控制发酵温度为30，发酵罐内压力为001MPA。00514吸附耦合循环开启当发酵罐中埃博霉素B和菌体浓度达到一定程度，即发酵48H，菌体处于对数生长中后期，开启第一恒流泵6，将发酵液从发酵罐1输出，流速为50ML/MIN，通过管路自下而上通过吸附柱2，从而实现产物、菌体及发酵液的分离，减除产物对发酵的抑制作用。

25、，菌体和发酵液通过管路返回到发酵罐1，保持循环流畅。00525同实施例1；00536发酵结束，回收产物经较长时间7D连续发酵后，发酵接近埃博霉素B合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵36H时，将吸附柱2中XAD16大孔吸附树脂取出烘干；用有机溶剂甲醇将产物埃博霉素B萃取析出，采用高效液相色谱法HPLC取样检测，流动相，甲醇水6535体积比；上样体积，20L；时间，30MIN；流速，1ML/MIN，检测波长，249NM。本实施例中埃博霉素B的产量为41MG/L。0054本实施例中XAD16大孔吸附树脂经过预处理的方法处理后能够重复利用。0055实施例400561纤维堆囊菌种子活化培养将纤维。

26、堆囊菌ATCC25569接种于M26固体培养基培养，然后将培养得到的菌体接种于M26液体培养基中振荡培养，之后将M26液体培养基培养得到的液体高速搅拌使菌体打匀，离心收集沉淀，加无菌水重悬得纤维堆囊菌种子液。M26培养基为土豆淀粉为8G/L、豆蛋白胨为2G/L、葡萄糖为2G/L、酵母粉为2G/L、MGSO4为2G/L、CACL2为2G/L、EDTAFE3溶液浓度为1ML/L，PH值为72，并于115下灭菌30MIN。00572连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌向吸附柱2中加入预处理过的平均孔径为的非极性大孔吸附树脂，非极性大孔吸附树脂的体积占吸附柱2容积的15；向发酵罐中加入发酵培养基，发酵培养。

27、基的体积占发酵罐体积的60，所述发酵培养基的PH值为72，发酵培养基成分为酵母粉40G/L、玉米淀粉5G/L、磷酸二氢钠1G/L、磷酸氢二钠15G/L、MGSO47H2O2G/L、FESO47H2O05G/L、CACL22G/L、MNCL205G/L和葡萄糖15G/L；其中，预处理的具体过程为将非极性XAD16大孔吸附树脂在体积分数为60的甲醇水溶液中浸泡16H。0058将发酵罐1分别和流加补料瓶4、酸碱平衡补料瓶5相连通，将发酵罐1的出口与吸附柱2的下端入口相连通，吸附柱2的上端开口和发酵罐1的入口相连通，使整个装置内部形成循环通路；将各仪器的接口密封连接后，再将装置进行高压蒸汽115灭菌3。

28、0MIN。00593同实施例2；00604同实施例1；00615同实施例1；00626发酵结束，回收产物经较长时间6D连续发酵后，发酵接近埃博霉素B合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵24H时，将吸附柱2中XAD16大孔吸附树脂取出说明书CN104073530A6/8页8烘干；用有机溶剂甲醇将产物埃博霉素B萃取析出，采用高效液相色谱法HPLC取样检测，流动相，甲醇水6535体积比；上样体积，20L；时间，30MIN；流速，1ML/MIN，检测波长，249NM。本实施例中埃博霉素B的产量为44MG/L。0063实施例500641同实施例400652连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌向吸附柱2。

29、中加入预处理过的平均孔径为的非极性大孔吸附树脂，非极性大孔吸附树脂的体积占吸附柱2容积的20；向发酵罐1中加入发酵培养基，发酵培养基的体积占发酵罐体积的70，所述的发酵培养基PH值为74，发酵培养基成分为酵母粉50G/L、玉米淀粉10G/L、磷酸二氢钠2G/L、磷酸氢二钠2G/L、MGSO47H2O5G/L、FESO47H2O03G/L、CACL23G/L、MNCL203G/L和葡萄糖12G/L。其中，预处理的具体过程为将非极性XAD16大孔吸附树脂在体积分数为40的甲醇水溶液中浸泡24H。0066将发酵罐1分别和流加补料瓶4、酸碱平衡补料瓶5连接，将发酵罐1和吸附柱2连接，使整个装置内部形成。

30、循环通路；将各仪器的接口密封连接后，将装置进行高压蒸汽灭菌。00673同实施例3；00684同实施例3；00695同实施例2；00706发酵结束，回收产物经较长时间7天连续发酵后，发酵接近埃博霉素B合成速率下降，即菌体浓度达到最大，继续发酵36H时，将吸附柱2中树脂取出烘干备；用有机溶剂甲醇将产物埃博霉素B萃取析出，采用高效液相色谱法HPLC取样检测，流动相，甲醇水6535体积比；上样体积，20L；时间，30MIN；流速，1ML/MIN，检测波长，249NM。本实施例中埃博霉素B的产量为47MG/L。0071实施例600721同实施例1。00732连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌向吸附柱2中加。

31、入经过预处理的平均孔径为的非极性大孔吸附树脂，非极性大孔吸附树脂的体积占吸附柱2容积的12；向发酵罐1中加入发酵培养基，发酵培养基的体积占发酵罐体积的55，发酵培养基的PH为76，发酵培养基的成分为酵母粉25G/L、玉米淀粉8G/L、磷酸二氢钠1G/L、磷酸氢二钠1G/L、MGSO47H2O2G/L、FESO47H2O04G/L、CACL25G/L、MNCL205G/L和葡萄糖12G/L。其中，预处理的具体过程为将非极性XAD16大孔吸附树脂在体积分数为50的甲醇水溶液中浸泡20H。0074将发酵罐1分别和流加补料瓶4、酸碱补料瓶5相连通，将发酵罐1的出口与吸附柱2的下端入口相连通，吸附柱2的。

32、上端开口和发酵罐1的入口相连通，使整个装置内部形成循环通路；将各仪器的接口密封连接后，将整个装置进行高压蒸汽115灭菌30MIN。00753发酵罐放大培养将步骤1活化后的纤维堆囊菌通过注射的方法接种于发酵罐1中，纤维堆囊菌的接种量为发酵培养基体积的10，整个过程保持无菌操作；然后，开启搅拌、通气，通气量为25L/MIN，控制发酵温度为28，发酵罐内压力为001MPA。00764吸附耦合循环开启当发酵罐1中发酵48H，即菌体处于对数生长中后期，开启说明书CN104073530A7/8页9第一恒流泵61，将发酵液从发酵罐1输出，流速为10ML/MIN，通过管路自下而上通过吸附柱2，从而实现产物埃博。

33、霉素B、菌体及发酵液的分离，减除产物埃博霉素B对发酵的抑制作用，菌体和发酵液通过管路返回到发酵罐1，保持循环流畅。00775通过流加补料瓶4以及酸碱补料瓶5，从发酵48H起，每12H向发酵罐中补加一次葡萄糖，每次补加量为每升发酵液中加入1G，直到发酵结束；通过酸碱补料瓶定时向发酵罐中进行酸碱补料，使PH值维持在76。发酵过程可以通过三通阀7取样分析，判断生长速率。00786发酵结束，回收产物经较长时间55D连续发酵后，发酵埃博霉素B合成速率出现下降趋势，即菌体浓度达到最大，继续发酵18H后，将吸附柱2中XAD16大孔吸附树脂取出烘干；用有机溶剂甲醇将产物埃博霉素B萃取析出，采用高效液相色谱法H。

34、PLC取样检测，流动相，甲醇水6535体积比；上样体积20L；时间30MIN；流速1ML/MIN，检测波长249NM。本实施例中埃博霉素B的产量为44MG/L。0079烘干后的XAD16大孔吸附树脂经过预处理的方法处理后能够重复利用。0080实施例700811纤维堆囊菌种子活化培养同实施例4。00822连续吸附耦合装置装料、组装和灭菌向吸附柱2中加入经过预处理的平均孔径为的非极性大孔吸附树脂，非极性大孔吸附树脂的体积占吸附柱2容积的18；向发酵罐1中加入发酵培养基，发酵培养基的体积占发酵罐体积的70，发酵培养基的PH为75，发酵培养基的成分为酵母粉35G/L、玉米淀粉9G/L、磷酸二氢钠2G/。

35、L、磷酸氢二钠2G/L、MGSO47H2O5G/L、FESO47H2O01G/L、CACL24G/L、MNCL204G/L和葡萄糖14G/L。其中，预处理的具体过程为将非极性XAD16大孔吸附树脂在体积分数为45的甲醇水溶液中浸泡15H。0083将发酵罐1分别和流加补料瓶4、酸碱补料瓶5相连通，将发酵罐1的出口与吸附柱2的下端入口相连通，吸附柱2的上端开口和发酵罐1的入口相连通，使整个装置内部形成循环通路；将各仪器的接口密封连接后，将整个装置进行高压蒸汽115灭菌30MIN。00843发酵罐放大培养将步骤1活化后的纤维堆囊菌通过注射的方法接种于发酵罐1中，纤维堆囊菌的接种量为发酵培养基体积的9。

36、，整个过程保持无菌操作；然后，开启搅拌、通气，通气量为25L/MIN，控制发酵温度为28，发酵罐内压力为001MPA。00854吸附耦合循环开启当发酵罐1中发酵56H，即菌体处于对数生长中后期，开启第一恒流泵61，将发酵液从发酵罐1输出，流速为10ML/MIN，通过管路自下而上通过吸附柱2，从而实现产物埃博霉素B、菌体及发酵液的分离，减除产物埃博霉素B对发酵的抑制作用，菌体和发酵液通过管路返回到发酵罐1，保持循环流畅。00865通过流加补料瓶4以及酸碱补料瓶5，从发酵56H起，每12H向发酵罐中补加一次葡萄糖，每次补加量为每升发酵液中加入1G，直到发酵结束；通过酸碱补料瓶定时向发酵罐中进行酸碱。

37、补料，使PH值维持在75。发酵过程可以通过三通阀7取样分析，判断生长速率。00876发酵结束，回收产物经较长时间65D连续发酵后，发酵埃博霉素B合成速率出现下降趋势，即菌体浓度达到最大，继续发酵12H后，将吸附柱2中XAD16大孔吸附树脂取出烘干；用有机溶剂甲醇将产物埃博霉素B萃取析出，采用高效液相色谱法HPLC说明书CN104073530A8/8页10取样检测，流动相，甲醇水6535体积比；上样体积20L；时间30MIN；流速1ML/MIN，检测波长249NM。本实施例中埃博霉素B的产量为42MG/L。0088烘干后的XAD16大孔吸附树脂经过预处理的方法处理后能够重复利用。0089本发明中，吸附柱采用可进行高温灭菌处理的材料，优选金属、陶瓷或玻璃，其还可以根据发酵液处理量大小，可以多个并联，或单独使用，或交替使用。0090综合上述实施例的实验结果可知，本发明的方法可实现埃博霉素B的连续吸附耦合发酵，且设备制作简单、成本低，操作简便，易于实现自动化，具有良好的应用前景。本发明采用的仪器成本低，连续吸附耦合发酵装置制作较为简单，循环流畅，操作方便，易于实现自动化。说明书CN104073530A101/1页11图1说明书附图CN104073530A11。