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1、10申请公布号CN104195240A43申请公布日20141210CN104195240A21申请号201410404056322申请日20140816C12Q1/68200601C12Q1/0420060171申请人中山鼎晟生物科技有限公司地址528437广东省中山市火炬开发区健康路1号一楼102室72发明人郭狄74专利代理机构中山市铭洋专利商标事务所普通合伙44286代理人邹常友54发明名称一种食品中沙门菌的PCR检测方法57摘要本发明具体为一种食品中沙门菌的PCR检测方法。该检测方法包括以下步骤（1）样品预处理取样后加入无菌生理盐水溶解；（2）细菌培养先进行前增菌再进行选择性增菌，并进。
2、行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；（3）DNA提取取菌悬液离心，沉淀洗涤，煮沸，悬浮菌体，冷却加入TRISHCL缓冲液，离心，取上清作为模板；（4）PCR扩增取沙门菌的引物对步骤（3）中的模板进行PCR扩增得PCR扩增产物；（5）PCR产物检测取扩增产物，进行凝胶电泳成像。该检测方法可迅速检出食品中沙门菌，检测结果准确，敏感度及特异度高。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104195240ACN104195240A1/1页21一种食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，包括以下。
3、步骤1样品预处理准确称取固体样品25G，粉碎，或量取液体样品510ML，在粉碎后的固体样品及液体样品中加入无菌生理盐水进一步溶解；2细菌培养将待测样品置入培养基中培养46H，取25G培养后红色可疑菌落，继续培养46H，将培养后的产物进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；3DNA提取取步骤2中的菌悬液510ML，离心58MIN，沉淀洗涤，煮沸58MIN，加入NAOH溶液悬浮菌体，冷却加入TRISHCL缓冲液，离心，取上清13UL作为模板；4PCR扩增取沙门菌的引物对步骤3中的模板进行PCR扩增；反应体系10PCRBUFFER缓冲液255UL，MG2试剂510UL，PCR引物5。
4、10UL，TAQDNA聚合酶25UL，加纯化水补足至25UL；反应过程95预变性5MIN，94变性30S，55退火30S，72延伸30S，进行30个循环；最后72延伸5MIN，得PCR扩增产物；5PCR产物检测取步骤4中反应得到的PCR扩增产物510UL，进行凝胶电泳成像。2根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤2中所述的培养基为加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMAGAR显色增养基。3根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤3中所述的沉淀洗涤均采用PBS缓冲液，所述的沉淀洗涤重复操作25次。4根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方。
5、法，其特征在于，步骤3中所述的NAOH溶液浓度为25MOL/L，所述的TRISHCL浓度为1215MOL/L，PH为8284。5根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤3中所述的离心速度为1000012000转/MIN。6根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤4中PCR扩增采用的PCR引物为INVA引物FCTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC；RAAAGGGCAATACGCAAAGAGGT；HILA引物FCTGCCGCAGTGTTAAGCATA；RCTGTCGCCTTAATCGCATGT。7根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测。
6、方法，其特征在于，步骤4中所述的MG2试剂选自MGCL2或MGSO4的一种或多种，所述的MG2试剂浓度为1520MMOL/L。8根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤4中所述的PCR引物浓度为为810MMOL/L。9根据权利要求1所述的食品中沙门菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤4中所述的TAQDNA聚合酶浓度为25U/UL。权利要求书CN104195240A1/4页3一种食品中沙门菌的PCR检测方法技术领域0001本发明属食品安全检测领域，具体涉及食品中沙门菌的快速检测方法。背景技术0002沙门菌广泛存在于自然界，是引起食源性疾病的首要病原菌，人与动物均可感染，。
7、人类感染沙门菌后可发生伤寒、副伤寒、胃肠炎等疾病，伤寒传染性强、病程长，患者需住院隔离治疗，是我国传染病防治法中规定报道的乙类传染病。近年来，随着临床抗生素的不合理应用，且病原菌耐药性的产生及变异增加，伤害早期诊断较困难，因此，有必要开发灵敏的病原菌的早期检测方法。0003目前，公共卫生、食品安全及出入境检验检疫中均将沙门菌检测作为常规必需检测的项目。经典的检测方法为血培养，阳性率可达6080，但该检测方法耗时长，约35D，且检出率受采血量及服用抗生素等多种因素影响，此外，分离培养也较困难，因此，准确性及特异性均较差。近年来，有文献报道采用PCR方法检测食品中沙门菌，但这些方法大多侧重于单一P。
8、CR，而食品中沙门菌含量往往极低，传统的PCR检测则显示出明显缺陷。为此，本发明提供一种特异性强灵敏度高的多重PCR检测方法。发明内容0004本发明针对上述现有技术的不足，提供一种食品中沙门菌的快速检测方法，检测结果准确，特异性及灵敏度均较高。0005本发明的技术方案如下0006一种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤00071样品预处理准确称取固体样品25G，粉碎，或量取液体样品510ML，在粉碎后的固体样品及液体样品中加入无菌生理盐水进一步溶解；00082细菌培养将待测样品置入培养基中培养46H，取25G培养后红色可疑菌落，继续培养46H，将培养后的产物进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加。
9、入无菌生理盐水配制成菌悬液；00093DNA提取取步骤2中的菌悬液510ML，离心58MIN，沉淀洗涤，煮沸58MIN，加入NAOH溶液悬浮菌体，冷却加入TRISHCL缓冲液，离心，取上清13UL作为模板；00104PCR扩增取沙门菌的引物对步骤3中的模板进行PCR扩增；0011反应体系10PCRBUFFER缓冲液255UL，MG2试剂510UL，PCR引物510UL，TAQDNA聚合酶25UL，加纯化水补足至25UL；0012反应过程95预变性5MIN，94变性30S，55退火30S，72延伸30S，进行30个循环；最后72延伸5MIN，得PCR扩增产物；00135PCR产物检测取步骤4中反。
10、应得到的PCR扩增产物510UL，分别进行凝胶电泳成像。说明书CN104195240A2/4页40014优选的，所述的培养基为加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMAGAR显色增养基。0015优选的，所述的沉淀洗涤均采用PBS缓冲液，所述的沉淀洗涤重复操作25次。0016优选的，所述的NAOH溶液浓度为25MOL/L，所述的TRISHCL浓度为1215MOL/L，PH为8284。0017优选的，所述的离心速度为1000012000转/MIN。0018步骤4中PCR扩增采用的PCR引物为0019INVA引物FCTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC；0020RAAAGGGCAATACGCAAA。
11、GAGGT；0021HILA引物FCTGCCGCAGTGTTAAGCATA；0022RCTGTCGCCTTAATCGCATGT。0023优选的，所述的MG2试剂选自MGCL2或MGSO4的一种或多种，所述的MG2试剂浓度为1520MMOL/L。0024优选的，所述的PCR引物浓度为为810MMOL/L。0025优选的，所述的TAQDNA聚合酶浓度为25U/UL。0026本发明与现有技术相比，有益效果体现在00271本发明先对细菌先进行前增菌，然后进行选择性增菌，并鉴定，可对食品中沙门菌先进行定性检测，操作简便，为后续的PCR定量检测提供了条件。00282本发明中对待测样品进行细菌培养时，培养基。
12、不采用传统的NACL肉汤，而是采用加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMAGAR显色增养基，增菌效果好，多重PCR效果良好。00293INVA是调控沙门菌侵入上皮细胞的重要因子，也是产生致病性的重要因子，HILA也是毒力岛SP11基因之一，与沙门菌对肠道上皮细胞的侵袭有关，本发明选择沙门菌特异的INVA及HILA基因，设计沙门菌PCR引物，进行二重PCR扩增，可特异性的检测沙门菌，提高检测结果的特异性，减少假阳性。同时，对二重PCR扩增的反应条件进行了优化，避免了引物间相互干扰，提高了检测结的敏感性。具体实施方式0030实施例10031一种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤00321样品。
13、预处理准确称取白木耳2G，粉碎，加入无菌生理盐水进一步溶解；00332细菌培养将步骤1中得到的白木耳置入加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMAGAR显色增养基中培养4H，取2G培养后红色可疑菌落，继续培养4H，将培养后的产物进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；00343DNA提取取步骤2中的菌悬液5ML，离心5MIN，采用PBS缓冲液沉淀洗涤，重复2次，煮沸5MIN，加入2MOL/LNAOH溶液悬浮菌体，冷却加入浓度为12MOL/L，PH为82的TRISHCL缓冲液，离心，离心速度为10000转/MIN取上清1UL作为模板；00354PCR扩增取沙门菌的引物对步骤3中的模。
14、板进行PCR扩增，INVA引物FCTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC；0036RAAAGGGCAATACGCAAAGAGGT；0037HILAFCTGCCGCAGTGTTAAGCATA；说明书CN104195240A3/4页50038RCTGTCGCCTTAATCGCATGT；0039反应体系10PCRBUFFER缓冲液25UL，15MMOL/L的MGCL2试剂5UL，8MMOL/LPCR引物5UL，2U/UL的TAQDNA聚合酶2UL，加纯化水补足至25UL；0040反应过程95预变性5MIN，94变性30S，55退火30S，72延伸30S，进行30个循环；最后72延伸5MIN，得P。
15、CR扩增产物；00415PCR产物检测取步骤4中反应得到的PCR扩增产物5UL，进行凝胶电泳成像。0042实施例20043一种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤00441样品预处理准确称取香菇5G，粉碎，或量取液体样品加入无菌生理盐水进一步溶解；00452细菌培养将待测样品置入加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMAGAR显色增养基中培养H，取5G培养后红色可疑菌落，继续培养6H，将培养后的产物进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液；00463DNA提取取步骤2中的菌悬液10ML，离心8MIN，采用PBS缓冲液沉淀洗涤，重复5次，煮沸8MIN，加入5MOL/L的NAOH。
16、溶液悬浮菌体，冷却加入浓度为15MOL/L，PH为84的TRISHCL缓冲液，离心，离心速度为12000转/MIN取上清3UL作为模板；00474PCR扩增取沙门菌的引物对步骤3中的模板进行PCR扩增，INVA引物FCTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC；0048RAAAGGGCAATACGCAAAGAGGT；0049HILAFCTGCCGCAGTGTTAAGCATA；0050RCTGTCGCCTTAATCGCATGT；0051反应体系10PCRBUFFER缓冲液5UL，20MMOL/L的MGSO410UL，10MMOL/L的PCR引物10UL，5U/UL的TAQDNA聚合酶5UL，加纯。
17、化水补足至25UL；0052反应过程95预变性5MIN，94变性30S，55退火30S，72延伸30S，进行30个循环；最后72延伸5MIN，得PCR扩增产物；00535PCR产物检测取步骤4中反应得到的PCR扩增产物10UL，分别进行凝胶电泳成像。0054实施例30055一种食品中沙门菌的PCR检测方法，包括以下步骤00561样品预处理准确量取碳酸饮料5ML，加入无菌生理盐水进一步溶解；00572细菌培养将待测样品置入加入了亚硒酸盐胱氨酸增菌液的CHRMAGAR显色增养基中培养5H，取3G培养后红色可疑菌落，继续培养5H，将培养后的产物进行细菌鉴定，取鉴定后的菌落加入无菌生理盐水配制成菌悬液。
18、；00583DNA提取取步骤2中的菌悬液8ML，离心6MIN，采用PBS缓冲液沉淀洗涤，重复3次，煮沸6MIN，加入35MOL/L的NAOH溶液悬浮菌体，冷却加入13MOL/L，PH为83的TRISHCL缓冲液，离心，离心速度为11000转/MIN，取上清2UL作为模板；00594PCR扩增取沙门菌的引物对步骤3中的模板进行PCR扩增，INVA引物FCTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC；说明书CN104195240A4/4页60060RAAAGGGCAATACGCAAAGAGGT；0061HILAFCTGCCGCAGTGTTAAGCATA；0062RCTGTCGCCTTAATCGCAT。
19、GT；0063反应体系10PCRBUFFER缓冲液4UL，18MMOL/L的MGCL2试剂8UL，9MMOL/L的PCR引物510UL，3U/UL的TAQDNA聚合酶35UL，加纯化水补足至25UL；0064反应过程95预变性5MIN，94变性30S，55退火30S，72延伸30S，进行30个循环；最后72延伸5MIN，得PCR扩增产物；00655PCR产物检测取步骤4中反应得到的PCR扩增产物510UL，分别进行凝胶电泳成像。0066上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。说明书CN104195240A。