技术领域
本发明涉及冻存液领域，特别涉及一种用于脂肪干细胞的冻存液及其制备方法以及培养基。
背景技术
骨髓干细胞、脐带干细胞和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来研究较多的几种干细胞。骨髓干细胞由于不易取材、扩增较慢、对于体弱和老年患者不适用以及伦理等问题，给临床应用带来不便。脐带间充质干细胞与骨髓干细胞相比来源较广泛，免疫原性低，几乎无免疫排斥反应。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，它与骨髓干细胞、脐带干细胞相比有很多优点，研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，生长均匀、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛、体内储备量大、适宜自体移植、安全性能高，脂肪干细胞库的建立逐渐成为近年来新的研究热点之一。
公开号为CN102550542A的中国专利公开了一种用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立。该无血清冻存液能够用于脂肪干细胞的冻存，且冻存效果优于含血清冻存液的冻存效果，避免含有血清的冻存液在临床使用中可能存在的风险。
基于对该无血清冻存液的深入研究，本发明人意识到虽然该无血清冻存液具有良好的冻存效果，但是该无血清冻存液只是提供一种用KSR配制的特定无血清冻存液，并没有进一步对无血清冻存液中的无血清培养基进行深入研究。为此，本发明人对无血清冻存液中的无血清培养基进行进一步研究，使该无血清培养基与血清替代组分KSR以及二甲基亚砜复配之后的冻存效果进一步提升。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养基，该培养基在与血清替代组分KSR以及二甲基亚砜复配得到的用于脂肪干细胞的冻存液具有优异的冻存效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种培养基，包括如下重量份数的组分：
通过采用上述技术方案，无机盐复合物可以调节细胞渗透压、调节酶的活性以及溶液酸碱度。氨基酸复合物是细胞合成蛋白质的必须原料。维生素复合物是维持细胞生命活动的生物活性物质，能够在细胞体内形成辅基或辅酶。葡萄糖为细胞生命活动主要的能量来源。丙酮酸钠可以作为替代供能物质。在葡萄糖不足的情况下，细胞也可以代谢丙酮酸钠获得能量。丁酸和丁酸钠构成溶液的pH缓冲体系，维持溶液的pH平衡。柠檬酸铁能够为细胞提供铁元素，可替代血清中的转铁蛋白发挥生物功效。血清替代物KSR的成分中含有亚硒酸钠和亚硒酸，同时包括含钡化合物、含锡无机化合物、含银无机化合物、含铵化合物和含钙化合物。当KSR接触酸或漂白液时会释放出有毒气体。而该培养基一方面能够维持pH平衡，另一方面又有丙酮酸钠等还原剂，从而减少KSR释放毒气的危险。同时pH平衡也能够维持含铵化合物的稳定。而体系的稳定会带来冻存效果的提升。因此，采用该培养基得到的冻存液从多个方面提高其冻存效果。
本发明进一步设置为：按照重量份，还包括酚红9-10份。
通过采用上述技术方案，酚红是一种深红色结晶性粉末，几乎不溶于醚和氯仿，溶于氢氧化碱或碳酸碱溶液中呈深红色，在空气中稳定。酚红可作为酸碱指示剂，较酚酞灵敏，偏酸，范围6.8-8.0，由黄到红。
本发明进一步设置为：按照重量份，还包括纤粘连蛋白0.1-1份。
通过采用上述技术方案，纤粘连蛋白能够促进细胞的贴壁生长，同时也是重要的分裂素以及维持细胞正常功能的分化因子，对细胞的繁殖和分化有着重要作用。本发明人意外地发现，纤粘连蛋白和柠檬酸铁的复合使用能够相互促进，增强冻存液的冻存效果。
本发明进一步设置为：按照重量份，还包括激素复合物5-25份，所述激素复合物包括胰岛素、胰高血糖素和孕酮，按照重量比，所述胰岛素∶胰高血糖素∶孕酮＝3-6∶3-5∶1。
通过采用上述技术方案，激素复合物是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质。胰岛素更是细胞必不可少的一种激素。而胰高血糖素能够与胰岛素配合，维持葡萄糖浓度稳定，促进细胞的生长。孕酮又名黄体酮，是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素。将胰岛素、胰高血糖素和孕酮复合使用，增强对细胞的促进作用。
本发明进一步设置为：按照重量份，还包括抗生素50000份，所述抗生素为青霉素或者链霉素。
通过采用上述技术方案，抗生素的使用能够避免细胞的培养、冻存和复苏过程中受到杂菌的干扰，影响试验结果。而青霉素和链霉素均属于常用抗生素，成本较低，抗菌效果显著。
本发明进一步设置为：所述无机盐复合物包括无水氯化钙、硫酸镍、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、硫酸锌，按照重量比，所述无水氯化钙∶硫酸镍∶氯化钾∶无水硫酸镁∶氯化钠∶硫酸锌＝53∶4∶80∶20∶1280∶9。
通过采用上述技术方案，多种无机盐的存在能够充分调节细胞内外的离子平衡和溶液酸碱度，为细胞的生长提供合适的生长环境。
本发明进一步设置为：所述维生素复合物包括泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡多辛、维生素A、维生素C和维生素E，按照重量比，所述泛酸钙∶酒石酸胆碱∶叶酸∶肌醇∶烟酰胺∶核黄素∶盐酸硫胺∶盐酸吡多辛∶维生素A∶维生素C和维生素E＝2∶3.6∶2∶3.6∶2∶0.2∶2∶2∶1.1∶2∶1。
通过采用上述技术方案，多种维生素能够在细胞体内形成多种不同的辅基或辅酶，从而参与不同的生命活动，维持细胞的正常生命活动。
本发明进一步设置为：所述氨基酸复合物包括L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸，按照重量比，L-盐酸精氨酸∶L-盐酸胱氨酸∶甘氨酸∶L-盐酸组氨酸∶L-异亮氨酸∶L-亮氨酸∶L-盐酸赖氨酸∶L-甲硫氨酸∶L-苯丙氨酸∶L-丝氨酸∶L-苏氨酸∶L-色氨酸∶L-酪氨酸∶L-缬氨酸＝84∶63∶30∶42∶105∶105∶146∶30∶66∶42∶95∶16∶72∶94。
通过采用上述技术方案，作为细胞合成蛋白质的必须原料，提供多种氨基酸能够满足细胞合成蛋白质时的原料需求，避免细胞因为原料缺乏而无法合成需要的蛋白质，从而影响细胞的生命活动。
本发明的另一发明目的在于提供一种用于脂肪干细胞的冻存液，包括如下组分：二甲基亚砜、血清替代组分KSR和上述培养基，所述二甲基亚砜的体积分数为8-20％，所述血清替代组分KSR的体积分数为70-85％，所述培养基的体积分数为5-15％。
通过采用上述技术方案，培养基与血清替代组分KSR以及二甲基亚砜复配，增强用于脂肪干细胞的冻存液的冻存效果。
本发明还有一发明目的在于提供一种用于脂肪干细胞的冻存液的制备方法，包括如下制备步骤：
Step1：按照重量份，称取无机盐复合物7200-7300份、氨基酸复合物980-1000份、维生素复合物40-45份、葡萄糖1000-1100份、丙酮酸钠100-110份、丁酸60-75份、丁酸钠80-110份、柠檬酸铁0.15-0.22份、水1000000份、酚红9-10份、纤粘连蛋白0.1-1份、激素复合物5-25份、抗生素50000份，混合并搅拌均匀，得到培养基；
Step2：按照体积分数，量取8-20％的二甲基亚砜、70-85％的血清替代组分KSR和5-15％的培养基，混合并搅拌均匀即可。
通过采用上述技术方案，培养基与血清替代组分KSR以及二甲基亚砜能够充分混合，各组分间相互作用，相互促进，增强用于脂肪干细胞的冻存液的冻存效果。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、纤粘连蛋白和柠檬酸铁的复合使用能够相互促进，增强冻存液的冻存效果和保存效果；
2、丁酸钠的存在不仅与丁酸构成pH缓冲体系，维持体系pH的稳定，同时还能够与柠檬酸铁共同作用，促进蛋白表达。维生素C能够影响柠檬酸铁中的铁离子的释放，控制铁离子浓度，从而也进一步影响蛋白的表达；
3、本发明通过改进冻存液中的培养基的组分，并进行含量优化设计，从而使培养基在与血清替代组分KSR和二甲基亚砜复配时，能够增强用于脂肪干细胞的冻存液的冻存效果。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
在实施例一至五中，无机盐复合物包括无水氯化钙、硫酸镍、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、硫酸锌，按照重量比，无水氯化钙∶硫酸镍∶氯化钾∶无水硫酸镁∶氯化钠∶硫酸锌＝53∶4∶80∶20∶1280∶9。氨基酸复合物包括L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸，按照重量比，L-盐酸精氨酸∶L-盐酸胱氨酸∶甘氨酸∶L-盐酸组氨酸∶L-异亮氨酸∶L-亮氨酸∶L-盐酸赖氨酸∶L-甲硫氨酸∶L-苯丙氨酸∶L-丝氨酸∶L-苏氨酸∶L-色氨酸∶L-酪氨酸∶L-缬氨酸＝84∶63∶30∶42∶105∶105∶146∶30∶66∶42∶95∶16∶72∶94。维生素复合物包括泛酸钙、酒石酸胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸硫胺、盐酸吡多辛、维生素A、维生素C和维生素E，按照重量比，泛酸钙∶酒石酸胆碱∶叶酸∶肌醇∶烟酰胺∶核黄素∶盐酸硫胺∶盐酸吡多辛∶维生素A∶维生素C和维生素E＝2∶3.6∶2∶3.6∶2∶0.2∶2∶2∶1.1∶2∶1。
实施例一
一种用于脂肪干细胞的冻存液的制备方法，包括如下制备步骤：
Step1：按照重量份，称取无机盐复合物7200份、氨基酸复合物990份、维生素复合物40份、葡萄糖1000份、丙酮酸钠110份、丁酸68份、丁酸钠80份、柠檬酸铁0.15份、水1000000份、酚红9份、纤粘连蛋白1份、激素复合物25份、青霉素50000份，混合并搅拌均匀，得到培养基；
Step2：按照体积分数，量取8％的二甲基亚砜、77％的血清替代组分KSR和15％的培养基，混合并搅拌均匀即可。
其中激素复合物包括胰岛素、胰高血糖素和孕酮，按照重量比，所述胰岛素∶胰高血糖素∶孕酮＝3∶3∶1。
实施例二
一种用于脂肪干细胞的冻存液的制备方法，包括如下制备步骤：
Step1：按照重量份，称取无机盐复合物7230份、氨基酸复合物980份、维生素复合物41份、葡萄糖1030份、丙酮酸钠107份、丁酸60份、丁酸钠85份、柠檬酸铁0.22份、水1000000份、酚红9.2份、纤粘连蛋白0.8份、激素复合物20份、链霉素50000份，混合并搅拌均匀，得到培养基；
Step2：按照体积分数，量取14％的二甲基亚砜、74％的血清替代组分KSR和12％的培养基，混合并搅拌均匀即可。
其中激素复合物包括胰岛素、胰高血糖素和孕酮，按照重量比，所述胰岛素∶胰高血糖素∶孕酮＝3∶5∶1。
实施例三
一种用于脂肪干细胞的冻存液的制备方法，包括如下制备步骤：
Step1：按照重量份，称取无机盐复合物7260份、氨基酸复合物985份、维生素复合物43份、葡萄糖1060份、丙酮酸钠105份、丁酸65份、丁酸钠90份、柠檬酸铁0.18份、水1000000份、酚红9.4份、纤粘连蛋白0.6份、激素复合物15份、青霉素50000份，混合并搅拌均匀，得到培养基；
Step2：按照体积分数，量取20％的二甲基亚砜、70％的血清替代组分KSR和10％的培养基，混合并搅拌均匀即可。
其中激素复合物包括胰岛素、胰高血糖素和孕酮，按照重量比，所述胰岛素∶胰高血糖素∶孕酮＝4∶3∶1。
实施例四
一种用于脂肪干细胞的冻存液的制备方法，包括如下制备步骤：
Step1：按照重量份，称取无机盐复合物7280份、氨基酸复合物995份、维生素复合物42份、葡萄糖1080份、丙酮酸钠103份、丁酸70份、丁酸钠95份、柠檬酸铁0.2份、水1000000份、酚红9.6份、纤粘连蛋白0.4份、激素复合物10份、链霉素50000份，混合并搅拌均匀，得到培养基；
Step2：按照体积分数，量取10％的二甲基亚砜、85％的血清替代组分KSR和5％的培养基，混合并搅拌均匀即可。
其中激素复合物包括胰岛素、胰高血糖素和孕酮，按照重量比，所述胰岛素∶胰高血糖素∶孕酮＝6∶4∶1。
实施例五
一种用于脂肪干细胞的冻存液的制备方法，包括如下制备步骤：
Step1：按照重量份，称取无机盐复合物7300份、氨基酸复合物1000份、维生素复合物45份、葡萄糖1100份、丙酮酸钠100份、丁酸75份、丁酸钠100份、柠檬酸铁0.16份、水1000000份、酚红10份、纤粘连蛋白0.1份、激素复合物5份、青霉素50000份，混合并搅拌均匀，得到培养基；
Step2：按照体积分数，量取17％的二甲基亚砜、75％的血清替代组分KSR和8％的培养基，混合并搅拌均匀即可。
其中激素复合物包括胰岛素、胰高血糖素和孕酮，按照重量比，所述胰岛素∶胰高血糖素∶孕酮＝6∶5∶1。
冻存试验
参照公开号为CN102550542A的中国专利的实施例1-4进行脂肪干细胞的分离、培养、冻存、复苏。其中，在进行脂肪干细胞冻存时，分别采用按照实施例一至五制备的冻存液进行冻存。
参照公开号为CN102550542A的中国专利的实施例5对复苏的脂肪干细胞的存活率进行测定并记录。
表1实施例一至五冻存后复苏的脂肪干细胞的存活率记录表
组别 冻存1个月复苏 冻存3个月复苏 冻存6个月复苏 实施例一 96.4％ 96.4％ 96.7％ 实施例二 96.8％ 96.6％ 96.5％ 实施例三 97.1％ 97.0％ 96.8％ 实施例四 96.7％ 96.8％ 96.6％ 实施例五 96.5％ 96.5％ 96.5％ 平均值 96.7％ 96.66％ 96.62％
从表1可知，细胞冻存1个月、3个月和6个月的细胞存活率平均值分别为96.7％、96.66％和96.62％。可见，本发明冻存液的冻存效果受到冻存时间的影响较小，冻存性能稳定，冻存效果优异。而在实施例一至五中，实施例三的存活率最高，可见使用按照实施例三制备的冻存液对细胞的冻存效果最优。
保存试验
各取按照实施例一至五制备的冻存液，存放于同个清洁无菌的冷藏柜中，控制冷藏柜的温度为-20℃，存放一个月后取出并恢复到室温。
参照公开号为CN102550542A的中国专利的实施例1-4进行脂肪干细胞的分离、培养、冻存、复苏。其中，在进行脂肪干细胞冻存时，分别采用按照实施例一至五制备，经过-20℃存放一个月后取出并恢复到室温的冻存液进行冻存。
参照公开号为CN102550542A的中国专利的实施例5对本发明的实施例一至五分别进行复苏的脂肪干细胞的存活率测定并进行记录。
表2实施例一至五冻存后复苏的脂肪干细胞的存活率记录表(冻存液经过-20℃存放一个月处理)
组别 冻存1个月复苏 冻存3个月复苏 冻存6个月复苏 实施例一 96.4％ 96.4％ 96.7％ 实施例二 96.6％ 96.5％ 96.5％ 实施例三 97.1％ 97.0％ 96.8％ 实施例四 96.7％ 96.7％ 96.4％ 实施例五 96.5％ 96.4％ 96.3％ 平均值 96.66％ 96.6％ 96.54％
表3实施例一至五冻存后复苏的脂肪干细胞的存活率变化记录表(冻存液经过-20℃存放一个月处理后的存活率减去冻存液未经过-20℃存放一个月处理后的存活率)
组别 冻存1个月复苏 冻存3个月复苏 冻存6个月复苏 实施例一 0 0 0％ 实施例二 -0.2％ -0.1％ 0 实施例三 0 0 0％ 实施例四 0 -0.1％ -0.2％ 实施例五 0％ -0.1％ -0.2％ 平均值 -0.04％ -0.06％ -0.08％
从表3可知，经过-20℃存放一个月处理后，冻存液的冻存效果几乎不发生改变，可见本发明具有良好的保存效果。
对比例一
选用公开号为CN102550542A的中国专利的实施例11中的组别1进行作为对比例一。
对比例二
与实施例三不同的是去除柠檬酸铁，其他均与实施例三相同。
对比例三
与实施例三不同的是去除纤粘连蛋白，其他均与实施例三相同。
对比例四
与实施例三不同的是同时去除柠檬酸铁和纤粘连蛋白，其他均与实施例三相同。
对比例五
与实施例三不同的是按照重量份，丁酸为55份，丁酸钠78份，柠檬酸铁为0.1份，纤粘连蛋白为0.05份，其他均与实施例三相同。
对比例六
与实施例三不同的是按照重量份，丁酸为80份，丁酸钠113份，柠檬酸铁为0.25份，纤粘连蛋白为1.1份，其他均与实施例三相同。
参照冻存试验对实施例三和对比例一至六进行测定并记录。
表4实施例三和对比例一至六冻存后复苏的脂肪干细胞的存活率记录表
组别 冻存1个月复苏 冻存3个月复苏 冻存6个月复苏 实施例三 97.1％ 97.0％ 96.8％ 对比例一 94.8 93.6 92.3 对比例二 96.1 95.8 95.3 对比例三 95.6 95.3 94.3 对比例四 95.1 94.8 93.6 对比例五 96.7 96.6 96.4 对比例六 96.5 96.2 96.0
从表4可得出以下结论：
对比实施例三和对比例一可知，实施例三的1个月、3个月和6个月的存活率均高于对比例一。可见本发明的冻存液的冻存效果优于对比例一。
对比实施例三和对比例二至四可知，实施例三的1个月、3个月和6个月的存活率均高于对比例二和三，而对比例四的1个月、3个月和6个月的存活率均低于对比例二和三。由此可见，柠檬酸铁和纤粘连蛋白均各自能够增强本发明的冻存效果。且当柠檬酸铁和纤粘连蛋白同时使用时，柠檬酸铁和纤粘连蛋白之间能够发生相互作用，增强本发明的冻存效果。
对比实施例三和对比例五至六可知，实施例三的1个月、3个月和6个月的存活率均高于对比例五至六。由此可见，当丁酸、丁酸钠、柠檬酸铁和纤粘连蛋白的用量高于或者低于实施例三中的对应组分用量时，冻存液的冻存效果均会下降。
参照保存试验对实施例三和对比例一至六进行测试并记录。
表5实施例三和对比例一至六冻存后复苏的脂肪干细胞的存活率记录表(冻存液经过-20℃存放一个月处理)
组别 冻存1个月复苏 冻存3个月复苏 冻存6个月复苏 实施例三 97.1％ 97.0％ 96.8％ 对比例一 94.3％ 92.4％ 90.6％ 对比例二 95.6％ 95％ 94.2％ 对比例三 94.7％ 94.1％ 92.5％ 对比例四 94.1％ 93.5％ 91.7％ 对比例五 96.6％ 96.5％ 96.3％ 对比例六 96.5％ 96.1％ 96.0％
表6实施例三和对比例一至六冻存后复苏的脂肪干细胞的存活率变化记录表(冻存液经过-20℃存放一个月处理后的存活率减去冻存液未经过-20℃存放一个月处理后的存活率)
组别 冻存1个月复苏 冻存3个月复苏 冻存6个月复苏 实施例三 0 0 0 对比例一 -0.5％ -1.2％ -1.7％ 对比例二 -0.5％ -0.8％ -1.1％ 对比例三 -0.9％ -1.2％ -1.8％ 对比例四 -1％ -1.3％ -1.9％ 对比例五 -0.1％ -0.1％ -0.1％ 对比例六 0 -0.1％ 0
从表6可得出以下结论：
对比实施例三和对比例一可知，在冻存液经过-20℃存放一个月处理后，实施例三的1个月、3个月和6个月的存活率未发生明显变化，而对比例一的1个月、3个月和6个月的存活率变化值远高于实施例三。可见本发明的冻存液的保存效果优于对比例一。
对比实施例三和对比例二至四可知，在冻存液经过-20℃存放一个月处理后，实施例三的1个月、3个月和6个月的存活率变化值均低于对比例二和三，而对比例四的1个月、3个月和6个月的存活率变化值高于对比例二。对比例三的1个月、3个月和6个月的存活率变化值与对比例四的1个月、3个月和6个月的存活率变化值接近。由此可见，柠檬酸铁对本发明的保存效果影响较小，而纤粘连蛋白能够增强本发明的保存效果。但是，当柠檬酸铁和纤粘连蛋白同时使用时，柠檬酸铁和纤粘连蛋白之间能够发生相互作用，增强本发明的保存效果。
对比实施例三和对比例五至六可知，实施例三的1个月、3个月和6个月的存活率变化值与对比例五至六1个月、3个月和6个月的存活率变化值相差较少。由此可见，当丁酸、丁酸钠、柠檬酸铁和纤粘连蛋白的用量高于或者低于实施例三中的对应组分用量时，冻存液的保存效果不会发生明显变化。