提高油用牡丹‘凤丹’种子Α亚麻酸含量的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810140922.0 (22)申请日 2018.02.11 (71)申请人 青岛农业大学 地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路 700号 (72)发明人 郝青 李真 刘庆华 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 高芬芳 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 1/04(2006.01) A01H 5/10(2018.01) (54)发明名称 提高油用牡丹 凤丹 种子-亚麻酸含量的 方法 (57。

2、)摘要 本发明公开了提高油用牡丹 凤丹 种子- 亚麻酸含量的方法。 本发明所提供的提高油用牡 丹 凤丹 种子-亚麻酸含量的方法， 包括如下 步骤： (1)花粉采集； (2)授粉； (3)种子采集： 采集 所述步骤(2)中授粉后的 凤丹 的果实， 统计结 实率， 筛选结实率25.0粒/朵的组合并收集其 种子， 测定所述种子的-亚麻酸含量； (4)优质 组合筛选： 以所述步骤(3)中-亚麻酸含量为指 标， 筛选种子的-亚麻酸含量160mg/g的牡丹 品种作为母本 凤丹 的最佳授粉品种； (5)授粉 品种的应用： 得到-亚麻酸含量提高的油用种 子。 采用本发明的方法可提高 凤丹 种子-亚 麻酸含量，。

3、 从而提高 凤丹 种子的品质。 权利要求书1页 说明书5页 CN 108157167 A 2018.06.15 CN 108157167 A 1.提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 包括如下步骤： (1)花粉采集： 在大蕾期采集作为父本的不同牡丹品种的花药， 将所述花药干燥至开裂 散粉， 收集花粉， 作为杂交父本； (2)授粉： 在牡丹品种 凤丹 的花瓣展开之前将其雄蕊去除， 套袋， 待柱头分泌粘液时， 将所述步骤(1)中筛选的作为杂交父本的花粉授于 凤丹 柱头上， 套袋， 完成授粉； (3)种子采集： 采集所述步骤(2)中授粉后的 凤丹 的果实， 统计结实率， 筛选结实率 25.。

4、0粒/朵的组合并收集其种子， 测定所述种子的 -亚麻酸含量； (4)优质组合筛选： 以所述步骤(3)中 -亚麻酸含量为指标， 筛选种子的 -亚麻酸含量 160mg/g的牡丹品种作为母本 凤丹 的最佳授粉品种； (5)授粉品种的应用： 将所述步骤(4)筛选得到的最佳授粉品种作为授粉树进行应用， 对所述 凤丹 品种进行授粉， 采集授粉后得到的种子， 即得到 -亚麻酸含量提高的油用种 子。 2.根据权利要求1所述的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 其特征在于： 所述步骤(1)中所述采集的时间为开花前两天的早上8时10时。 3.根据权利要求1或2所述的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含。

5、量的方法， 其特征在 于： 所述干燥为自然风干。 4.根据权利要求1所述的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 其特征在于： 所述步骤(2)的牡丹品种 凤丹 为生长发育正常、 枝条粗细一致的6年10年生的 凤丹 植 株。 5.根据权利要求1或4所述的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 其特征在 于： 所述步骤(2)中所述授粉的时间为晴天无风的上午8时10时。 6.根据权利要求1所述的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中所述种子采集的时间为授粉后90天105天。 7.根据权利要求1或6所述的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方。

6、法， 其特征在 于： 所述步骤(3)中的果实呈黄色， 种子变为茶褐色的时候摘下果实， 采收种子。 8.根据权利要求1所述的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 其特征在于： 所述步骤(3)的结实率结实数/授粉花朵数。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108157167 A 2 提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物种子生产领域， 特别涉及提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量 的方法。 背景技术 0002 根据碳碳键的饱和程度不同， 脂肪酸可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。 饱和脂 肪酸丰富的高脂饮食可能会导致心血管疾病， 而不饱和脂。

7、肪酸是人体必需的脂肪酸。 不饱 和脂肪酸又可分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸两种。 多不饱和脂肪酸具有降低血脂 水平、 预防心血管疾病、 降低血清低密度脂蛋白胆固醇水平的作用。 根据双键的位置及功能 又将多不饱和脂肪酸分为-3系列和-6系列。 -亚麻酸属于-3系列多不饱和脂肪酸， 是机体必须的生命活性因子二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid， EPA)和二十二碳六烯 酸(docosahexaenoic acid， DHA)的合成前体， 人体不能自身合成， 主要从膳食中摄取， 对人 体健康起着重要的作用。 研究发现适量的摄入 -亚麻酸具有预防冠心病、 心肌梗塞， 降低缺 血。

8、心脏病和心脏猝死的风险， 降低血清胆固醇， 增加自身免疫力， 提醒健脑， 增强注意力和 记忆力等功效。 0003 牡丹隶属芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(section Moutan)， 是集 观赏、 药用和油用于一身的重要木本经济植物。 牡丹是中国的传统名花， 牡丹的根即丹皮是 中国传统中药材， 其种子籽油中不饱和脂肪酸含量高达90， 尤其富含被誉为 “植物脑黄 金” 的 -亚麻酸， 占40以上， 被称为我国最具潜力的木本油料作物， 而且， 国家卫生部于 2011年批准牡丹籽油成为新资源食品。 与其他油料作物相比， 油用牡丹具有适生范围广、 结 籽量大、 含油。

9、量高且品质好等特点， 目前油用牡丹的主栽品种是 凤丹 (P.ostii)， 在河北、 河南、 山东、 安徽、 陕西、 四川等省市得到了大力推广， 其推广面积已超过100万亩。 随着人民 生活水平的提高以及食品安全意识的增加， 食用油消费呈现出高端化的趋势， 牡丹资源作 为 -亚麻酸供给的食用油， 未来将会具有非常好的市场前景， 提高油用牡丹 凤丹 种子中 -亚麻酸的含量对于提升牡丹籽油品质以及油用牡丹产业发展具有重要的作用。 目前， 在 其他油料作物上有通过转基因方法提升 -亚麻酸含量的相关研究， 但转基因安全在世界范 围内仍存在较大争议。 发明内容 0004 为了弥补以上领域的不足， 本发明。

10、提供了一种提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸 含量的方法。 本发明所采用的技术方案如下： 0005 提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 包括如下步骤： 0006 (1)花粉采集： 在大蕾期采集作为父本的不同牡丹品种的花药， 将所述花药干燥至 开裂散粉， 收集花粉， 作为杂交父本； 0007 (2)授粉： 在牡丹品种 凤丹 的花瓣展开之前将其雄蕊去除， 套袋， 待柱头分泌粘 液时， 将所述步骤(1)中筛选的作为杂交父本的花粉授于 凤丹 柱头上， 套袋， 完成授粉； 说 明 书 1/5 页 3 CN 108157167 A 3 0008 (3)种子采集： 采集所述步骤(2)中授粉后的 。

11、凤丹 的果实， 统计结实率， 筛选结实 率25.0粒/朵的组合并收集其授粉后得到的种子， 测定所述种子的 -亚麻酸含量； 0009 (4)优质组合筛选： 以所述步骤(3)中 -亚麻酸含量为指标， 筛选种子的 -亚麻酸 含量160mg/g的牡丹品种作为母本 凤丹 的最佳授粉品种； 0010 (5)授粉品种的应用： 将所述步骤(4)筛选得到的最佳授粉品种作为授粉树进行应 用， 对所述 凤丹 品种进行授粉， 采集授粉后得到的种子， 即得到 -亚麻酸含量提高的油用 种子。 0011 所述步骤(1)中所述采集的时间为开花前两天的早上8时10时。 0012 所述干燥为自然风干。 0013 所述步骤(2)的。

12、牡丹品种 凤丹 为生长发育正常、 枝条粗细一致的6年10年生的 凤丹 植株。 0014 所述步骤(2)中所述授粉的时间为晴天无风的上午8时10时。 0015 所述步骤(3)中所述种子采集的时间为授粉后90天105天。 0016 所述步骤(3)中的果实呈黄色， 种子变为茶褐色的时候摘下果实， 采收种子。 0017 所述步骤(3)的结实率结实数(粒)/授粉花朵数(朵)。 0018 本发明的优点和积极效果是： 0019 (1)采用本发明的方法可提高 凤丹 种子 -亚麻酸含量， 从而提高 凤丹 种子的 品质。 0020 (2)本发明采用授粉的方法提高种子中 -亚麻酸含量， 是安全的方法。 0021 (。

13、3)本发明品种授粉树的种植， 可解决 凤丹 种植观赏花色、 花型单一的现象， 提 高油用牡丹种植的观赏效果。 0022 (4)本发明授粉父本所用品种为观赏牡丹生产中常见的栽培品种， 而且对于环境 的要求和栽培管理措施与 凤丹 一致， 应用非常方便。 0023 (5)本发明在 凤丹 的栽培生产中， 可按常规授粉树配置方法进行配置， 便于种植 者掌握， 易于推广。 具体实施方式 0024 实施例1、 提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法 0025 材料： 本实施例所用牡丹品种有：凤丹 、黑海洒金 、锦红 、红河 、荷花翡 翠 、如花似玉 、天香锦 、向阳红 、玉洁 ， 本实施例所用牡丹品种。

14、均购自山东省菏泽 市曹州百花园。 0026 本实施例的提高油用牡丹 凤丹 种子 -亚麻酸含量的方法， 具体包括如下步骤： 0027 1.花粉采集： 于大蕾期(开花前2天)的早上810时分别采集牡丹品种 黑海洒 金 、锦红 、红河 、 荷花翡翠 、如花似玉 、天香锦 、向阳红 、玉洁 的花蕾， 在室内 去除萼片、 花瓣， 于室温下自然风干至花药开裂散粉， 收集花粉， 作为杂交父本。 0028 2.授粉： 选择生长发育正常、 枝条粗细基本一致的610年生的 凤丹 植株80株， 每个植株上选择发育基本一致的花朵8朵， 在花瓣展开之前用镊子将雄蕊去除， 用硫酸纸袋 套袋， 23天后的晴天无风的上午81。

15、0时， 柱头分泌粘液时， 将步骤1中收集的父本的花粉 分别授于 凤丹 柱头上， 每个父本对应10个 凤丹 植株(即设10个重复)， 套袋， 在袋上标注 说 明 书 2/5 页 4 CN 108157167 A 4 亲本名称和授粉日期。 第二天再进行一次授粉。 0029 3.种子采集： 授粉后90105天， 待步骤2中授粉后的 凤丹 果实呈黄色， 种子变为 茶褐色的时候摘下果实， 采收种子， 统计结实率， 结实率结实数(粒)/授粉花朵数(朵)， 统 计授粉后的结实率的平均值作为每个父本对应的结实率。 结果如表1所示。 0030 表1不同授粉品种结实率统计 0031 0032 结果表明： 授粉父本。

16、品种不同时， 结实率不同， 其中 玉洁 作为父本时， 结实率最 高，荷花翡翠 作为为父本时， 结实率最低， 筛选结实率25.0粒/朵的组合， 即：黑海洒 金 、如花似玉 、向阳红 、玉洁 、天香锦 作为父本、凤丹 作为母本的5个组合。 将这5 个组合的果实室温下自然风干至心皮开裂种子散出， 收集种子室温干燥至恒重， 用于不饱 和脂肪酸不同组分含量测定。 0033 4.不饱和脂肪酸不同组分含量测定： 利用气相色谱-质谱(gas chromatography- mass spectrometry， GC-MS)对步骤3中筛选出来的5个组合的种子进行不饱和脂肪酸不同 组分含量测定， 包括测定棕榈酸、。

17、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸和 -亚麻酸和不饱和脂肪酸含量。 测 定方法如下： 0034 总脂的提取： 0035 1)将干燥的种子去壳后在液氮中迅速研磨成粉末， 称取约0.1g移至10mL具塞玻璃 试管中， 各3个重复。 0036 2)立即向试管中加入3.0mL氯仿： 甲醇(1： 2， v:v)的混合溶液， 充满氮气后振荡混 匀， 置于4过夜。 0037 3)向试管中补加1.0mL氯仿， 充分震荡混匀。 再加入1.8mL的1M KCl溶液， 使最终提 取液中氯仿： 甲醇： KCl的体积比为1： 1： 0.9。 0038 4)再次振荡混匀后， 2500rpm离心10min。 吸取下层氯仿相1.0m。

18、L。 用氮气浓缩， 进行 甲酯化。 0039 油脂的甲酯化： 0040 1)试管中加入1.0mL硫酸甲醇溶液(5硫酸+95甲醇)， 充满氮气后密封。 90水 浴1h。 0041 2)置于室温下冷却后， 在试管中加入1.5mL正戊烷和1.0mL水， 振荡混匀， 终止甲基 化反应。 0042 3)振荡后2500rpm， 离心10min， 收集上清液1.0mL， 氮气浓缩后加入5.0mL重蒸的正 说 明 书 3/5 页 5 CN 108157167 A 5 己烷。 0043 4)取980 L提取液样品， 加入20 L内标(十七烷酸)迅速混匀， 用0.22um有机相微孔 滤器过滤到样品瓶中， 用于GC。

19、-MS分析。 0044 标准品的制备： 0045 标准品包括牡丹种子油中5个主要成分棕榈酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸和 -亚麻酸 (均购自美国Sigma-Aldrich公司(Shanghai， China)， 以牡丹种子油中不存在的十七烷酸 (购自美国Sigma-Aldrich公司(Shanghai， China)作为内标。 将标准品配成一系列不同浓 度的标准溶液， 浓度梯度包括0.015625mg/mL， 0.03125mg/mL、 0.0625mg/mL L、 0.125mg/mL、 0.25mg/mL、 0.5mg/mL和1.0mg/mL， 取980 L不同浓度的该标准溶液， 分别加入。

20、20 L内标物， 密封在样品瓶中， -20储存备用。 0046 脂肪酸甲酯的GC-MS分析： 0047 测试标准品与分析样品所用的分析系统为Agilent GC-MS， 色谱柱为HP-88聚硅氧 烷聚合物色谱柱， 30m0.25mm， 0.20 m， (Agilent， 美国)。 所用的升温程序如下： 100保持 2min， 然后以15/min升至230， 保持5min， 进样口温度250， 分流进样， 分流比为10:1， 进样体积1 L， 载气为高纯氦气， 流速1.0mL/min； 电离方式为EI， 电子能量70eV， 传输线温度 280， 离子源温度230， 四级杆温度150， 质量扫描范。

21、围(m/z)： 30450u， 采用 NIST05Library标准谱库检索和与标准品比对定性。 0048 脂肪酸的定量分析： 0049 利用内标标准曲线法进行线性回归定量。 首先分别测试加入内标的一系列标准 品， 以标准品浓度为横坐标(x)， 相对应的标准品与内标物峰面积比为纵坐标(y)， 进行线性 回归， 制作标准曲线。 然后在相同的色谱条件下测出待测样品和内标物的峰面积之比， 由此 比值可在标准曲线上查出样品中待测组分的浓度， 进而可以计算出待测组分在样品中的含 量。 0050 结果： 0051 不饱和脂肪酸不同组分含量测定如表2所示， 授粉父本品种不同时， 种子不饱和脂 肪酸不同组分含。

22、量存在差异， 不饱和脂肪酸含量在212.32290.02mg/g之间， -亚麻酸含 量在119.80165.85mg/g之间， 亚油酸含量在32.8851.39mg/g之间， 油酸含量在45.03 56.55mg/g之间， 硬脂酸含量在3.195.33mg/g之间， 棕榈酸含量在11.3115.37mg/g之间 (表2)。 其中，玉洁 作为父本时， 种子中不饱和脂肪酸和 -亚麻酸含量最高。天香锦 中亚 油酸含量最高，向阳红 中油酸、 硬脂酸、 棕榈酸含量均最高。 0052 表2不同父本品种授粉的种子 -亚麻酸及其他组分含量(mg/g DW) 0053 说 明 书 4/5 页 6 CN 1081。

23、57167 A 6 0054 5.优质组合筛选： 以步骤4中 -亚麻酸含量为指标， 筛选 -亚麻酸含量160mg/g 的牡丹品种作为最佳授粉品种， 即：向阳红 和 玉洁 。 0055 6.授粉树应用： 将步骤5中筛选出的品种 向阳红 和 玉洁 作为授粉树进行应用， 父本的花粉分别授于 凤丹 柱头上， 授粉方法同上述步骤2， 得到 -亚麻酸含量提高的油用 种子。 0056 以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明， 但本发明创造并不限于所述实施 例， 熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替 换， 这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108157167 A 7 。