鲈鱼冷冻精子诱导半滑舌鳎卵减数雌核发育方法
技术领域
本技术属于海洋生物技术领域，是一种培育全雌性的、生长快速的半滑舌 鳎新养殖品种的育种技术，可直接应用于海水鱼类养殖行业。
背景技术
半滑舌鳎是分布在我国黄渤海的特有经济鱼类，经过近年来的人工驯化养 殖，被开发为海水工厂化养殖的名贵鱼类，经济价值高，但是该鱼雌性和雄性 生长差异大，2龄雌性体重较雄性重4倍以上，繁殖鱼苗中有50％左右的雄性鱼 类生长缓慢，难于达到商品鱼规格，使养殖生产成本提高，鱼苗的大面积养殖 推广受到限制；因此研发生长快的半滑舌鳎全雌鱼苗，对于提高养殖经济效益 和扩大养殖规模具有重要的现实意义。雌核发育是单性生殖的一种，指卵子依 靠自己细胞核内遗传物质发育成个体的生殖行为。雌核发育现象发现于天然鱼 类阿马逊花鳉(Poecilia formosa)，分布于我国的方正银鲫、彭泽鲫等也属于天然 雌核发鱼类，国内对银鲫天然雌核发育机理进行了大量的研究(中国科学院水生 生物研究所，桂建芬等，1996)，在鲤鱼上最早建立了雌核发育技术(中国科学院 水生生物研究所，吴清江，1981)。Harald利用欧鲽(Hippoglossoides platessoides)， 美洲黄盖鲽(Pleuronectes ferrugineus)和美洲拟鲽(P.americanus)精子诱导大西 洋大比目鱼(Hippoglossus hippoglossus L.)卵雌核发育(德国New Brunswick大 学，Harald B Tvedt，2003)。Luckenbach等利用同源和异源精子诱导漠斑牙鲆 (Paralichthys lethostigma)雌核发育(北卡罗莱拉州立大学，Luckenbach et al.， 2004)，Piferrer等对大菱鲆雌核发育技术进行了研究(Institut de Ciències del Mar， Consejo Superior de Investigaciones Cientificas，Piferrer et al.，2004)。但有关半滑 舌鳎雌核发育技术在国内外还未有相关报导。
发明内容：
本发明内容主要包括：鲈鱼精子冷冻保存，冷冻精子遗传物质的灭活，半滑 舌鳎未受精卵的采集及与灭活冷冻精子的受精，第二极体的抑制(包括冷休克起 始时间、持续时间、冷休克温度的选择)，雌核发育胚胎的培育几个方面。
本发明要解决的技术问题：本发明主要针对半滑舌鳎雄鱼生长速度慢的问 题，在养殖中2龄雌鱼体重可达600克以上，而雄性仅为150克左右，雌鱼能 够达到商品鱼规格，而雄鱼达不到商品鱼规格，但在鱼苗出售期(5-10cm)无法辨 别鱼苗的雌雄性，养殖户购买的鱼苗中有一半的雄性鱼苗养殖1年后无法出售， 导致养殖成本上升，鉴于这一原因，使半滑舌鳎鱼苗的销售量下降，养殖规模 难于进一步扩大。本发明技术可培育出半滑舌鳎超雌鱼，利用超雌鱼与正常养 殖的雄鱼交配可生产出全雌性的鱼苗，从而提高半滑舌鳎的生长速度，提高养 殖效益。
本发明解决以上技术问题所采用的技术方案：
(1)鲈鱼精子冷冻保存：
在鲈鱼性成熟期，选择发育至可产精液的雄性鲈鱼，用手挤压其腹部采集精 液，利用显微镜检查精子的活力，选择精子活力在80％以上的精液用于冷冻保 存。将精液与抗冻稀释液(MPRS+20％DMOS)以体积比1∶1的比例混合，分 装到2.0ml的冷冻保存管放入液氮中冷冻保存。
MPRS的各成分浓度为：NaCl 60.35mM，NaH2PO4 1.8mM；NaHCO3 3mM， KCl 5.23mM，CaCl2.2H2O 1.13mM，MgCl2.6H2O 1.13mM，D-Glucose 55.55mM。 DMSO为市售二甲基亚砜。
(2)鲈鱼冷冻精子遗传物质的灭活：
将冷冻精子管从液氮中取出，先在液氮蒸气中平衡1min，后置于37℃的水 浴中摇动，使精液解冻。镜检冻后精子活力，精子活力达到70％以上可进行紫 外线灭活处理。吸取100μL冷冻复活的鲈鱼精液置于在6℃预冷过的直径为10cm 的培养皿中，加入900μL的MPRS稀释，摇匀平辅在培养皿底部，将培养皿置 于紫外交联仪(UVC500)中，利用1000μj/cm2紫外线照射0.2min，使精子的活 力保持在40％。
(3)半滑舌鳎未受精卵的采集及与灭活精子的受精：
选择性成熟的半滑舌鳎雌鱼，在产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵 采入干燥的烧杯中，置于20-23℃室温下。将以上经过灭活的鲈鱼精液加入半滑 舌鳎卵，轻轻摇动混匀，加入2倍于卵量的海水受精，海水温度为20-23℃，精 液和卵的受精最小体积比为100μL∶4ml，受精过程在250ml烧杯中进行。
(4)第二极体的抑制：
以上受精卵在受精后5min，将盛有卵的烧杯浸入2℃的水浴中进行冷休克， 休克时间20min，20min后将卵杯移入20-23℃水浴中复温。
(5)雌核发育诱导卵的培养：
将以上经过冷休克和复温后的半滑舌鳎卵加入20-23℃的海水冲洗，沉淀过 滤，除去沉淀的死亡卵，将上浮卵加入20-23℃的海水中孵化培养。
本发明技术方案所依据的科学原理：雌核发育是孤雌生殖的一种，是卵子依 靠自己细胞核内遗传物质发育成完整个体的生殖行为。同种或异种精子进入卵 内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代的遗传 物质完全来自雌核，因此雌核发育产生的后裔全部为雌性，只具有母本的性状。
本发明技术方案的技术特点：第一，在半滑舌鳎雌核发育诱导中利用了冷冻 保存的异源的鲈鱼精子，这样极大的提高了雌核发育技术的灵活性，克服了不 同繁殖季节、不同繁殖时间和地点的限制，实现了远缘鱼类之间的育种。而报 导有关技术只能利用同一时间和地点繁殖的同源或异源的新鲜精子。第二，鲈 鱼和半滑舌鳎的亲缘关系相当远，属于不同的目；在染色体数目上差别相当大， 鲈鱼为2n＝48，半滑舌鳎为2n＝42，其杂交胚胎不能发育，因此保证了半滑舌鳎 雌核发育的可靠性。第三，半滑舌鳎为ZW/ZZ性别决定型，可以通过雌核发育 直接制作WW性别决定型的超雌鱼，培育成熟的超雌鱼可直接与自然生长的半 滑舌鳎雄鱼交配产出全雌性的后代。而目前资料所报导的雌核发育鱼多为 XX/XY性别决定型，雌核发育后代的性别为XX型，必须再经过雄性激素诱导， 检出发生性转化的雄鱼(生理上为雄性遗传上为雌性)与自然生长的雌性交配 才能产生全雌性的后代，技术难度大。第四，目前已报导的可进行雌核发育的 漠斑牙鲆、大菱鲆、牙鲆雌雄性鱼的生长差别为10％-30％，而半滑舌鳎雌性与 雄性的生长差别达到了75％，可见半滑舌鳎雌核发育技术的经济意义远远超过 目前所报导的其它鱼类。
具体实施方式
1.半滑舌鳎鱼卵和鲈鱼精子
利用海阳市黄海水产有限公司人工培育的半滑舌鳎亲鱼20尾，雌鱼体重1 -2kg/尾，雄鱼体重150-300g/尾，雌雄比例1∶2，经过生殖调控达到性成熟 并开始自然产卵，人工挤压腹部获得半滑舌鳎未受精卵。2002年11月和2003 年11月利用MPRS+20％DMSO冷冻保存鲈鱼精子，保存期限为3-4年，利用 37℃水浴解冻后在显微镜下检查，精子活力保持在80-90％。
2.紫外线照射冷冻/解冻的鲈鱼精子
吸取以上鲈鱼精子100μL置于预冷的直径为10cm的培养皿中，加入900μL 的MPRS稀释，摇匀平辅在培养皿底部，利用1000μj/cm2紫外经线分别照射0.1 -0.9min，每0.1min为1个梯度，照射后在镜下检查其活力，如表1。从表中可 以看出，经紫外线照射0.3min后精子活力会大幅度降低，因此选择照射时间 0.2min，精子活力保持在41.67±2.89％较适宜。
表1冷冻/解冻鲈鱼精子经紫外线照射后活力(％)(n＝3)
紫外线照射时间(min) 精子活力(M±SD) 对照(不经紫外线照射) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 93.00±2.65 43.33±5.77 41.67±2.89 40.00±10.00 23.33±5.77 13.33±2.89 7.00±1.73 4.00±1.73 1.00±0 0
3.减数分裂雌核发育冷休克起始时间筛选
每一次实验吸取100μL冷冻精子置于经6℃预冷的培养皿中，加入900μL 的MPRS稀释，平辅底部，利用强度为1000μj/cm2紫外线照射0.2min，取半滑 舌鳎卵4mL于烧杯中，加入照射后的精子充分混合，再加入4mL温度为23℃ 海水，轻轻摇动受精。分别在受精后2、3、4、5、6、7min将盛卵的烧杯放入2 ℃水浴中进行冷休克20min，之后将卵杯放入23℃海水中复温，利用相同温度 的海水冲洗受精卵，最后将卵放入23℃海水中培养。取相同剂量的不经紫外线 照射的精子与舌鳎卵受精，在相同条件下培养做为对照组。胚胎发育到囊胚期 或原肠前期统计发育率，尾芽期和孵化后统计胚胎成活率和孵化率。结果如表2。
受精后5min休克胚胎发育至原肠期的发育率最高，为24.43±4.69％，发育 至尾芽期成活率和孵化率也较其它时间高，分别为1.69±2.10％和1.64±2.17％， 因此选择受精后5min进行休克较合适。未经紫外线照射鲈精子与舌鳎卵的杂交 受精率和发育至尾芽期成活率较紫外线照射精子的受精率明显高，但胚胎发育 不能形成正常肌节，发育37h虽然有12.01±6.66％的胚胎上浮，但不能形成视 泡、肌节，胚体周围组织散乱，头部和尾部膨大成团块状，不能成活。
表2受精后不同时间休克雌核发育胚胎的发育率和孵化率(％)(n＝3-6)
受精后时间(min) 原肠期胚胎发育率(％) 尾芽期胚胎成活率 (％) 孵化率(％) 不经紫外线照射 36.98±30.12 12.01±6.66 0 2 12.86±2.04 0.19±0 0.19±0 3 19.60±18.73 0.64±0.18 0.46±0.09 4 22.56±10.76 0.33±0.16 0.44±0 5 24.43±4.69 1.69±2.10 1.64±2.17 6 23.65±6.98 0 0 7 18.06±7.03 0.14±0 0 8 7.95±3.61 0 0
4.减数分裂雌核发育冷休克持续时间的筛选
每一次实验利用紫外线照射后的鲈鱼冷冻精子100μL与4ml舌鳎卵受精， 精子的处理方法与实验3相同，在受精后5min将卵杯置于2℃水浴中分别休克 15、20、25、30、35min，利用与实验3相同的方法培养受精卵。取1组受精卵 在受精后不经过冷休克，直接在23℃海水中培养做为对照组。胚胎发育到囊胚 期统计发育率，肌节期和孵化后分别统计胚胎成活率和孵化率，结果如表3。
表3休克不同时间半滑舌鳎胚胎的发育率和孵化率(％)(n＝3-9)
休克时间(min) 原肠期发育率(％) 肌节期发育率(％) 孵化率(％) 0(对照) 75.24667±6.79 0 0 1 5 24.99±0.60 0 0 20 22.01889±5.57 1.37±1.58 1.236667±1.68 25 30.36±6.26 0.08±0 0 30 31.31333±2.16 0 0 35 41.3928.63 0 0
从表3可以看出，胚胎在这一时间段内冷休克卵发育至原肠早期的发育率 没有明显的差异；但是休克20、25min实验组胚胎可发育至肌节形成期，休克 20min实验组胚胎可孵化出正常鱼苗。不经休克的舌鳎卵发育至原肠早期的发育 率可达75.24±6.79％，与其它实验组有显著性差异(p＜0.05)，但不休克组发育 至原肠后期不能形成完整的胚体，无肌节、视泡和神经管等组织。因此选择休 克20min可以获得孵化鱼苗。
5.减数分裂雌核发育休克温度的筛选
利用紫外线照射的鲈鱼冷冻精子与舌鳎卵受精，每个实验的精子和卵量及 精子处理方法与实验3相同，在受精后5min分别将卵置于-1.0、0.8、2、3、4、 5、6、7℃的水浴中冷休克20min，其中1组卵受精后不休克做为对照，然后进 行复温和培养，培养方法与实验3相同。分别在胚胎发育到囊胚期统计胚胎发 育率，尾芽期和孵化后统计胚胎成活率和孵化率。结果如表4。
从表4可以看出，在2-6℃冷休克胚胎发育至原肠早期的发育率在49.42± 9.47％-57.34±10.36％，原肠发育率无显著性差异(p＞0.05)；在2-6℃休克胚胎有 部分可继续发育至尾芽期并能孵化出正常的鱼苗，尾芽期胚胎的发育率在0.13 ±0.13％-2.87±3.23％，孵化率在0.07±0.05％-1.57±2.04％，实验中2℃休克尾 芽胚发育率和孵化率较其它温度组高。不休克胚胎的原肠发育率达75.24± 12.72％(p＜0.05)，但胚胎在原肠中期后不能继续发育。因此选择2℃水浴进行胚 胎的休克。
表4不同休克温度下半滑舌鳎胚胎雌核发育率和孵化率(％)(n＝3)
休克温度(℃) 原肠发育率(％) 尾芽期发育率(％) 孵化率(％) 不休克 75.25±6.79 0 0 -1.0 2.0±0.1 0 0 0.8 30.65±6.01 0 0 2 51.42±8.53 2.87±3.23 1.57±2.04 3 49.42±9.47 1.67±0 1.16±0 4 55.34±11.20 0.73±0.89 0.36±0.38 5 40.68±21.87 0.67±3.22 0.98±0.50 6 66.81±7.27 0.13±0.13 0.07±0.05
依据以上实验将鲈鱼冷冻精子诱导半滑舌鳎雌核发育的技术指标确定为： 100μL鲈鱼冷冻精子利用MPRS稀释10倍后，利用1000μj/cm2紫外线照射0.2min 灭活，与4ml半滑舌鳎卵受精，受精卵在5min后利用2℃的水浴冷休克20min， 然后将胚胎置于23℃海水中培育，可培育出雌核发育的半滑舌鳎鱼苗。