本发明涉及新的具有偶氮取代基的二环或三环化合物及其作为杀真菌剂和/或杀菌剂和/或杀线虫剂的应用，涉及含有所述化合物的杀真菌和/或杀菌和/或杀线虫组合物，还涉及所述化合物的制备方法。
对马勃菌酸[4-（氰基-N，N，O-氧化偶氮）苯甲酸]及其有限数量的相似化合物的抗菌和抗真菌性能已经进行了研究。在Trans.Mycol.Soc.Japan，23，P.225-234，1984中叙述了马勃菌酸及其甲酯具有抗菌和抗真菌活性。在Eur.J.Med.Chem-Chimica Therapeutica，Jan-Feb.1977-12No.1，p.59-62中进一步描述了其它类似化合物的制备和筛选。制备和试验的化合物通式如下：
2-Cl;3-Cl;4-Cl
2-Br;3-Br;4-Br;
2-NO2;3-NO2;4-NO2;
2-OCH3;3-OCH3;4-OCH3;
H;
p-N（CH3）2
4-羧基苯基氧化偶氮氰化物-二甲亚砜的抗菌和抗真菌性能述于Acta Crystallogr.，Sect.B，1975，B31（8）p.2151-3。
其它一些化合物的抗菌性能述于日本专利申请（公开）J52071444（Takara Shuao公司）。据化学文摘No.87：167770，所述化合物是上式的化合物，其中X是2-CH3，3-CH3，3-COOH，3-Cl，3，4-Cl，和2，5-CH3，Cl。
在Journal of Antibiotics6/1986，p.864-8中，描述了2-（氰基-N，N，O-氧化偶氮）苯甲酸的制备以及杀菌和杀真菌筛选，但据说对所试验的真菌未显示出相关活性，对细菌显示低的活性。
美国专利4558040和4550121描述了（2-烷基-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-8-基）二氮烯羧酸酯和（2-取代-2，3-二氢苯并呋喃-7-基）-二氮烯羧酸酯的杀螨活性。
本发明是基于发现某些化合物（其中多数是新的）抗真菌（包括植物病原真菌）、细菌和酵母菌以及线虫的有效性。
本发明的一个方面提供一种现场抗真菌和/或细菌和/或酵母菌和/或线虫的方法，该方法包括用下面通式的化合物对现场进行处理：
式中R2和R3一起或R3和R4一起表示任意取代的烃基氧链;该环任意取代在任何或每个剩余位置R5、R6和R2或R4上;n表示0或1;X表示氰基，-COOH或其盐、酯或酰胺衍生物。
本文使用的术语“烃基氧链”表示链中被一个或多个（最好是一个）氧原子间断的碳原子链。氧原子宜在链的一端。
烃基氧链适宜的任意取代基是任意取代的烷基，较好的是被一个或多个（最好一个）卤原子或羟基或烷氧基任意取代的烷基;任意取代的苯基;亚烷基，较好的是接在烃基氧链两个相邻碳原子上的-（CH2）4-;或＝0。
除本文另有说明，烷基可以是直链的或支链的，宜含有最多10个碳原子，较好的是含有最多6个碳原子，最好含有1～4个碳原子，优选的实例是甲基和乙基。
除本文另有说明，当任一基团被指定为任意取代时，任意存在的取代基可以是任何在杀生物化合物研究中和/或对这些化合物进行修饰以影响其结构/活性、持久性、渗透性和其它性能识常规采用的那些取代基。对于烷基或亚烷基或烃基氧链，取代基的具体实例包括卤素，特别是氟、氯或溴原子，以及苯基，氰基，酰胺基， 一或二（C1-4烷基）酰胺基和C1-4卤代烷基，以及通式为MR7和CO.GR7的基团，式中M表示氧或硫原子或亚磺酰基或磺酰基，G表示氧或硫原子，R7表示氢原子、C1-8特别是C1-4烷基、C1-4卤代烷基或苯基。对于苯基，任意取代基包括卤原子，例如氟、氯、溴或碘原子，以及硝基、氰基、酰胺基、一或二（C1-4）-烷基酰胺基，C1-4烷基，C2-4链烯基，C2-4炔基和C1-4卤代烷基（特别是CF3），以及如上所述的通式为MR7或CO.GR7的基团。
因此，较好的是R2和R3一起，或R3和R4一起表示一个被一个或多个基团任意取代的烃基氧链，取代基独立地选自卤原子，任意取代的烷基或苯基，或氰基，氨基，一或二-（C1-4烷基）氨基或C1-4卤代烷基，或＝O;或接在相邻碳原子上的任意取代的亚烷基;以及通式为MR7和CO.GR7的基团，式中M表示氧或硫原子或亚磺酰基或磺酰基，G表示氧或硫原子，R7表示氢原子，C1-4烷基，C1-4卤代烷基或苯基;R5、R6和R2或R4分别表示氢或卤原子，或硝基，氰基，氨基，一或二-（C1-4）烷基氨基，C1-4烷基，C2-4链烯基，C2-4炔基和C1-4卤代烷基，或如上所述通式为MR7或CO.GR7的基团。
优选的是，烃基氧链是未取代的或被C1-2烷基、卤代烷基、羟烷基或烷氧烷基取代，或被连接在两个相邻碳原子上的亚烷基-（CH2）4-取代，或被＝O取代。
烃基氧链宜具有3或4个链原子。较好的烃基氧链的代表是氧化烯和氧化亚烷链。这里使用的术语“氧化亚烷”是指链中pi电子 形成共振电子体系的一部分。当该链是氧化亚烷时，链与苯环一起形成稠杂环体系。
优选的氧化烯和氧化亚烷链基于下述结构（侧原子/基团未示出）：
-O-C-C-
-O-C＝C- （比较二氢苯并[b]呋喃）
-O-C-C-C-
-O-C-C＝C- （比较苯并[b]呋喃）
特别优选的氧化烯或氧化亚烷链是：
-O- -CH＝CH-
-O-C（CH3）＝CH-
-O-C（CH3）2-CH2-
-O-CH2-CH＝CH-
任意取代基R5、R6和R2或R4宜选自卤原子和烷基和烷氧条件，特别是氯、甲基和甲氧羰基。更为优选的是，R5、R6和R2或R4位全部为未取代，或其中只有一位被取代。
n优选为1。
优选的X表示氰基，COOH或-COOZ，其中Z表示C1-4烷基，链烯基或炔基，例如甲基、乙基、烯丙基或炔丙基。更为优选的是，X表示甲氧羰基或特别是氰基。
在本发明上述的方法中，所处理的现场可以是农业现场或园林现场，例如受害的植物，该植物的种籽或该植物生长或待生长的介 质，或无生命的有机现场，例如原油，油衍生的液体燃料，或润滑剂，或油漆，洗涤剂或纺织品。对于农业和园林现场，本发明的化合物对一系列重要的真菌显示出活性，包括葡萄霜霉，葡萄灰霉菌，小麦叶斑，大麦粉霉，西红柿早期疫病，小麦眼点、小麦籽苗疫病和小麦褐锈病，并且对禾本科寄生根结线虫显示活性。上述现场可用化合物Ⅰ进行适宜处理，施用量为0.05～4kg/公顷，优选0.1～1kg/公顷。对于非农业化学现场，本发明的化合物对某些丝状真菌，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（包括需盐脱硫孤菌）以及酿酒酵母呈活性。
本发明还提供了通式Ⅰ的化合物（如上定义）作为杀菌剂和/或杀菌剂和/或杀酵母剂和/或杀线虫剂的应用。
如上所述，式Ⅰ中X表示氰基的化合物是优选的，这种化合物具有特别令人感兴趣的活性。此外，这种化合物和其它一些化合物是新颖的。因此本发明又一方面提供了式Ⅰ所示的化合物（如上定义，但X不表示烷氧羰基）。
在优选的新一类化合物中，X表示氰基。
本发明还提供了含有载体和作为活性组分的式Ⅰ新化合物（如上定义）的杀生物组合物。
本发明组合物的载体可以是任何能将活性组分配制得易于在待处理的现场上使用或易于储存、运输或处置的材料。载体可以是固体或液体，包括常态为气态但被压缩为液体的材料。在配制杀生物组合物通常采用的载体都可以使用。本发明的组合物宜含有0.5～95%（重量）活性组分。
适宜的固体载体包括天然和合成粘土和硅酸盐类，例如天然硅石（如硅藻土）;硅酸镁（如滑石）;硅酸镁铝（如绿坡缕石和蛭石）;硅酸铝（如高岭石，蒙脱石和云母）;碳酸钙;硫酸钙;硫酸铵;水合氧化硅以及合成硅酸钙或硅酸铝;元素，例如碳和硫;天然和合成树脂，例如苯并呋喃树脂，聚氯乙烯和苯乙烯聚合物和共聚物;固体聚氯酚;沥青;蜡;以及固体肥料，例如过磷酸钙。
适宜的液体载体包括水;醇，例如异丙醇和甘醇;酮，例如丙酮、甲乙酮，甲基异丁基酮和环己酮;醚;芳族或芳脂族烃，例如苯，甲苯和二甲苯;石油馏分，例如煤油和轻质矿物油;氯化烃，例如四氯化碳，全氯乙烯和三氯乙烷。不同液体的混合物通常也是适宜的。
组合物通常以浓缩的形式配制和运输，然后由使用者在施用前稀释。存在少量表面活性剂可促进载体稀释过程。因此，本发明组合物中宜至少有一种载体为表面活性剂。例如，该组合物可至少含有两种载体，其中至少一种为表面活性剂。
表面活性剂可以是乳化剂，分散剂或润湿剂，可以是非离子型的或离子型的。适宜的表面活性剂的实例包括聚丙烯酸和木素磺酸的钠盐或钙盐;含有至少12个碳原子的脂肪酸或脂族胺或酰胺与环氧乙烷和/或环氧丙烷的缩合产物;甘油，山梨醇，蔗糖或季戊四醇的脂肪酸酯，或与环氧乙烷和/或环氧丙烷的缩合产物;脂肪醇或烷基酚例如对辛基酚或对辛基甲酚与环氧乙烷和或环氧丙烷的缩合产物;这些缩合产物的硫酸酯或磺酸酯;硫酸或含有至少10个碳原子的磺酸的碱金属或碱土金属盐，较好的是钠盐，例如十二烷基 硫酸钠，伯烷基硫酸钠，磺化蓖麻油的钠盐，和烷芳基磺酸钠如十二烷基苯磺酸钠;以及环氧乙烷的聚合物和环氧乙烷与环氧丙烷的共聚物。
可将本发明的组合物配制成例如可湿性粉末，粉末，颗粒，溶液，乳化浓缩物，乳液，悬浮浓缩物和气溶胶。可湿性粉末通常含有25，50或75%（重量）活性组分，除固体惰性载体外，还通常含有3～10%（重量）分散剂以及必要时0～10%（重量）稳定剂和/或其它添加剂，例如渗透剂或粘着剂。粉末通常配制成粉末浓缩物，其组成与可湿性粉末相似但不加分散剂，在使用场地用另外的固体载体稀释为通常含有0.5～10%（重量）活性组分的组合物。通常将颗粒制成粒径10～100BS网目（1.676～0.152mm），可用附聚或浸渍法生产。通常，颗粒含有0.5～75%（重量）活性组分和0～10%添加剂，例如稳定剂、表面活性剂，缓释调节剂和粘合剂。所谓的“干流动性粉末”由含有较高浓度活性组分的相对较小的颗粒组成。乳化浓缩物除含有溶剂外，必要时通常还含有共溶剂，10～50%（重量/体积）活性组分，2～20%（重量/体积）乳化剂和0～20%（重量/体积）其它添加剂，如稳定剂，渗透剂和防腐剂。悬浮浓缩物通常要复合，以得到稳定的不沉淀的流动产品，其通常含有10～75%（重量）活性组分，0.5～15%（重量）分散剂，0.1～10%（重量）悬浮剂如保护性胶体和触变剂，0～10%（重量）其它添加剂如脱泡剂，防腐剂，稳定剂，渗透剂和粘着剂，以及水或活性组分基本不溶的有机液体;某些有机固体或无机盐可溶解在制剂中以防止沉淀或作为水的防冻剂。
含水分散液和乳液，例如用水稀释本发明的可湿性粉末或浓缩物得到的组合物，也在本发明的范围之内。所述乳液可以是油-水型，也可以是水-油型，可以是稠“酱”状稠度。
本发明的组合物还可含有其它组分，例如其它具除草、杀虫或杀真菌性能的化合物。
本发明的又一方面提供了一种制备通式Ⅰ所示（如前定义）新化合物的方法，该方法包括使式Ⅱ的化合物
与氨基氰反应，形成式Ⅰ的化合物，式中n是1，X代表氰基;任意衍生该化合物，得到式Ⅰ所示其它新化合物。
反应宜在有机溶剂，较好的是卤化烃如氯仿存在下和在二乙酸碘代苯存在下进行。反应温度宜在-20℃～50℃。
式Ⅰ化合物的衍生可在强酸或强碱存在下，通过标准水解，将氰基转变成羧基，或在中间阶段中止反应，转变成酰胺基。
由于美国专利4558040和4550121的公开，酯类化合物不是新的，它们的制备可通过所得羧酸的标准酯化或通过氰基化合物酸的醇解，形成咪唑酯的酸盐，再与水在环境温度下反应完成，得到酯。此外，酯类也通过下述途径制备，在美国专利4558040和 4550121中对此有详述（Ar表示芳基）：
Ar-NO→Ar-NH→Ar-N＝NSO3Na→Ar-N＝N-SO3K
↓
Ar-N＝N-酯←Ar-NH-NH-酯←Ar-NH-NH
↓
Ar-N（O）＝N-酯
通过标准方法，可将后两种化合物转变成式Ⅰ其它化合物，例如酰胺，酸和腈。
式Ⅱ的化合物可以如下制备：
例如，反应A可以通过使硝基化合物在氢转移催化剂（如碳载铑）下在适宜的惰性极性有机溶剂（如四氢呋喃）中与肼水合物反应来完成，反应过程中最好伴随冷却;也可以使用水、氯化亚锡作还原剂，惰性极性有机溶剂（如四氢呋喃）在惰性气氛（如氮）在 乙酸钠存在下于环境温度下进行。
反应B可以通过用氧化剂，例如Fe3+化合物，宜为氯化铁处理羟基胺衍生物来完成。反应可在混合的水/极性有机溶剂中进行，最好伴随冷却。
反应C可以通过幅射最好是溶于惰性有机溶剂（如苯）中的硝基化合物完成。可以使用中压水银灯幅射。
初始的硝基物质是已知的，或可以用标准方法由已知化合物制备。通式Ⅲ和Ⅱ的羟基胺和亚硝基衍生物分别被认为是新颖的。这些化合物及其制备方法构成了本发明的又一方面。
式Ⅰ中n是0的新化合物可用美国专利291046和Med.Chem-Chim.Ther.，1982-17，No.5，p.482-4所述相似的方法制备，其中进行胺化合物的重氮化反应，所得重氮化了的化合物以下述方式氰尿化：
其中X-是由无机酸衍生的阴离子。还可以将所得化合物的标准条件下氧化，得到式Ⅰ中n为1的化合物。
对于反应D，采用标准的重氮化条件，例如低温（宜为0～20℃）将含水无机酸中存在亚硝酸钠。
对于反应E，氰尿化宜用碱金属氰化物（例如氰化钠）处理式Ⅳ的化合物来完成，反应条件宜为低温（例如-20°～+20℃），脱掉水层，加入卤化烃（如四氯化碳），加热有机层，温度宜为40～100℃，最好是在回流条件下。
步骤D和E以及通式Ⅳ的化合物被认为是新的，构成了本发明的又一方面。
适于制备通式Ⅰ化合物的其它方法以及对本文所述方法的进一步描述，参见The Journal of Antibiotics，Jan.1975，p.87-90和Jun.1986，p.864-868;Eur.J.Med.Chem.-Chim.Ther.，1982，17，No.5，p.482-484，和1980，15，No.5，p.475-478，和1977，12，No.1，p.59-62;J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1984，p.323-324;Chem.Ind.（Milan），1977，59（5），p.385;Gazetta Chimica Italiana，106，1976，p.1107-1110;Tetrahedron Letters，No.38，1974，p.3431-3432;和美国专利4558040和4550121。
下面用实例进一步描述本发明。
（a）在室温下于氮气中向6-硝基香豆素（47.25g，0.25mol）和四氢呋喃（1.875升）的搅拌溶液中加入水（150ml），然后加乙酸钠（205g，2.5mol），得到黄色悬浮液。观察到轻微放热，温度由20℃升到25℃。
一次加入固体氯化锡（282g，1.25mol），10分钟内温度升至32℃，自然维持该温度30分钟，然后逐渐冷却室温。反应混合物室温下搅拌过夜，过滤得到清澈的暗黄色羟基胺的四氢呋喃溶液。
（b）将上述溶液于0℃在1小时内滴加到氯化铁六水合物（125g，0.77mol）和水（1.875升）的搅拌溶液中，得到暗绿色悬浮液。将反应混合物在0℃再搅拌2小时45分钟。溶液用二氯甲烷提取（4×400ml），用于下一步骤。
（c）向含有亚硝基化合物的上述溶液中加入氨基氰（21g，0.5mol）。将悬浮液冷却至0℃，将二乙酸碘代苯（87.5g，0.27mol）的二氯甲烷（500ml）溶液在10分钟内滴加入，绿色溶液变为褐色。溶液经“HYFLO”（商标）过滤，用硫酸镁干燥，除去溶剂。产物用硅胶柱色谱层析提纯，用5%乙酸乙酯/甲苯洗脱。产率为50%（基于硝基香豆素）。
分析
C10H5N3O3计算% 55.8C 2.3H 19.5N
测定% 55.5C 2.4H 19.5N
用与本文前序部分所述和实例1相似的步骤制备了其它化合物。有关这些化合物的数据列于下面表Ⅰ中。表Ⅰ中指的是下面通式的化合物：
表1中，使用下述代码识别烃基氧基团-R2-R3-或-R3-R4-（下面所示左边的键与较低数码的R连接，即-R2-R3-中的R2和-R3-R4-中的R3），符号-表示未取代。
A：-O-C（CH3）2-CH2-
B：-O-CH（CH3）-CH（CH3）-
C：-O-CH（CH3）-CH2-
D：-O-CH（C2H5）-CH2-
E：-O-CH（CH2Cl）-CH2-
F：-O-CH（CH2OH）-CH2-
G：-O-CH（CH3）-CH2-CH2-
H：-O-C（CH3）2-CH2-CH2-
I：-O-C（CH3）＝CH-
K：-O-C（CH3）＝C（CH3）-
L：-O-C（C2H5）＝CH-
M：-O-C（nC4H9）＝CH-
N：-O-C（C6H5）＝CH-
O：-CH＝C（CH3）-O-
Q：-CH＝C（C6H5）-O-
R：-O-CH2-CH＝CH-
S：-O-C（CH3）2-CH＝CH-
T：-CH＝CH-CH2-O-
U：-O-CH（CH2OCH3）-CH2-
V：-O-CH（CH3）-CH＝CH-
实例B1
通过下面试验方法验证本发明化合物的杀真菌活性。
（a）抗葡萄霜霉病（plasmopara viticola;PVP）的直接保护活性
本试验采用叶面喷雾法，是一种直接保护类试验。使用可输送620升公顷的喷雾器，按1千克活性物质/公顷的剂量给整个葡萄（CV Cabernet Sauvignon）叶的下部表面喷洒含0.004%W“Triton X-155”（商标）（辛基苯酚聚氧乙烯表面活性剂），1∶1 v/v 水/丙酮的活性物质溶液，在正常玻璃温室中放置24小时后，通过给叶子下部表面喷洒含10+游动孢子/ml的水溶液来接种。接种了的植物在高湿度隔离间内放置24小时，然后在正常的玻璃温室中放置5天，再于高湿度下放置24小时。分析结果基于孢子覆盖的叶面积占对照叶上孢子的表面积的百分化。
（b）抗葡萄灰霉病（Botoytis cinerea;Bcp）的直接保护活性。
本实验是采用叶面喷洒法的一种直接保护类试验并如（a）所述进行，与（a）的不同之处在于该叶是通过喷洒含105分生孢子/ml的水溶液来接种的。
（c）抗小麦眼斑病（Pseadocercosporella herpotrichoides;Ph）的活性
该试验是一种体外试验。样品是如下制备的：将含2mg活性物 质的0.7ml丙酮溶液分散到20ml熔融态的50%浓度马玲薯葡萄糖琼脂上（该琼脂是如下形成的：1升水溶有2g马玲薯提取物，10g葡萄糖和7.5g琼脂，然后于121℃灭菌15分钟），将得到的20ml份额置于9cm皮特里盘中。所得样品中的活性物质浓度为100ppm。从置于100%浓度的马玲薯葡萄糖琼脂上在暗处于20～22℃培养3至4星期P-herpotrichoides的培养皿前沾取直径为5mm的两个栓，间隔均匀地放置在每个样品表面，菌丝体面向上。将该样品在分析前于暗处在20～22℃培养11天。测量直径的增长，栓的宽度减小，将结果与对照样品直径的增长比较，对照样品如下制备：将不含活性物质的0.7ml丙酮分散到20ml 50%浓度的马玲薯琼脂中。
（d）抗小麦赤霉病（Fusariam culmorum;Fs）的活性
本试验是采用土壤浸润法的一种抗孢子分生试验。将表面灭菌的小麦种子（Var Waggoner）于22℃通过浸在含7×105孢子/ml（60mg种子/80ml悬浮液）的悬浮液中接种6小时。然后将该种子以1cm深度播种在沙土罐（每罐5粒）中。播种并生长1天后，将活性物质以10kg/公顷的比例浇到浸润的土壤上（浓度为0.36g/l含活性物质的12%v/v丙酮/水）并均匀地盖过沙土。然后将该罐转移到玻璃温室中，在25℃保存并按时浇水。培养21天后，将得到的幼苗从罐中移出并小心地洗涤它们的根。与对照的幼苗比较，用肉眼检测茎基底和根上部病斑的发展。
（e）抗小麦叶斑病（Leptosphaeria nodorum;Ln）的活性
本试验采用叶面喷洒法，是一种抗孢子分生试验。将单叶期的小麦（cv Mardder）叶子通过喷洒含8×105孢子/ml的悬浮液来 接种。接种的小麦在处理前，于高湿度隔离间内存放24小时。采用（a）所述的喷雾器，按1kg活性物质/公顷的剂量给该小麦喷洒活性物质。干燥后，将该小麦在正常的玻璃温室中放置5天，随后进行检测。检测结果为孢子分生覆盖的叶面积占对照小麦孢子分生覆盖的叶面积百分比。
（f）抗大麦白粉病（Erysiphe graminis f.sp.hordei;Eg）的活性
本试验采用叶面喷洒法，是一种直接抗孢子分生试验。在用试验化合物处理前一天，通过向大麦幼苗（cv.Golden Promise）该叶子撤带有mildew conidia的粉使该叶接种。处理前，接种的大麦在处理前，于玻璃温室的温度和湿度环境中过夜存放，采用（a）所述的喷洒器，按1kg活性物质/公顷的剂量给该大麦喷洒活性物质。干燥后，将该大麦转到环境温度和湿度的隔离间中放置7天，随后进行检测。检测结果为孢子覆盖的施药叶面积占没施药的对照大麦上孢子覆盖的叶面积百分比。
（g）抗番茄早期疫病（Alternaria Solani;A）的活性
该试验是采用叶面喷洒法的一种直接防护试验。给早期番茄叶子的上部表面喷洒（a）中所述的活性物质溶液。在正常的玻璃温室中生长24小时后，通过给叶子上部表面喷洒含104孢子/ml的悬浮液给叶子接种孢子。接种的番茄在高湿度隔离间中保存72小时，然后移到低温度（相对湿度50～70%）隔离间中。接种后8天进行检测。
（h）抗苹果白粉病（Podosphaera leucotricha;Pl）的活性
该试验是采用叶面喷洒法的一种直接抗孢子分生试验。在用试验化合物处理前2天，给幼苗叶子的上部表面喷洒含105孢子/ml的悬浮液从而使叶子上部表面接种上孢子。在处理前，将该接种的番茄马上干燥并在玻璃温室的环境温度和湿度中存放。按1kg活性物质/公顷，剂量，采用（a）中所述的喷洒器给该番茄喷洒活性物质。干燥后，将该番茄转到环境温度和湿度的隔离间中存放9天，随后进行检测。检测结果为孢子覆盖的施药番茄叶面积占孢子覆盖的对照番茄叶面积的百分比。
（i）抗小麦叶锈病（Puceinia Recondita;Pr）活性
该试验是采用叶面喷洒法的一种直接防护试验。小麦幼苗（cv Brigand）生长到1～1.5叶期。使用（a）中所述喷洒器，按1kg试验化合物/公顷剂量给该小麦喷洒试验化合物。该试验化合物以与丙酮和水（50∶50v/v）混合且含0.04%表面活性剂（“TWEEN20”-商标）而形成的溶液或悬浮液使用。
处理18～24小时后，通过给整个植物喷洒含约105孢子/ml的悬浮液使幼苗接种上孢子。接种后将该植物在20～22℃，高湿度条件下保存18小时，然后将该植物保存在环境条件下的玻璃温室中，即中等相对湿度，温度为20℃。
以孢子分生脓疱覆盖的试验化合物处理的植物占孢子分生脓孢覆盖的对照植物的百分比为基础，接种后10天评估疾病程度。
（j）抗葡萄霜霉病（Plasmopara viticola;Pva）的抗孢子分生活性
本试验是采用叶面喷洒法的一种直接抗孢子分生方法。在用试 验化合物处理前2天，通过向葡萄（cv Cabernet sauvignon）叶的下部表面喷洒含104孢子/ml的悬浮液使其接种上孢子。接种的植物在高湿度隔离间内放置24小时，然后在环境温度和湿度的玻璃温室中放置24小时。当该植物干燥时，给受感染叶子的下部表面喷洒活性物质溶液，该溶液是由活性物质和含0.04%w/w“Triton X-155”（商标）（一种辛基苯酚聚乙氧化物表面活性剂）的1∶1水/丙酮组成。喷洒是用载量为620升/公顷的移动式喷洒器进行的，活性物质浓度为1kg/公顷。在喷洒后评估前，将该植物转到正常玻璃温室条件下放置96小时，然后转移到高湿度的隔离间中放置24小时，以诱使孢子形成。检测用肉眼观察，基于所形成孢子覆盖的施药叶面积占所形成孢子覆盖的对照叶面积的百分比。
（k）抗水稻白叶枯病（Pyricularia oryzaei Po）的活性
本试验是采用叶面喷洒法的一种直接根除试验。在用试验化合物处理前20～24小时，向水稻幼苗（每罐约30株幼苗）的叶子喷洒含105孢子/ml的悬浮液。接种的植物在高湿度下过夜放置，然后干燥，再按1kg活性物质/公顷的剂量，用（a）中所述的喷洒器给该植物喷洒活性物质。处理后，将该植物于25°～30℃及高湿度的水稻隔离间中放置。处理4-5天后进行检测并与对照植物比较坏死病斑的密度和枯萎的程度。
上面试验的结果见下面表2：
表2
实例
Pvp Bcp Ph Fs Ln Eg As Pr 其它
号
1 2 1 2 2 1 2 2
2 1 2 2 2
3 2 1 2 1 1 1
4 2 2 2 1 2
5 2 2 2 1 1 2 Pva 2
6 2 2 2 1 1 2
7 2 1 1 1 2
8 2 2 1 1
9 2 2 1 1 Pva 1
10 2 2 2 1 2
11 2 2 2 1
14 2
15 2 2
16 2 2 1 1 2 1
17 2 1 2 1 1 1
18 2 1 2 1 2 2
19 1 1 1 2 2
20 2 1 1
21 1
22 1 2 2 2
23 1 2 1 1 2 Pva 2
24 2 1 1 2 1
26 2 2 1 2 2 1 Pva 2
27 2 2
29 2 2 1 Pva 2
31 1 1 1 Pl 1
32 1
33 1 1 Pva 1
表2（续）
实例
Pvp Bcp Ph Fs Ln Eg As Pr 其它
号
35 1 1 Pva 1
36 1 2 2 Pl 2
37 1 1 1 Pl 1
38 2
39 1 1
40 1 Pl 2
41 1 1
42 2
43 1 2 2 Pl 1
44 1 2
45 1 2 1
46 2 2 2 2 2 Po 2
通过二次筛选，对一些化合物的杀真菌活性进一步进行了验证。这些试验表明一些化合物对一些真菌具有特别高的活性。实例1被发现对As和Pvt具有高活性（抗Plasmopara viticola，隔层（translaminar）防护试验检测，其中给葡萄叶的上部表面喷洒试验化合物的溶液，然后给下部叶子接种适量的孢子）;实例16具有抗Bcp和Pvt的活性;实例26和37具有抗Pvt的活性;实例38具有抗Pvp的活性;实例43具有抗Ph的活性。
实例B2
通过抗下面的微生物试验进一步证明式Ⅰ化合物抗微生物的活性。
革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌（Sa）
（NCIB6571）
枯草杆菌（Bs）
革兰氏阴性细菌：大肠杆菌（EC）
（NCIB9517）
需盐脱硫弧盐菌（Dsp）
酵母菌：酿酒酵母（SC）
（ATCC9763）
丝状真菌：黑曲霉（An）
（CMI17454）
树脂枝孢（Cr）
球毛壳（chg）
（NCIB＝工业菌国家保藏中心，Torry Research Station，P.O.Box31，135 Abbey Road，Aberdeen，Scotland，AB9 8DG）。
（ATCC＝美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，Margland 20852，USA）。
（CMI＝Commonuealth Mycological Institute，Ferry Lane，Kew，Surrey，England）。
上面微生物的接种如下制备。
将金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和大肠杆菌在50ml等分的胰蛋白栋大豆肉汤中培养，培养条件为：在250ml锥形烧瓶中，于30℃，在每分钟转数为200的旋转振摇器上培养24小时。胰蛋白栋大豆肉汤如下制备：将17g酪蛋白的胰水解液，3g大豆肉的木瓜酶水解液，5g氯化钠，2.5g磷酸氢二钾和2.5g葡萄糖加到1升蒸馏水中，混合，然后在高压灭菌器于121℃灭菌15分钟。将1ml等分的所得 培养物与99ml新鲜的胰蛋白栋大豆肉汤混合并作试验的接种。
将硫酸盐还原菌需盐脱硫弧菌在改进的Postgate′s培养基B中于30℃培养48小时并直接用作接种物。改进的Postgate′s培养基B如下组成：0.5g磷酸氢二钾，1g氯化铵，1g硫酸钠，5g乳酸钠，1g酵母菌，0.1ml巯基乙酸，0.1ml抗坏血酸，0.5g硫酸亚铁七水合物，750ml老化的海水和250ml蒸馏水，将PH调到7.8，分成等分，然后在高压灭菌器中于121℃灭菌15分钟。
酿酒酵母的接种按金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和大肠杆菌的同样处理方法制备，但用酵母菌麦芽肉汤代替胰蛋白栋大豆肉汤。酵母菌麦芽肉汤是如下制备的：将3g酵母菌提取物，3g麦芽提取物，5g胨和10g葡萄糖悬浮在1升蒸馏水中，然后再将其加热成溶液，在高压灭菌器中于121℃灭菌15分钟。
真菌黑曲霉，树脂支孢和球毛壳的接种是在含5×105孢子/ml的马玲薯葡萄糖肉汤中制备的。马玲薯葡萄糖肉汤如下制备：将4g马玲薯提取物和20g葡萄糖悬浮在1升蒸馏水中，然后将其加热成溶液，再将溶液等分，在高压灭菌器中于121℃灭菌15分钟。
各种试验化合物的原溶液被制备成含10，000ppm（1%w）试验化合物的蒸馏水溶液（万一该化合物不溶，在原溶液中加入4%v/v丙酮）。试验表明丙酮的量不会对上列的微生物生长产生不良影响。实验步骤如下：
（ⅰ）硫酸盐还原菌试验的稀释液
在上述改进的Postgate′s培养基B中由每一化合物的原始溶液制备其等分（9.9ml）稀释液。这些稀释液含100ppm化合物。然后 这些稀释液用0.1ml接种物接种。在30℃培育后，在2，5和10天记录孢子的生长情况，孢子的生长或死亡是通过培养基变黑（由于产生了硫酸亚铁）显示的。在100ppm呈活性的化合物进一步以其5，10，25和50ppm的浓度试验。
（ⅱ）其它试验细菌，酵母菌和丝状真菌的稀释液
用灭菌的蒸馏水从每一化合物的原始溶液制备其稀释液。这些稀释液含50，100，500和1000ppm化合物。将里特里盘隔成许多相同大小的井型空间，在分隔出的空间里分别加入0.3ml各种浓度的每一试验化合物和2.7ml一种上述的微生物接种。这样最终得到的试验化合物浓度为5，10，50和100ppm。
在暗处于30℃培育后，检测井中的孢子是增长还是消失。细菌和酵母菌培养物分别在培育24小时和72小时检测，真菌培养物在3，7和10天后检测。
通过上面的试验方法，测定出各个试验化合物的最小抑制浓度。结果见下面表3。
表3
最小抑制浓度（ppm）
实例
Sa Bs Ec Dsp Sc An Cr Chg
号
1 ＞100 50 ＞100 25 5-25 25 25-50 10
4 100 50 ＞100 ＞100 ＞100 100 25 ＞100
5 ＞100 100 ＞100 ＞100 50 10 25 5-25
6 100 100 ＞100 100 25 25 25 25
8 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 100 10 10 ＜100＊
9 ＞100 50 ＞100 100 50 25 25 50
10 ＞100 ＞100 ＞100 100 ＞100 25 25 ＜100＊
11 100 25 100 100 100 25 50 25
12 ＞100 50 100 50 ＞100 ＞100 100 100
13 100 100 100 ＞100 100 10 100 25
14 ＞100 ＞100 ＞100 100 50 10 25 ＜5
15 ＞100 100 ＞100 ＞100 50 10 ＞100 ＞100
16 ＞100 ＞100 ＞100 50-100 100 50 ＞100 NT
17 100 ＞100 ＞100 ＞100 50 ＜5 25 ＜100
18 5 ＞100 ＞100 ＞100 100 100 100 100
20 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 ＞100 100 100 NT
22 ＞100 50-100 ＞100 50 25 10 10-25 5
23 ＞100 50 ＞100 100 25 25 25 ＜100＊
26 100 50 ＞100 100 ＞100 25-50 25-100 50
27 ＞100 ＞100 ＞100 100 ＞100 100 25 ＜100＊
28 ＞100 50-100 ＞100 100 25 10-25 25-50 25
29 ＞100 100 ＞100 ＞100 50 25-100 50-100 5-100
＊仅在100ppm试验
NT：没试验
实验B3
验证实例17和23化合物的杀线虫活性。它们被用来在水中筛选对水稻根部的线虫Meloidogyne graminicola的活性，由此来研究在该化合物稀释水溶液中保留该线虫的作用，还被用于土壤浸润试验，其中研究这些线虫在高梁（s.bicolor）根部造成节疤的倾向与应用到土壤上的化合物浓度的关系。在每一试验中，均发现这些化合物有抗线虫活性。在水中的测定出实例23化合物的最小抑制浓度为0.53ppm。