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一种包含铁皮石斛纯化提取物的石斛营养粉及制备方法.pdf

  • 上传人:1520****312
  • 文档编号:7439944
  • 上传时间:2019-10-10
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  • 摘要
    申请专利号:

    CN201810117982.0

    申请日:

    20180206

    公开号:

    CN108477612A

    公开日:

    20180904

    当前法律状态:

    有效性:

    审查中

    法律详情:

    IPC分类号:

    A23L33/105,A23L33/125,A23L33/175,C08B37/00

    主分类号:

    A23L33/105,A23L33/125,A23L33/175,C08B37/00

    申请人:

    刘利勇

    发明人:

    刘利勇

    地址:

    518000 广东省深圳市龙岗区布吉镇南岭祥云苑B栋503

    优先权:

    CN201810117982A

    专利代理机构:

    深圳茂达智联知识产权代理事务所(普通合伙)

    代理人:

    夏龙

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    内容摘要

    本发明提供了一种包含铁皮石斛纯化提取物的石斛营养粉及其制备方法,其中,所述营养粉颗粒具有核‑壳结构体,并至少包括:铁皮石斛氨基酸改性的慢消化淀粉,铁皮石斛纯化多糖以及石斛酚。本发明的石斛营养粉适合包括高血糖在内的各种人群食用,具有良好的降血糖作用和健康营养价值。

    权利要求书

    1.一种包含铁皮石斛纯化提取物的石斛营养粉的制备方法,所述制备方法包括如下步骤:(1)从铁皮石斛叶中提取游离氨基酸;(2)用提取的铁皮石斛游离氨基酸制备改性的慢消化淀粉;(3)提取并纯化铁皮石斛多糖组分,所述多糖组分相对分子量大于150KDa;(4)从提取多糖步骤的铁皮石斛脱脂液中提取并纯化石斛酚;(5)配制浆料并构建石斛营养粉颗粒,其中所述的铁皮石斛多糖与石斛酚质量比为100:0.1-0.5。 2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)具体制备如下:(a)将清洗并经杀青烘干粉碎后的铁皮石斛叶片粉末过100目筛,加入10-40倍质量的蒸馏水,于水浴振荡器中在50-60℃下浸提20-30min,浸提结束后,将浸提液趁热减压抽滤,收集滤液并冷却至室温;向滤液中加入0.5-1倍体积的无水乙醇去除残余蛋白,4℃下纯化处理6-18h,以8000-9000r/min离心15-20min,取上清液,过滤,滤液减压浓缩,在50-60℃下真空干燥得氨基酸粗品;游离氨基酸粗品的提取含量为35-50mg/g;(b)将上述氨基酸粗品用6-8倍质量的50-60%乙醇溶解,浓缩,采用真空蒸发结晶,得到精制的氨基酸晶体。 3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)具体制备如下:(1)将慢消化淀粉溶解于蒸馏水中,室温下搅拌制成质量分数20~40%的慢消化淀粉乳液;(2)向上述慢消化淀粉乳中加入从铁皮石斛叶中提取的游离氨基酸晶体,室温下磁力搅拌20~30min,干燥至水分含量在50-60%;(3)将上述步骤所得产物放入密闭保温反应器中在55~60℃下保温处理10~16h;(4)将反应物取出,自然冷却至室温,真空干燥至水分含量小于10%,粉碎,过筛,即得铁皮石斛游离氨基酸改性的慢消化淀粉。 4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)具体制备如下:(1)制备石斛多糖粗品:将铁皮石斛茎微粉过60目筛,用8-10倍质量的食品级95%乙醇浸泡30min后,回流脱脂1-1.5h;将脱脂产物粉末用15-20倍质量的蒸馏水溶解,然后水浴升温至50-55℃时添加石斛干粉质量1-2%的纤维素酶酶解1-2h,破坏细胞壁,充分释放多糖组分;然后将酶解液加热至90-95℃,高温灭酶,并保温30-60min,每间隔5min采用超声提取1-2min,过滤收集滤液;将滤渣加10倍质量蒸馏水,加热至90-95℃,并保温40-60min,每间隔5min超声提取1-2min,过滤,合并滤液,将滤液经旋转蒸发仪真空浓缩至十分之一体积,向上述浓缩液中加入3-4倍体积无水乙醇,于0-4℃或冰浴静置12-24小时沉淀多糖,过滤,并用75%的食用级乙醇洗涤沉淀,沉淀经烘干粉碎制得含蛋白的多糖粗品;取上述多糖提取物粗品溶于20-50倍质量水中,加入20-25%体积比的Sevag试剂(异戊醇:氯仿为1:4配制而成),超声震荡3-5min后,于常温下3000-4000r/min离心15-20min,取上清重复上述超声震荡-离心操作3-4次;合并上清液,加入3-4倍体积乙醇,冰浴放置10-12小时,过滤,收集沉淀物并用无水乙醇洗涤,蒸除溶剂,真空干燥得石斛多糖粗品;(2)纯化多糖:取上述石斛多糖粗品溶于水中,用截留分子量4000Da的透析膜透析24-48h除单糖及寡糖后,取出透析袋内液体经10000-12000rpm离心10-15min,浓缩上清液,冷冻干燥,获得石斛多糖预制品;将上述多糖预制品用具分子筛效应的丙烯葡聚糖柱色谱或通过NaCl阶段洗脱的DEAE-52纤维素离子交换柱进行分离纯化,收集主峰组分,合并浓缩150KDa以上的多糖组分,加入适量乙醇,冰浴放置12h,过滤,收集沉淀物并用无水乙醇洗涤,沉淀冷冻干燥,制得所述的铁皮石斛多糖精品。 5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(4)具体制备如下:收集上述制备石斛多糖中的回流脱脂步骤的乙醇萃取组分,减压浓缩,以正己烷萃取2-3次,再以乙酸乙酯萃取3-4次,蒸除滤液而得到石斛酚粗浸膏;加入适量的20%碳酸钠溶液搅拌反应2-3小时,放置4-12小时,高速离心收集上清液,浓缩,充入纯净二氧化碳酸化1-2小时,得白色絮状沉淀,离心取沉淀,并用蒸馏水清洗两遍;将沉淀加入乙醇至恰好完全溶解,以2-3BV/h上反相硅胶柱进行吸附分离,以水-乙醇系统梯度洗脱,薄层色谱法跟踪检测,收集石斛酚段洗脱液,减压浓缩得石斛酚粗品,用无水乙醇结晶,并重结晶2-3次,得白色石斛酚晶体;其中,优选地,所述的石斛酚粗浸膏与碳酸钠溶液的质量用量比例为1:10-20。 6.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)具体制备如下:(1)将制备的石斛氨基酸改性慢消化淀粉加入蒸馏水配制15-30wt%的淀粉乳液,磁力搅拌器上匀速搅拌至均匀,边搅拌边加入海藻糖、结冷胶以及上述步骤制得的石斛多糖、石斛酚,搅拌均匀后用均质机均质,其中混合后的石斛多糖、石斛酚、海藻糖以及结冷胶的含量为:石斛多糖5-15wt%,海藻糖2-3wt%,结冷胶0.1wt%,石斛酚用量为石斛多糖的0.1-0.5wt%;将均质后的混合液静电喷雾干燥,制得凝胶颗粒粉料;(2)向3-5wt%的海藻酸钠溶液中加入适量的羟丙甲基纤维素、甜菊糖甙、壳聚糖,均质搅拌均匀,制得粘性浆料,其中各原料的质量百分含量为:海藻酸钠3-5wt%,羟丙甲基纤维素1-3wt%,甜菊糖甙0.1-0.3wt%,壳聚糖0.1-0.2wt%;用喷涂干燥机将所述粘性浆料均匀喷涂在上述凝胶颗粒粉料表面,从而制得所述的石斛营养粉。 7.根据权利要求1-6任一项所述制备方法制得的石斛营养粉。 8.含有权利要求7所述石斛营养粉的食品、保健品或者药物组合物。 9.如权利要求7所述石斛营养粉的用途,其特征在于,用于制备降低糖尿病人血糖水平的制剂或制品。

    说明书

    技术领域

    本发明涉及一种可降低血糖的、包含铁皮石斛纯化提取物的石斛营养粉及制备方法,更具体地涉及一种核壳结构的包含铁皮石斛特定多糖组分、氨基酸和石斛酚提取物的可冲调石斛营养粉及其制备方法,属于降血糖食品领域和营养保健品领域。

    背景技术

    石斛(学名:Dendrobium nobile Lindl),又名仙斛兰韵、不死草、还魂草、紫萦仙株、林兰、禁生、金钗花等。药用植物,性味甘淡微咸,寒,归胃、肾,肺经。益胃生津,滋阴清热。入药以来常用于阴伤津亏,口干烦渴,食少干呕,病后虚热,目暗不明。作为我国传统的名贵中药材,药用石斛包括鲜石斛、金钗石斛、铁皮石斛、环草石斛、马鞭石斛等;2010版药典开始将“铁皮石斛”单独列项,为兰科石斛属植物铁皮石斛的新鲜或干燥茎。2010版药典开始“石斛”项下分为三种植物金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛的新鲜或干燥茎。另外常用的药用石斛还有霍山石斛,俗称米斛;齿瓣石斛,还有美花石斛、束花石斛等。

    研究医药表明,石斛具有极高的药用和保健功能,因此得到了深入广泛的研究。研究表明其药效成分包括:石斛多糖、石斛氨基酸、生物碱、黄酮类等。其主要药效成分为石斛多糖,为活性多糖的一种,石斛多糖为分子量分布较广的一类杂多糖。杂多糖为两种或两种以上不同单糖分子组成的多糖。经研究证明,石斛多糖能显著降低机体的血糖值,与口服降血糖药例如磺酰脲类不同,它对正常血糖无降低作用,也不提高血清胰岛素水平,且对胰岛细胞具有修复作用;同时铁皮石斛多糖还具有胰外降血糖的作用,通过抑制肾上腺素引起的肝糖原分解和促进肝糖原合成,从而可减少血糖的来源,增加血糖的去路,达到降低血糖值的目的。

    浙江大学吴昊姝等对铁皮石斛降血糖作用及其机制进行了专门的实验研究。选用正常小鼠,肾上腺紊性高血糖小鼠、链脲佐菌素性糖尿病大鼠作为实验对象,从血糖值、血清胰岛素和胰岛血糖素水平入手,采用放射免疫分析和免疫组化HRP-SPA染色体等方法,结合胰岛α细胞和β细胞的形态学变化等方面,肯定了铁皮石斛具有明显的降血糖作用。其降血糖的胰内机制是促进胰岛β细胞分泌胰岛素,抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素,胰外机制是促进肝糖原合成。此研究为铁皮石斛用于治疗糖尿病提供了药理依据,并为铁皮石斛作为降血糖新药开发展示了广阔的前景。

    可见,在上述药用石斛中,铁皮石斛含有较高的优质多糖含量。

    进一步的多项研究发现,多糖是铁皮石斛的主要成分,水溶性多糖含量高达22%以上。石斛生理活性的强弱与其多糖含量密切相关。多糖含量越高,质越重,嚼之越有粘性,质量更优。在铁皮石斛的不同部位,总多糖的质量分数由高到低依次为茎中、茎上、茎下、根部。但水溶性多糖分布规律是叶≥根>茎。现代研究发现,铁皮石斛原球茎的水溶性多糖后发现其主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,其分子物质的量之比为1.1204:1:1.046:23.354:3.828:1.046。其中,提取水溶性多糖后,其中葡萄糖占据了巨大部分。

    因此,现有技术中直接将铁皮石斛磨粉或多糖提取物直接食用以预期降低血糖的做法,往往导致摄取大量的葡萄糖等易导致高血糖的组分,大大降低了石斛多糖的药用效果,甚至没有相应的效应。这也是本发明要克服的石斛多糖类保健品现有技术弊端之一。

    在现有技术中,尽管药用石斛多糖的药理活性及化学结构研究取得了许多进展,但在药理活性研究方面,所使用多糖主要是粗多糖,关于药用石斛多糖活性作用机理的研究还不多;在化学结构研究方面,很多具有药理活性的多糖组分,其化学结构尚未明确。而且,药用或食品级的石斛多糖的分离纯化仍然存在各种不足,例如提取率低,纯度不高,程序繁琐,不适合工业化生产,原材料浪费严重等。

    另外,石斛对于糖尿病合并症和并发症同样具有良好的效果。例如,石斛的石斛酚成分有助于改善糖尿病并发白内障。

    石斛酚(Gigantol),一种联苄类酚性物质((4-(3-羟基-5-甲氧基苯乙基)-2-甲氧基苯酚),是石斛的药用有效成分之一。目前已发现一些证据阐明了石斛具有多种生物学活性,包括增强机体免疫力、帮助胃部消化、抗白内障、调节血糖、抗肿瘤等作用。通过对石斛酚机理研究发现,石斛酚可以阻滞由脂多糖诱导的诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶的表达,是石斛中抗白内障的有效成分,它能有效抑制AR(醛糖还原酶),改善糖尿病患者多元醇代谢通路异常,预防和延迟糖尿病及其并发症白内障的发生和发展。

    陈丹等(《广州中医药大学》,2014)研究发现,浓度为120μmol/L的石斛酚对iNOS的抑制率为100%,其半数抑制量(IC50)为(32.227±5.73)μmol/L;石斛酚通过对iNOS活性位点的直接作用,进而抑制NO的产生,两者作用氨基酸位点是lle195、Gln257,实验证明石斛酚对iNOS具有良好的抑制作用,能够改善修复糖尿病患者多元醇代谢通路,预防和延迟糖尿病及其并发症。

    石斛中其他有益的主要组分还包括氨基酸。石斛中的氨基酸主要以游离形式存在,除多糖外,其氨基酸的含量要远高于其他成分。游离的氨基酸也是石斛中的主要有效成分之一。实验证明铁皮石斛含有除色氨酸以外的全部人体必需氨基酸,其中主要氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸,这5种氮基酸占总氨基酸的53%左右。其中,谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的含量占总含量的35.8%左右。

    目前,已公开了较多对石斛的提取工艺和制剂制品,例如:

    CN104784505A公开了一种辅助降血糖的铁皮石斛保健品及其制备方法,按重量份数计,称取如下原料组分,铁皮石斛鲜条35~45份,西洋参1~2份,葛根2~4份,天花粉2~4份以及五味子1~2份。制备方法,包括如下步骤:原料称取、铁皮石斛鲜条的处理、西洋参的处理、醇提、水提、干燥以及配料七个步骤制成。所述原料组方中药滋阴益气,清热生津,药物有效成分易于吸收,有利于发挥药效;所述原料组方中各药材均为药食同源药材,无毒副作用。

    CN104126746A公开了一种降血糖、降血脂的铁皮石斛组合物及其制备方法,由以下重量配比的中药原料药制成:铁皮石斛10-40份、山药10-30份、决明子5-35份、黄精10-30份、黄精10-30份、燕麦提取物10-30份、麦芽糊精10-20份、大豆低聚糖2-10份。本发明的优点是:本发明综合利用了铁皮石斛、山药、决明子、黄精、燕麦β-葡聚糖、大豆低聚糖等多种原料,并辅以适量麦芽糊精,制备成具有降低血糖和血脂的组合物。铁皮石斛、山药、决明子、黄精、燕麦均含有多糖类物质,经实践证明具有较好的降低血糖、降低血脂和治疗糖尿病等功效。

    CN104958564A公开了一种铁皮石斛口服液及其制备方法,铁皮石斛口服液由铁皮石斛、龙眼肉和桑椹加水煎煮加工而成,每1000mL铁皮石斛口服液由90~100g铁皮石斛、90~100g龙眼肉和90~100g桑椹经加水煎煮后加工而成。本发明中原料经多次煎煮的制备方法,能高效提取药材中的有效成分,铁皮石斛口服液中铁皮石斛、龙眼肉和桑椹三种组分按比例调配,能固本培元、滋阴补益,组分中含有的天然的植物多糖类物质能增强免疫功能,铁皮石斛口服液中无蔗糖,无任何添加剂,高血糖高血脂人群均可食用。

    CN104324244A公开了一种复方铁皮石斛降糖胶囊,采用铁皮石斛辅以黄芪、葛根、生地、天花粉、黄精、枸杞子、赤芍7味中药,采用粉碎、萃取、混合、制粒、包装制备出降糖胶囊,起到相互影响,协同共作的作用;可促进胰岛β细胞分泌胰岛素,抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素,同时可抑制肾上腺素引起的肝糖原分解和促进肝糖原合成,从而减少血糖来源,增加血糖去路,降低血糖值,无毒副作用和不良反应,可使糖尿病的“三多一少”症状和糖尿病并发症得到有效地控制和消除。

    但是,上述现有技术通常采用石斛全粉,如上所述,其全粉中包含了许多对降血糖无益的组分。即使少数提取了多糖,但现有技术提取多糖组分后,通常舍弃残料废渣,其内的氨基酸也一并浪费掉,很不经济。

    铁皮石斛11个品系的叶片中总氨基酸平均质量分数为7.43%,茎为1.91%,叶片显著高于茎,且氨基酸组成接近FAO/WHO提出的理想蛋白质的标准,具有良好的功能食品开发前景。

    关于游离氨基酸的提取方法很多,包括超声波提取法、酶解提取法、高压热水浸提法、溶剂提取法、微波提取法等。目前应用较多的有高压热水浸提法、超声波提取法、酶解提取法等,但游离氨基酸的提取率和提取工艺仍有待提高,尤其是石斛氨基酸的提取工艺报道较少,没有达到综合充分利用石斛有效组分的目的。

    另外,值得注意的是,石斛全粉中的石斛碱虽然具有止痛、解热作用,可降低心率、血压、减慢呼吸,但是可产生中度的高血糖。另外,石斛碱作为生物碱类,不适宜过量服用。石斛碱在例如金钗石斛、铁皮石斛、樱石斛、棒节石斛、大苞鞘石斛、细茎石斛、春石斛中均有分布。目前市场上的石斛全粉中大多含有石斛碱,这对高血糖病人尤其是无益的,特别是过量服用或经常服用时容易加剧血糖升高。因此,对高血糖病人而言,分离提取石斛中的有益组分并辅以合适的制剂形式,存在迫切需求。

    目前现有技术的降血糖石斛保健品组合物中,存在的另外一个问题是没有合适的匹配载体。一方面,采取组合其他降血糖中药组分提取物时,不仅口感较差,例如苦、涩等,而且往往需要控制服用的量,过量服用导致低血糖甚至晕厥;另一方面,组合非药用组分时,例如山药、谷物等,往往导致过量的淀粉或碳水化合物的摄取,这些物质在体内分解代谢又间接提升了血糖水平,导致效果大打折扣,因此,对于匹配石斛多糖的合适载体或组分,也存在迫切需求。

    慢消化淀粉(slowly digestible starch,SDS),指那些能在小肠中被完全消化吸收但速度较慢的淀粉(20-120min);近年来临床研究发现,慢消化淀粉具有缓慢消化吸收、持续释放能量、维持餐后血糖稳态、改善葡萄糖耐量,还可降低餐后胰岛素分泌,提高机体对胰岛素的敏感性、预防和治疗各种与饮食相关慢性疾病的特殊生理学功能。慢消化淀粉作为一种新型的功能性产品,兼顾了糖尿病营养与治愈功能两大需求,不仅顺应了当代食品及药品科技发展的趋势,还满足了消费者的健康需求,这对合理利用碳水化合物预防胰岛素抵抗相关的代谢综合症发生有着重要意义。因此,众多科研工作者都着眼于慢消化淀粉的研究。例如申请号为201110112582.9的专利将醇溶蛋白放于烧杯中,加入乙醇,水浴搅拌至醇溶蛋白完全溶解,加入油酸,搅拌均匀,加入玉米淀粉,继续搅拌。在高压均质机中均质3次,离心喷雾干燥得到慢消化淀粉产品。申请号为201310058866.3的专利采用普鲁兰酶和葡萄糖苷转移酶对小麦淀粉进行处理,在通过反复重结晶的方法制备慢消化淀粉。

    如上所述,虽然现有技术提供了各种各样的慢消化淀粉制备方法,但制备的慢消化淀粉含量仍然不够高,而且功效和组分单一。

    发明内容

    如上所述,为克服现有技术中降糖石斛食品组合物的不足,本发明旨在提供一种核壳结构的、具有良好口感的能够降低血糖的铁皮石斛营养粉及其制备方法。

    另外,本发明制备方法简单,适合大规模生产,产品携带方便,稳定性好,存放时间长,既可直接冲调饮用,也可作为食品加工的添加组分,用途非常广泛。

    具体而言,本发明主要涉及如下几个方面。

    第一个方面,本发明提供了一种可降低血糖的、包含铁皮石斛纯化提取物的石斛营养粉,其中,所述营养粉具有核-壳结构体,并至少包括:铁皮石斛氨基酸改性的慢消化淀粉,铁皮石斛纯化多糖以及石斛酚。

    其中,所述的铁皮石斛纯化多糖为本发明方法纯化的特定多糖组分,有益于降低血糖。所述石斛酚可以是商购的食品级石斛酚纯品,也可是按本发明方法制备的成品。

    第二个方面,本发明提供了上述铁皮石斛营养粉的制备方法,所述制备方法包括如下制备步骤:

    (1)从铁皮石斛叶中提取游离氨基酸;

    (2)用提取的铁皮石斛氨基酸制备改性的慢消化淀粉;

    (3)提取并纯化铁皮石斛多糖组分,所述多糖组分相对分子量大于150KDa;

    (4)从提取多糖步骤的铁皮石斛脱脂废液中提取并纯化石斛酚;

    (5)配制浆料并构建营养粉颗粒,其中所述的铁皮石斛多糖与石斛酚质量比为100:0.1-0.5。

    其中,在本发明所述营养粉的制备方法中,步骤(1)具体制备如下:(a)将清洗并经杀青烘干粉碎后的铁皮石斛叶片粉末过100目筛,加入10-40倍质量的蒸馏水,于水浴振荡器中在50-60℃下浸提20-30min,浸提结束后,将浸提液趁热减压抽滤,收集滤液并冷却至室温;向滤液中加入0.5-1倍体积的无水乙醇去除残余蛋白,4℃下纯化处理6-18h,以8000-9000r/min离心15-20min,取上清液,过滤,滤液减压浓缩,在50-60℃下真空干燥得氨基酸粗品;游离氨基酸粗品的提取含量为35-50mg/g;

    (b)将上述氨基酸粗品用6-8倍质量的50-60%乙醇溶解,浓缩,采用真空蒸发结晶,得到精制的氨基酸晶体,其纯度在99%以上。

    经测定,所得晶体中主要氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸,占总氨基酸重量的一半左右。

    其中,优选地,将制得的氨基酸晶体进一步重结晶纯化。

    在本发明所述的制备方法中,步骤(2)中制备铁皮石斛氨基酸改性的慢消化淀粉采用无酶和酸碱添加剂的水热法处理,在氨基酸含量不变的基础上,通过进一步改性处理以提升慢消化淀粉含量,具体制备步骤如下:

    (a)将慢消化淀粉溶解于蒸馏水中,室温下搅拌制成20~40%慢消化淀粉乳液;

    (b)向上述慢消化淀粉乳中加入从铁皮石斛叶中提取的游离氨基酸晶体,室温下磁力搅拌20~30min,干燥至水分含量在50-60%;

    (c)将上述步骤所得产物放入密闭保温反应器中在55~60℃下保温处理10~16h;

    (d)将反应物取出,自然冷却至室温,真空干燥至水分含量小于10%,粉碎,过筛,即得铁皮石斛游离氨基酸改性的慢消化淀粉,测得其中改性的慢消化淀粉含量在78%以上。

    其中,所述的慢消化淀粉可以商购获得,也可以通过本领域普通制备方法得到,优选慢消化淀粉含量在40%以上(按Englyst法计)。

    所述的慢消化淀粉来源可以为本领域中任何天然食材来源的,例如玉米慢消化淀粉、小麦慢消化淀粉或魔芋慢消化淀粉等。

    其中,上述步骤中添加氨基酸与慢消化淀粉的比例为:所述慢消化淀粉干重与氨基酸晶体的质量比为20~30:1。

    在本发明所述的制备方法中,步骤(3)中提取并纯化铁皮石斛多糖组分的具体步骤如下:

    (a)制备石斛多糖粗品:将铁皮石斛茎微粉过60目筛,用8-10倍质量的食品级95%乙醇浸泡30min后,回流脱脂1-1.5h;将脱脂产物粉末用15-20倍质量的蒸馏水溶解,然后水浴升温至50-55℃时添加石斛干粉质量1-2%的纤维素酶酶解1-2h,破坏细胞壁,充分释放多糖组分;然后将酶解液加热至90-95℃,高温灭酶,并保温30-60min,每间隔5min采用超声提取1-2min,过滤收集滤液;将滤渣加10倍质量蒸馏水,加热至90-95℃,并保温40-60min,每间隔5min超声提取1-2min,过滤,合并滤液,将滤液经旋转蒸发仪真空浓缩至十分之一体积,向上述浓缩液中加入3-4倍体积无水乙醇,于0-4℃或冰浴静置12-24小时沉淀多糖,过滤,并用75%的食用级乙醇洗涤沉淀,沉淀经烘干粉碎制得含蛋白的多糖粗品;取上述多糖提取物粗品溶于20-50倍质量水中,加入20-25%体积比的Sevag试剂(异戊醇:氯仿为1:4配制而成),超声震荡3-5min后,于常温下3000-4000r/min离心15-20min,取上清重复上述超声震荡-离心操作3-4次,至脱蛋白完全;合并上清液,加入3-4倍体积乙醇,冰浴放置10-12小时,过滤,收集沉淀物并用无水乙醇洗涤,蒸除溶剂,真空干燥得石斛多糖粗品;

    (b)纯化多糖:

    取上述石斛多糖粗品溶于水中,用透析膜(截留分子量4000Da)透析24-48h除单糖及寡糖后,取出透析袋内液体经10000-12000rpm离心10-15min,浓缩上清液,冷冻干燥,获得石斛多糖预制品;将上述多糖预制品用具分子筛效应的丙烯葡聚糖柱色谱(Sephacryl S-200)或通过NaCl阶段洗脱的DEAE-52纤维素离子交换柱进行分离纯化,收集主峰组分,合并浓缩150KDa以上的多糖组分(占总糖的73%以上),加入适量乙醇(至乙醇含量为70-75%),冰浴放置12h,过滤,收集沉淀物并用无水乙醇洗涤,沉淀冷冻干燥,制得本发明所述的铁皮石斛多糖精品,以原材料计所得多糖精品收率13.8%。经苯酚硫酸法测定多糖含量为95%以上,bradford法测定蛋白在0.5%以下。

    其中,所述的多糖粗品也可以采用市售的铁皮石斛多糖提取物,并采用本发明的纯化方法进一步纯化。

    在本发明所述的制备方法中,步骤(4)中提取并纯化石斛酚的具体步骤如下:

    收集上述制备石斛多糖中的回流脱脂步骤舍弃的乙醇萃取组分,减压浓缩,以正己烷萃取2-3次,再以乙酸乙酯萃取3-4次,蒸除滤液而得到石斛酚粗浸膏;加入适量的20%碳酸钠溶液搅拌反应2-3小时,放置4-12小时,高速离心收集上清液,浓缩,充入纯净二氧化碳酸化1-2小时,得白色絮状沉淀,离心取沉淀,并用蒸馏水清洗两遍;将沉淀加入乙醇至恰好完全溶解,以2-3BV/h上反相硅胶柱进行吸附分离,以水-乙醇系统梯度洗脱,薄层色谱法跟踪检测,收集石斛酚段洗脱液,减压浓缩得石斛酚粗品,用无水乙醇结晶,并重结晶2-3次,得白色石斛酚晶体,以石斛干粉计提取率为0.5mg/g。

    其中,所述的石斛酚粗浸膏与20%碳酸钠溶液的质量用量比例为1:10-20。

    在本发明所述的制备方法中,步骤(5)中构建营养粉颗粒的具体步骤如下:

    (a)将制备的石斛氨基酸改性慢消化淀粉加入蒸馏水配制15-30wt%的淀粉乳液,磁力搅拌器上匀速搅拌至均匀,边搅拌边加入海藻糖、结冷胶以及上述步骤制得的石斛多糖、石斛酚,搅拌均匀后用均质机均质,其中混合后的石斛多糖、石斛酚、海藻糖以及结冷胶的含量为:石斛多糖5-15wt%,海藻糖2-3wt%,结冷胶0.1wt%,石斛酚含量为石斛多糖的0.1-0.5%;将均质后的混合液静电喷雾干燥,制得凝胶颗粒粉料;

    (b)向3-5wt%的海藻酸钠溶液中加入适量的羟丙甲基纤维素、甜菊糖甙、壳聚糖,均质搅拌均匀,制得粘性浆料,其中各原料的质量百分含量为:海藻酸钠3-5wt%,羟丙甲基纤维素1-3wt%,甜菊糖甙0.1-0.3wt%,壳聚糖0.1-0.2wt%;用喷涂干燥机将所述粘性浆料均匀喷涂在上述凝胶颗粒粉料表面,从而制得所述的石斛营养粉颗粒。

    其中,所述粘性浆料的喷涂用量为凝胶颗粒粉料重量的三分之一至二分之一。

    本发明的第三个方面,提供通过上述制备方法制得的石斛营养粉。

    本发明的第四个方面,提供营养粉的用途,其可以作为冲调品直接食用,也可以作为食品加工的添加剂,将其用于主食的加工处理过程。

    本发明的第五个方面,提供一种食品、保健品或者药物组合物,其特征在于,所述食品、保健品或者药物组合物包含本发明所述的石斛营养粉颗粒。

    在本发明的所述营养粉中,涉及组成的“包括”,既包含了开放式的“包括”、“包含”等及其类似含义,也包含了封闭式的“由…组成”等及其类似含义。

    本发明的有益效果还包括但不限于以下:

    相对于现有技术的石斛微粉或多糖粗品组合物,去除了不必要的葡萄糖等单糖/寡糖、具有升血糖效应的生物碱等无益组分,纯化浓缩并筛选了有益的多糖组分,辅以合理比例的用以改善糖尿病并发症的石斛酚组分,以及石斛氨基酸改性的高含量慢消化淀粉,充分高效利用石斛原材料,在效果上达到了协同增效改善血糖的目的,不仅适合高血糖人群日常服用以降血糖,由于多糖尤其是石斛酚不刺激胰岛素分泌的机制,也适合普通人群日常食用以达到预防糖尿病、肥胖症等目的。

    另外,本发明制备方法简单,适合大规模生产,具有良好的应用前景和市场价值。

    具体实施方式

    下面通过具体的制备例和实施例对本发明进行详细说明,但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明,并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定,更非将本发明的保护范围局限于此。

    制备例1:从铁皮石斛叶中提取游离氨基酸

    (1)将清洗并经杀青烘干粉碎后的铁皮石斛叶片粉末50克过100目筛,加入1500ml蒸馏水,于水浴振荡器中在60℃下浸提30min,浸提结束后,将浸提液趁热减压抽滤,收集滤液30ml并冷却至室温;

    (2)向滤液中加入0.5倍体积的无水乙醇去除残余蛋白,4℃下纯化处理12h,以8000r/min离心20min,取上清液,用截留分子量为1000Da的纳滤膜过滤,滤液减压浓缩,在50℃下真空干燥得氨基酸粗品2.5克;游离氨基酸粗品的提取含量为50mg/g;

    (3)将上述氨基酸粗品用20ml的50%乙醇溶解,浓缩,采用真空蒸发结晶,得到精制的氨基酸晶体,测得其纯度在99%以上。

    制备例2:制备铁皮石斛氨基酸改性的慢消化淀粉

    (1)将100克魔芋慢消化淀粉溶解于蒸馏水中,室温下搅拌制成20~40%慢消化淀粉乳液;向上述慢消化淀粉乳中加入上述从铁皮石斛叶中提取的游离氨基酸晶体5克,室温下磁力搅拌30min,干燥至水分含量在50%;

    (2)将上述步骤所得产物放入密闭保温反应器中在55℃下保温处理16h;

    (3)将反应物取出,自然冷却至室温,真空干燥至水分含量小于10%,粉碎,过筛,即得铁皮石斛游离氨基酸改性的慢消化淀粉,按Englyst法计测得其中改性的慢消化淀粉含量约为82%。

    制备例3:提取并纯化铁皮石斛多糖组分

    (1)制备石斛多糖粗品:称取干净的铁皮石斛茎微粉100克过60目筛,用1000ml食品级95%乙醇浸泡30min后,回流脱脂1.5h;将干燥后的脱脂产物粉末用15倍质量的蒸馏水溶解,然后水浴升温至55℃时添加石斛干粉质量2%的纤维素酶酶解2h,破坏细胞壁,充分释放多糖组分;然后将酶解液加热至95℃,高温灭酶,并保温60min,每间隔5min采用超声提取1min,过滤收集滤液;将滤渣加10倍质量蒸馏水,加热至90℃,并保温40min,每间隔5min超声提取2min,过滤,合并滤液,将滤液经旋转蒸发仪真空浓缩至十分之一体积,向上述浓缩液中加入3倍体积无水乙醇,于0-4℃或冰浴静置18小时沉淀多糖,过滤,并用75%的食用级乙醇洗涤沉淀,沉淀经烘干粉碎制得含蛋白的多糖粗品;

    (2)取上述多糖提取物粗品溶于20倍质量水中,加入20%体积比的Sevag试剂(异戊醇:氯仿为1:4配制而成),超声震荡5min后,于常温下4000r/min离心20min,取上清重复上述超声震荡-离心操作3次,至脱蛋白完全;合并上清液,加入4倍体积乙醇,冰浴放置12小时,过滤,收集沉淀物并用无水乙醇洗涤,蒸除溶剂,真空干燥得石斛多糖粗品;

    (3)纯化多糖:

    取上述除去蛋白后的石斛多糖粗品溶于水中,用截留分子量4000Da的透析膜透析24h除去单糖及寡糖,取出透析袋内液体经12000rpm离心15min,浓缩上清液,冷冻干燥,获得石斛多糖预制品;

    (4)将上述多糖预制品用具分子筛效应的丙烯葡聚糖柱色谱(Sephacryl S-200)或通过NaCl阶段洗脱的DEAE-52纤维素离子交换柱进行分离纯化,收集主峰组分,合并浓缩150KDa以上的多糖组分,加入适量乙醇至乙醇含量为70%,冰浴放置12h,过滤,收集沉淀物并用无水乙醇洗涤,沉淀冷冻干燥,制得所述的铁皮石斛多糖精品,以原材料计所得多糖精品收率13.8%。经苯酚硫酸法测定多糖含量为97%,bradford法测得蛋白含量0.4%。

    制备例4:提取并纯化石斛酚

    收集上述制备例3中回流脱脂步骤的乙醇萃取溶液,减压浓缩至50ml,以正己烷萃取2-3次,再以乙酸乙酯萃取3-4次,蒸除滤液而得到石斛酚粗浸膏5克;加入50克的20%碳酸钠溶液搅拌反应3小时,放置12小时,6000r/min高速离心收集上清液,浓缩,充入纯净二氧化碳酸化1小时,得白色絮状沉淀,离心取沉淀,并用蒸馏水清洗两遍;将沉淀加入乙醇至恰好完全溶解,以3BV/h上反相硅胶柱进行吸附分离,以水-乙醇系统梯度洗脱,薄层色谱法跟踪检测,收集石斛酚段洗脱液,减压浓缩得石斛酚粗品,用无水乙醇结晶,并重结晶2次,得白色石斛酚晶体50.3mg,纯度99%,以石斛干粉计提取率为0.5mg/g。

    制备例5:构建营养粉颗粒

    (1)将制备的石斛氨基酸改性慢消化淀粉100克加入蒸馏水配制20wt%的淀粉乳液500克,磁力搅拌器上匀速搅拌至均匀,边搅拌边加入适量的海藻糖、结冷胶以及上述步骤制得的石斛多糖、石斛酚,搅拌均匀后用均质机均质,其中混合后的石斛多糖、石斛酚、海藻糖以及结冷胶的含量为:石斛多糖10wt%,海藻糖2wt%,结冷胶0.1wt%,石斛酚含量为0.01wt%;将均质后的混合液静电喷雾干燥,制得凝胶颗粒粉料;

    (2)向3wt%的海藻酸钠溶液中加入适量的羟丙甲基纤维素、甜菊糖甙、壳聚糖,均质搅拌均匀,制得粘性浆料500克,其中各原料的质量百分含量为:海藻酸钠3wt%,羟丙甲基纤维素1wt%,甜菊糖甙0.1wt%,壳聚糖0.2wt%;用喷涂干燥机将所述粘性浆料均匀喷涂在快速翻滚的上述凝胶颗粒粉料表面,真空干燥,灭菌,从而制得所述的石斛营养粉颗粒。

    对比例1:提取并纯化3-10KDa的铁皮石斛多糖组分

    除纯化并收集3-10KDa区间的铁皮石斛多糖组分之外,按照制备例3中相同的方法实施了对比例1。

    对比例2:提取并纯化10-150KDa的铁皮石斛多糖组分

    除纯化并收集10-150KDa区间的铁皮石斛多糖组分之外,按照制备例3中相同的方法实施了对比例2。

    效果实施例1:降血糖测试

    试验方法:选取健康雄性KM小鼠,体重20g(上下差异率10%),将小鼠随机分为5组:空白对照组,模型对照组以及3组受试组;其中给予受试物组的多糖组分分别为:制备例3多糖组分、对比例1多糖组分、对比例2多糖组分,每组实验动物10只,实验期为30天。

    小鼠糖尿病模型建立:小鼠禁食12h,一次性腹腔注射链脲佐菌素15mg/100g体重,造模一周后小鼠禁食12h,测空腹血糖值高于11mmol/L者为造模成功的糖尿病模型。

    其中,空白对照组:正常小鼠每日灌胃等量蒸馏水;

    模型对照组:糖尿病小鼠每日灌胃等量蒸馏水;

    受试组:每天以120mg/kg.bw多糖组分灌胃糖尿病小鼠。

    数值均取平均值,实验结果如下:

    表1

    由上表可见,与模型对照组相比较,制备例3中多糖组分(大于150KDa)可显著降低糖尿病小鼠空腹血糖水平和血糖曲线下面积;对比例2中多糖组分(10-150KDa)一定程度上能降低糖尿病小鼠空腹血糖水平;对比例1中多糖组分(3-10KDa)仅能轻微降低糖尿病小鼠空腹血糖水平,效果微乎其微。

    该实验结果说明相对于低分子量多糖,150KDa以上的石斛多糖组分对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。由此可以证明本发明的营养粉颗粒对糖尿病具有降血糖效果,并可改善糖尿病并发症。

    应当理解,这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外,也应理解,在阅读了本发明的技术内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型,所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

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