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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510412505.3 (22)申请日 2015.07.14 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105077510 A (43)申请公布日 2015.11.25 (73)专利权人 庆元县金源真菌多糖制品有限责 任公司 地址 323800 浙江省丽水市庆元县松源镇 菇源路132号 (72)发明人 杨开 张佳妍 叶帮伟 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 李世玉 (51)Int.Cl. A23L 3/3463(2006.。
2、01) 审查员 冯向阳 (54)发明名称 一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂 的应用 (57)摘要 本发明公开了一种松木层孔菌超临界萃取 物作为抑菌剂的应用， 所述超临界萃取物是将松 木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取 物， 所述超临界萃取条件为： 以CO2为超临流体， 萃取压力为2040MPa， 时间13h， 温度30-50 ， CO2流速为1020g/min； 本发明松木层孔菌 提取物对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和枯草芽孢 杆菌等几种食品常见细菌均有较好的抑制效果， 对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度 为2.5mg/mL， 对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均 为5.0mg/m。
3、L； 由于超临界萃取物是非极性， 可用 于油脂类的抑菌剂， 以期应用于食品的防腐和贮 藏保鲜。 权利要求书1页 说明书6页 CN 105077510 B 2018.11.02 CN 105077510 B 1.一种松木层孔菌(Phellinus pini)超临界萃取物作为抑菌剂的应用， 其特征在于所 述超临界萃取物是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物， 所述超临界萃 取条件为： 以CO2为超临流体， 萃取压力为2040MPa， 时间13h， 温度30-50， CO2流速为 1020g/min。 2.如权利要求1所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用， 其特征在于所述松 木层。
4、孔菌子实体在萃取前先粉碎， 过2040目筛， 4060干燥， 获得松木层孔菌子实体粉 末； 然后将粉末加入CO2超临界萃取仪的萃取釜进行CO2超临界萃取。 3.如权利要求2所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用， 其特征在于所述萃 取压力为3040MPa， 时间23h， 温度30-50， CO2流速为1520g/min。 4.如权利要求1所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用， 其特征在于抑菌剂 为大肠杆菌抑菌剂、 金黄色葡萄球菌抑菌剂或枯草芽孢杆菌抑菌剂。 5.如权利要求4所述松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用， 其特征在于超临界 萃取物对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为。
5、2.5mg/mL， 对枯草芽孢杆菌的最低 抑菌浓度均为5.0mg/mL。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105077510 B 2 一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用 (一)技术领域 0001 本发明涉及一种松木层孔菌提取物的应用， 特别涉及一种松木层孔菌超临界萃取 物作为抑菌剂的应用。 (二)背景技术 0002 每年世界上食品因微生物腐败造成的损失不计其数， 食品腐败变质不仅会使食品 丧失营养价值， 还会造成食物中毒。 为了延长食品贮运和保藏期限， 在食品加工过程中除杀 (灭)菌外， 还普遍采用通过添加防腐剂的手段， 使微生物丧失活性、 延缓或阻止其生长。 食 品防腐剂按。
6、来源通常分为合成防腐剂与天然防腐剂两大类。 目前国内外大量使用的食品防 腐剂仍以化学合成为主， 如对羟基苯甲酸酯、 苯甲酸、 山梨酸及其盐类等化学合成防腐剂。 但是， 经过长期的应用和研究发现， 这些化学防腐剂对人体都会有或多或少的毒害作用， 尤 其在长期使用或过量使用时， 一些合成防腐剂还存在诱癌性、 致畸性和易引起食物中毒等 问题。 0003 相比上述的化学合成防腐剂， 天然防腐剂， 尤其是食品来源， 或经长期使用的药用 植物或真菌来源， 不仅具有安全无毒的优点， 而且通常还具有一定的营养和保健功效。 随着 社会和经济发展， 消费者健康意识的增强， 天然防腐剂已成为研究和开发的趋势。 00。
7、04 食药真菌是一类具有较高营养或药用价值的高等真菌， 普遍具有抗肿瘤、 降血糖、 降血脂、 抗病毒和增强免疫力等诸多功效。 另外一些食药真菌的子实体或菌丝体的提取物 也显示了一定的防腐抑菌作用， 如桦褐孔菌、 红菇、 松乳菇、 杨树菇、 木蹄层孔菌、 蒙古口蘑、 巨大口蘑、 棘托竹荪、 虎奶菇、 大秃马勃、 大球盖菇、 鲍鱼菇、 巴西蘑菇等。 但有些采用了有毒 有害的有机溶剂萃取， 从安全性考虑， 不可避免对食品应用有少许残留， 因此无实际食品的 防腐应用价值， 另外有机溶剂易燃易爆， 生产安全性也较差。 如2009年， 刘迎秋等人采用纸 片法研究了桦褐孔菌的水、 甲醇、 丙酮、 氯仿、 石。
8、油醚提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 的抑制作用， 发现桦褐孔菌各提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作 用。 2009年， 方熹君等人研究表明， 在1040mg/mL的浓度范围内， 虎奶菇发酵液不同组分的 抑菌作用大小依次为正丁醇萃取物乙酸乙酯萃取物萃余发酵液， 正己烷萃取物无活 性。 2010年， 陈敬华等人申请的 “具有抑菌活性的竹荪子实体提取物及其应用” (申请号 201010578196.4)， 长裙竹荪子实体经过粉粹， 过筛， 分别依次用石油醚、 乙醚、 乙酸乙酯、 无 水乙醇、 甲醇经索氏提取器提取， 提取液分别减压浓缩至干， 得到各溶剂提取物， 各提取液 对常见致。
9、病、 致腐微生物有较好的抑制作用。 0005 本发明涉及的松木层孔菌(Phellinus pini)， 又名松针层孔菌、 松白腐菌、 黄芝、 松黄灵、 红缘树舌、 松生层孔、 红缘层孔菌， 隶属于担子菌门、 伞菌纲， 锈革孔菌目 (Hymenochaetales)， 锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)， 木层孔菌属(Phellinus)， 是一种能 引起树材腐朽的白腐真菌， 主要寄生于云杉、 落叶松等针叶树活立木上， 集中产地在东北、 华北、 西北、 西南等原始森林地区。 已有研究表明松木层孔菌在抑制肿瘤、 治疗肝炎、 提高免 疫力、 降血糖、 抗氧化等方面显示了较强的功效。 但尚。
10、未发现松木层孔菌及其提取物在防腐 说 明 书 1/6 页 3 CN 105077510 B 3 抑菌方面的报道。 0006 超临界流体萃取(supercritical fluid extraction， 简称SFE),是近几十年发展 起来的一种新兴分离技术， 与传统的化学溶剂萃取法相比， 具有无化学溶剂消耗和残留、 无 污染、 利于热敏物质萃取和产物的生物活性保留高等特点。 0007 本发明通过超临界萃取， 得到的松木层孔菌提取物对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌 和枯草芽孢杆菌均显示了较好的抑菌效果， 工艺和制备过程安全， 不涉及有毒有害溶剂， 是 一种良好的天然抑菌剂， 同时可能还兼有松木层孔菌。
11、原有的增强免疫和抗癌等功效。 (三)发明内容 0008 本发明目的是提供一种从松木层孔菌中超临界萃取得到的天然抑菌剂， 具有使用 安全性高的特点， 对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有抑菌性， 且超临界萃取 是非极性， 可用于油脂类的抑菌剂， 以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。 0009 本发明采用的技术方案是： 0010 本发明提供一种松木层孔菌超临界萃取物作为抑菌剂的应用， 所述超临界萃取物 是将松木层孔菌子实体进行超临界CO2萃取获得的萃取物， 所述超临界萃取条件为： 以CO2为 超临流体， 萃取压力为2040MPa， 时间13h， 温度30-50， CO2流速为1020g/mi。
12、n。 通 常得到的萃取物呈浸膏状。 0011 进一步， 所述松木层孔菌子实体在萃取前先粉碎， 过2040目筛， 4060干燥， 获得松木层孔菌子实体粉末； 然后将粉末加入CO2超临界萃取仪的萃取釜进行CO2超临界萃 取。 0012 进一步， 优选所述萃取压力为3040MPa， 时间23h， 温度30-50， CO2流速为 1520g/min。 0013 本发明所述抑菌剂为大肠杆菌抑菌剂、 金黄色葡萄球菌抑菌剂或枯草芽孢杆菌抑 菌剂。 0014 本发明所述超临界萃取物对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为 2.5mg/mL， 对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL。 0015 本发。
13、明所述松木层孔菌(Phellinus pini)子实体， 又名松针层孔菌、 松白腐菌、 黄 芝、 松黄灵、 红缘树舌、 松生层孔、 红缘层孔菌， 隶属于担子菌门、 伞菌纲， 锈革孔菌目 (Hymenochaetales)， 锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)， 木层孔菌属(Phellinus)， 是一种能 引起树材腐朽的白腐真菌， 主要寄生于云杉、 落叶松等针叶树活立木上， 集中产地在东北、 华北、 西北、 西南等原始森林地区。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果主要体现在： 本发明对松木层孔菌进行安全 性高的超临界CO2萃取， 测定发现该提取物对大肠杆菌、 金黄色葡萄球。
14、菌和枯草芽孢杆菌等 几种食品常见细菌均有较好的抑制效果； 本发明所述超临界萃取物对大肠杆菌或金黄色葡 萄球菌的最低抑菌浓度为2.5mg/mL， 对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL； 由于 超临界萃取物是非极性， 可用于油脂类的抑菌剂， 以期应用于食品的防腐和贮藏保鲜。 (四)具体实施方式 0017 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 说 明 书 2/6 页 4 CN 105077510 B 4 此： 0018 实施例1： 0019 (1)松木层孔菌萃取物 0020 松木层孔菌子实体剪碎至0.3-0.6cm3的小块机械粉碎过30目筛50干燥 称。
15、取180gCO2超临界萃取(超临界萃取仪： 美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP， 美 国Thar科技公司有限公司)， 萃取压力为30MPa， 时间2h， 温度40， CO2流速为15g/min收 集分离釜中棕色油状萃取物称重为1.56g， 得率0.87抑菌测定松木层孔菌抑制剂。 0021 (2)松木层孔菌萃取物性能 0022 1.供试菌株： 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌菌株， 由浙江工业大学生 物与环境工程学院微生物实验室提供， 样本在该实验室贮藏。 0023 2.实验方法 0024 2.1供试菌株的制备： 0025 将所有供试菌种移接入营养琼脂试管斜面培养基上， 每种菌种。
16、接多支重复。 并将 接种有大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌的斜面培养基置于37生化培养箱培养 24h。 每种菌种取2支供试验用， 其余冷藏备用。 0026 2.2菌悬液的制备 0027 挑取各菌落接种营养琼脂培养基平皿， 三种供试菌均培养24h， 用无菌生理盐水洗 脱， 分别制成含菌约107CFU/mL的菌悬液。 0028 具体制备方法： 分别挑取少量细菌孢子至无菌生理盐水中洗出玻璃珠打散制 成菌悬液调菌悬液浓度为107CFU/mL， 备用。 0029 2.3营养琼脂培养基平板制备： 营养琼脂培养基3.2g， 加水100ml， pH自然。 0030 营养琼脂培养基主要成分(g/L)：。
17、 蛋白胨10.0； 牛肉浸出粉5.0； 氯化钠5.0； 琼脂 12.0， pH7.30.1(25)。 0031 配制好的培养基， 121湿热灭菌30min后， 冷却至50-60， 无菌操作倾注于干热 灭菌的培养皿内， 每皿15-20mL。 0032 2.4最低抑菌浓度(MIC)测定 0033 分别取步骤(1)制备的松木层孔菌超临界萃取物， 加已灭菌的二甲基亚砜 (DMSO)配制成一定梯度的稀释液(稀释浓度分别为10mg/mL， 5mg/mL， 2.5mg/mL， 1.25/mL)作 为抑菌原液； 并另取一支不加药品(即松木层孔菌超临界萃取物)的空白液体培养基作为对 照样品(用等量二甲基亚砜代替。
18、松木层孔菌超临界萃取物)。 0034 用移液枪移取10 L的菌悬液(107CFU/mL)至营养琼脂培养基平板表面， 用三角 涂布棒将其涂布均匀； 0035 用移液枪分别移取不同浓度的抑菌原液6 L至各个营养琼脂培养基平板表面， 在37下培养24h， 之后观察各浓度平板的抑菌情况， 其中未长菌落平板的最低浓度即为最 低抑菌浓度(MIC)， 结果见表1所示。 0036 表1松木层孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度 说 明 书 3/6 页 5 CN 105077510 B 5 0037 0038 注：“+” 表示有菌落，“-” 表示未见菌落。 0039 2.5抑菌圈法测定抑菌活性 0040 称取步骤(1)。
19、松木层孔菌超临界萃取物样品100mg， 用二甲基亚砜(DMSO)溶解， 配制成10.0mg/mL的样品溶液； 0041 取干净的小试管， 编号， 将样品溶液置于其中； 0042 将高压灭菌后的培养基， 培养皿， 滤纸片等实验所需物品， 放进超净工作台， 打 开紫外灭菌30min； 0043 倒营养琼脂培养基平板， 移液枪分别移取三种供试菌菌悬液(107CFU/mL)20 L， 打入营养琼脂培养基平板内， 无菌条件下用三角涂布棒将菌液涂布均匀； 以2.0mg/mL的链 霉素DMSO溶液为阳性对照。 0044 取灭菌后的两片滤纸片， 置于培养基表面， 分别用移液枪移取6 L样品溶液于其 中一片滤纸。
20、片上， 移取相同剂量二甲基亚砜于第二片滤纸片上做阴性对照； 0045 在37恒温培养箱放置24h左右， 用数显游标卡尺测量抑菌圈的直径， 每组实验 重复3次， 结果见表2。 0046 表2松木层孔菌超临界萃取物抑菌圈直径 0047 0048 0049 2.6松木层孔菌超临界萃取物抑菌率的测定 0050 称取步骤(1)的松木层孔菌超临界萃取物样品100mg， 用二甲基亚砜(DMSO)溶解， 配制成5mg/mL的样品溶液； 0051 采用三点接种法， 在涂布有三种供试菌菌悬液的营养琼脂培养基平板上放置3片 灭菌后的滤纸片， 用移液枪分别移取5.0mg/mL的样品溶液6 L， 2mg/mL氨苄青霉素。
21、钠水溶液 6 L和2mg/mL二甲基亚矾水溶液6 L， 分别滴加在三片滤纸片上， 每个实验设置3次重复， 阳 性对照为： 2mg/mL氨苄青霉素钠水溶液； 阴性对照： 2mg/mL二甲基亚砜水溶液。 将以上平板 均倒置于37恒温培养箱中培养24h后， 测量三个抑菌圈的直径， 并求平均值作为抑菌实验 的结果。 同样条件下， 测试10.0mg/mL样品溶液在涂布三种供试菌菌悬液的平板上的抑菌 率， 具体抑菌率结果见表3。 说 明 书 4/6 页 6 CN 105077510 B 6 0052 以上细菌培养和抑菌操作时的加样和加料操作均在在超净工作台中进行。 0053 抑制率(供试品抑菌圈直径-阴性。
22、对照抑菌圈直径)/阳性对照抑菌圈直径 100 0054 表3松木层孔菌超临界萃取物抑菌率 0055 0056 实施例2： 0057 松木层孔菌子实体剪碎至0.3-0.6cm3的小块机械粉碎过40目筛60干燥 称取190gCO2超临界萃取(超临界萃取仪： 美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP， 美 国Thar科技公司有限公司)， 萃取压力为40MPa， 时间3h， 温度50， CO2流速为20g/min收 集分离釜中棕色油状萃取物称重为1.85g， 得率0.97抑菌测定松木层孔菌抑制剂， 抑菌效果如表4和表5。 0058 表4松木层孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度 0059 0060 注：“+。
23、” 表示有菌落，“-” 表示未见菌落。 0061 由表4可见， 松木层孔菌的超临界提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑 菌浓度为2.5mg/mL， 对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度均为5.0mg/mL。 0062 表5松木层孔菌超临界萃取物抑菌率 0063 0064 从表5可以看出， 松木层孔菌超临界萃取物对3种实验细菌均有较好的抑制效果， 其中对大肠杆菌的抑菌效果最好， 10.0mg/mL时的抑菌率达86.6。 0065 上述实验结果表明， 松木层孔菌超临界萃取物对常见的3种食品腐败菌均有一定 的抑制作用， 可将本发明成果应用于食品防腐保鲜等领域。 0066 对比实施例1松木层孔菌水提取 0。
24、067 松木层孔菌子实体剪碎至0.3-0.6cm3的小块机械粉碎过30目筛50干燥 称取50g加入20倍重量的水， 加热沸腾提取索氏抽滤得过滤液55旋转蒸发浓缩 冷冻干燥松木层孔菌水提物， 称重为2.05g， 得率4.1抑菌测定。 0068 表6松木层孔菌水提物最低抑菌浓度 说 明 书 5/6 页 7 CN 105077510 B 7 0069 0070 注：“+” 表示有菌落，“-” 表示未见菌落。 0071 由表6可见， 在实验浓度范围内， 松木层孔菌水提物对枯草芽孢杆菌没有抑制效 果， 对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为10mg/mL， 对大肠杆菌的最低抑菌浓度为20mg/mL， 相比表1。
25、的超临界萃取物抑菌效果要差很多。 0072 对比例2桑黄(鲍氏针层孔菌)超临界萃取物 0073 桑黄子实体剪碎至0.3-0.6cm3的小块机械粉碎过30目筛50干燥称取 180gCO2超临界萃取(超临界萃取仪： 美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP， 美国Thar 科技公司有限公司)， 萃取压力为30MPa， 时间2h， 温度40， CO2流速为15g/min收集分离 釜中黄色油状萃取物称重为1.88g， 得率1.04抑菌测定。 0074 表7桑黄超临界萃取物最低抑菌浓度 0075 0076 注：“+” 表示有菌落，“-” 表示未见菌落。 0077 由表7可见， 因萃取物浓度在20mg/。
26、mL已达最大溶解浓度左右， 在实验浓度范围内， 桑黄超临界萃取物对三种菌都没有抑制效果。 0078 对比例3桦褐孔菌超临界萃取物 0079 桦褐孔菌子实体剪碎至0.3-0.6cm3的小块机械粉碎过30目筛50干燥 称取180gCO2超临界萃取(超临界萃取仪： 美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP， 美国 Thar科技公司有限公司)， 萃取压力为30MPa， 时间2h， 温度40， CO2流速为15g/min收集 分离釜中黄色油状萃取物称重为1.12g， 得率0.62抑菌测定。 0080 表7桦褐孔菌超临界萃取物最低抑菌浓度 0081 0082 注：“+” 表示有菌落，“-” 表示未见菌落。 0083 由表7可见， 在实验浓度范围内， 桦褐孔菌超临界萃取物对枯草芽孢杆菌和金黄色 葡萄球菌均没有抑制效果， 而对大肠杆菌的最低抑菌浓度为20mg/mL， 相比表1的松木层孔 菌超临界萃取物抑菌效果要差很多。 说 明 书 6/6 页 8 CN 105077510 B 8 。