发明领域
奶和奶相关制品是人类营养的重要部分。奶制品含有多种可被人体消 耗的营养，以增进健康和辅助生长。奶或奶相关制品白的程度(“白度 (whiteness)”)会影响对其味道和口感的感觉。白度对于例如奶酪、黄 油、奶粉或乳清制品有着重要的作用。例如，白度被认为是奶酪所需要 的，例如Feta、Mozzarella、Ricotta和蓝奶酪所需要的。其中山羊或绵羊 奶至少部分被牛奶所替代的奶酪较为不白，因为牛奶中存在β-胡萝卜素。
对一些奶酪而言，天然着色剂例如胭脂红或β-胡萝卜素被用作为食品 着色剂。但是，该着色剂还将存在于乳清中。因此，经过加工的乳清制品 (例如婴儿配方)的颜色会是人们所不想要的。
若干种方法被用于使奶或奶相关制品变白。
二氧化钛(TiO2)是无机惰性颜料，其被用于糖果、香口胶、牙膏 等，已被FDA认可为食品级的。将TiO2以0.02至0.05％的浓度加入奶酪 奶(cheese milk)中，其浓度取决于牛奶的种类和时令(S.Laakso&E-M Lilius.，J.Agric.Food Chem.，1982，30，9130916)。水牛奶(Buffalo milk) 通常被用于制作Mozzarella奶酪。但是，其远不能达到目前对Mozzarella 的需求，因此水牛奶至少部分要被牛奶所取代。但是，水牛奶不含β-胡萝 卜素，与牛奶相反。加入预定量的TiO2，不会影响到奶酪的味道和结构。 但是，已有报道，加入TiO2后，Feta奶酪会发展出异味(F.Kosikowski& D.P.Brown.J.Dairy Sci.52，No.7968-970)。
另一种使奶或奶相关制品变白的方法包括使用过氧化苯甲酰。该试剂 被用于生产Mozzarella、蓝奶酪和某些意大利式的奶酪(F.Statens& Hilleroed.，Beret.-Statens Forsoegsmejiri.，1978，232，36)，以0.001- 0.002％的浓度使用。该方法很耗时间，因为通常从奶酪奶中分离出奶油， 用该试剂在63℃下对其进行45-120分钟的处理。过氧化物是高度易燃 的，并且应避免其与皮肤接触。过氧化苯甲酰还用于漂白蜡、肥皂、脂肪 (包括牛奶中的脂肪)以及面包。过氧化苯甲酰破坏β-胡萝卜素，破坏程 度使得需要随后向奶酪奶或奶酪中补充维生素A。此外，其还可能会产生 异味。
叶绿素使奶酪变白的用途也已有描述(F.Statens&Hilleroed.，Beret.- Statens Forsoegsmejiri.，1978，232，36)。叶绿素吸收beta-胡萝卜素的黄 色，使得奶酪被完全脱色。叶绿素的剂量是关键的；叶绿素稍微过量导致 奶酪呈现不想要的绿色。奶酪生产期间剂量是很关键的问题，这使得叶绿 素的使用不具有吸引力。此外，还已提出了关于叶绿素对人体长期影响的 问题。
其它用于使奶酪变白的方法是工艺相关的。对奶酪奶或其分离出的奶 油进行微流态化(microfluidization)，使得Cheddar奶酪具有更白的外 观。但是，奶酪产量，以及凝乳中脂肪和水的保持力，和伴随地，奶酪结 构都会受到影响(A.Lemay et al.，J.Dairy Science，1994，77：2870-2879)。 在另一种方法中，对分离出的黄油进行热处理，以破坏β-胡萝卜素。但 是，该种处理可能会导致毒性氧固醇产生(J.H.Nielsen et al.，1996，63， 615-621)。为克服上述问题，本发明公开了脂氧合酶用于漂白奶制品或使 其变白的用途。
发明内容
因此，本发明提供了漂白奶制品或使其变白的方法，所述方法包括将 脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)加入奶制品或包括进奶制品中。本发明还 提供了LOX用于漂白奶制品的用途。本发明进一步提供了被LOX漂白或 通过本发明的方法漂白的奶制品以及包含LOX的奶制品。
发明详述
本发明基于如下令人惊奇的发现：仅有少数脂氧合酶对于奶制品具有 使其变白的作用，所述奶制品例如是奶、奶酪、黄油、奶油、乳清制品。 奶制品是含有至少10w/w％奶(优选是牛奶)成分的制品，优选至少30 w/w％，更优选至少50w/w％，进一步更优选至少70w/w％，或者最优选 至少80w/w％，上述含量基于固体干物质。奶成分例如是脂肪、蛋白质 等。如上文所述，奶，尤其是牛奶，可能天然含有着色化合物，例如β-胡 萝卜素。通过脂氧合酶进行漂白的机制基于如下原理：脂氧合酶和亚油 (麻)酸的反应产生的自由基使得β-胡萝卜素(或其它类胡萝卜素或其它 具有双键的化合物)中的双键发生氧化转变。
相对地，本发明的用酶漂白的方法不会导致可能影响经处理的奶制品 口感的异味。脂氧合酶在奶制品中的漂白效果是特别出人意料的，因为该 酶存在于水相中，而脂肪酸却以奶制品脂肪颗粒的形式存在。此外，牛奶 中存在的beta-胡萝卜素也存在于脂肪相中。
可以使用商业途径可获得的脂氧合酶。大豆是公知的脂氧合酶的来 源。其它合适的来源包括小麦种类(例如硬质小麦)、豌豆、胡豆(faba bean)、水稻和小扁豆。还可以通过发酵来制造脂氧合酶。B.Knust (1990)Proc.15th fermentively Int.Conf.Yeast.Gen Mol.Biol.p.S429描述 了烘焙酵母用于生产豆类脂氧合酶的用途。此外，WO 02/20730描述了通 过真菌Gaeumannomyces graminis对脂氧合酶的生产、从该生物中鉴定出 编码脂氧合酶的基因、以及试图在多种微生物宿主中生产功能性蛋白质的 方法。大豆来源的脂氧合酶已被用于对小麦和玉米面粉进行漂白，或者其 它类似的应用，例如面条(见，例如JP61257158、JP53024039、 JP56131358、JP53062946)，但其用于漂白奶酪的用途没有被描述过。
因此，可以使用来自动物(优选来自哺乳动物)、植物或微生物的脂 氧合酶。优选地，植物或微生物LOX被用于本发明的方法。最优选地， 使用来自大豆的LOX，例如LOX I-B。
有利地，在奶酪制作过程开始前，或任何其它的奶转化或分离过程开 始之前，将脂氧合酶加入到奶中。脂氧合酶还可以在稍后的阶段加入，例 如，在奶酪制作期间，例如与凝乳酶同时加入。或者，可在奶酪制作完成 之后将脂氧合酶加入到奶酪上。此外，脂氧合酶可加入到乳清或从乳清获 得的制品中，例如，乳清蛋白质或乳清水解产物。
应当理解，本领域的技术人员可以容易地确定使奶制品变白所需的 LOX的量。通常，使用每克奶制品10至1000个单位的LOX，优选地， 每克奶制品50至500个单位的LOX来漂白奶制品。
实施例1测定脂氧合酶活件
来自大豆的脂氧合酶催化含有cis，cis-1，4-戊二烯结构的脂类(例如亚 油酸)的氧化。LOX活性在pH 9.0时，25℃下，用亚油酸作为底物时被 测定。一个单位的LOX能使得234nm处(1cm路径长度)每分钟的吸收 增加0.001。
实施例2制备脂氧合酶
脂氧合酶从Sigma获得。或者，从大豆乳清水(获得自Protein Technology International(leper，Belgium))来制备脂氧合酶。在Z-2000滤板 上进行固/液分离，接着在Z-200 Schenk滤板上进行灭菌过滤。这样得到了 清澈的大豆乳清水制剂，随后在pH 8.2下，10kD膜上进行超滤。最终制 剂含有至少6500或更多个单位的脂氧合酶，精确数量随大豆乳清批次有 所变动。
实施例3制备微型奶酪
按照Shakeel-Ur-Rehman et al.(Protocol for the manufacture of miniature cheeses in Lait，78(1998)，607-620)所述来制备微型奶酪。通过在63℃加 热30分钟来对粗制牛奶进行巴氏灭菌。经过巴氏灭菌的奶被转移到阔口 塑料离心瓶(每瓶200mL)中，冷却至31℃。随后，向每瓶离心瓶中 200ml经过灭菌的牛奶中，加入0.72ml DS 5LT1发酵菌种培养物(starter culture)(DSM Gist B.V.，Delft，The netherlands)，使奶熟化20分钟。然 后，加入CaCl2(每200ml经过熟化的牛奶中，132μL的1mol.L-1溶 液)，接着加入凝结剂(每ml 0.04IMCU)。在某些情况下，脂氧合酶和 凝结剂共同加入。奶溶液在31℃保持40-50分钟，直到形成凝结物。通过 拉伸金属丝(stretched wire)制成的切割器(框上间隔为1cm)，对凝结 物进行手工切割。进行2分钟的恢复(healing)，然后轻轻搅拌10分钟。 之后，在对凝乳/乳清混合物进行连续搅拌的条件下，将温度在超过30分 钟的期间逐渐升至39℃。pH达到6.2之后，在室温于1700g对凝乳/乳清 混合物进行60分钟的离心。排掉乳清，将凝乳保持于36℃的水浴中。每 15分钟对奶酪进行颠倒，直到pH降至5.2-5.3，然后在室温于1700g进行 20分钟的离心。再次排掉乳清后，用盐水(20％NaCl、0.05％ CaCl2·2H2O)对微型奶酪进行30分钟的处理，贮藏于12℃，直到通过 视觉观察或按照实施例4中所述来对奶酪颜色进行测定。
实施例4测定奶酪颜色以及漂白
在颜色扫描仪(Hewlett Packard Scanjet ADF)上对微型奶酪进行扫 描，用程序LabSMART(LabSMART，LLC，Logan Utah，USA)进行分析。 用三个参数对颜色进行定量：L-因子(黑＝0至白＝100)、a因子(绿＝- 60至红＝+60)和b因子(蓝＝-60至黄＝+60)。漂白或变白的意思是L 分量增加一个单位或更多，优选为2个单位或更多。此外，通过关于白度 的比较试验(对照与实验相比)，通过视觉对奶酪进行评估。
实施例5用脂氧合酶(LOX)漂白奶酪
按照实施例3所述制备微型奶酪，其中，奶酪与β-胡萝卜素酪蛋白乳 剂(将5gβ-胡萝卜素(DSM)与25g牛奶脂肪(AVEVE)在50-60℃混合； 取25ml加入到50ml 0.1％酪蛋白钠溶液中，用Ultraturrax搅拌机猛烈混 合。将10ml该β-胡萝卜素溶液加入到200ml奶酪奶中)混合。加入 LOX(84U/ml奶酪奶)；在对照实验中加入经过热失活的LOX。LOX来 自Sigma(Sigma LOX I-B，被称为LOX Sigma，几乎无色)。通过视觉观 察来检测漂白情况，结果展示于下表1中。 奶酪添加剂 奶酪颜色 无添加剂 ++ LOX Sigma + LOX Sigma(经失活的) ++
表1.LOX处理过的奶酪颜色。+：几乎无色，++：对照奶酪的颜 色，+++：比没有添加剂的对照奶酪的颜色更深的颜色。
结果清楚地显示，Sigma LOX能漂白奶酪的颜色。
实施例6通过直接应用LOX漂白奶酪
用Sigma LOX(100μl贮液，含有168U/μl)直接在商业途径可获得 的Gouda奶酪片(大约2mm厚)上点上小点，在30℃培育一小时。在对 照实验中，用水来代替LOX。一小时后，按照实施例4所述，对奶酪片上 经过处理的点进行测定。用Sigma-LOX处理过的奶酪的L值略微高于用 水处理的奶酪的L值(L＝83相对于L＝82)。其都高于未经处理的奶酪 的L值(L＝81)，这表明，两种处理都能漂白，该结果得到了视觉观察 的验证。数据表明，用水进行处理能使奶酪漂白，这是β-胡萝卜素和 Anatto(Gouda奶酪中常见的着色剂)被萃取出来的结果，这是公知的现 象。此外，用LOX进行处理得到了更强的脱色效果，说明LOX处理能对 黄色进行漂白。
实施例7用脂氧合酶对乳清进行处理
乳清从微型奶酪实验中获得，并加入了Anatto(DSM)(2μl/100ml 乳清)。加入Sigma LOX溶液(84U/ml乳清)，在30℃对样品进行20 小时的培养。对照实验中，加入水或热失活的Sigma LOX。然后在0.2μm 的过滤器上对样品进行过滤，之后在460nm处对颜色强度进行测定。较 之加入水或热失活的乳清(吸收值分别为0.090和0.092)，用LOX处理 过的乳清具有明显更低的吸收值(A＝0.0045)。LOX处理使得乳清颜色 明显减弱。