一种改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102577948 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102577948 A *CN102577948A* (21)申请号 201210025667.8 (22)申请日 2012.02.07 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 张宁 吴殿星 舒小丽 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 韩介梅 (54) 发明名称 一种改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法 (57) 摘要 本发明涉及一种改良抗性淀粉含量的水稻的 培育方法， 。

2、步骤包括 ： 取直链淀粉含量 25% 以上 水稻品种的成熟胚为外植体， 诱导愈伤组织， 继代 培养至成倍增殖期， 暗条件预培养， 进行农杆菌共 培养转化， 转移到筛选培养基进行 3 轮筛选， 取抗 性愈伤组织诱导分化成苗， 对抗性植株进行标记 基因组织化学染色和筛选基因分子检测， 鉴定含 目的基因淀粉合成酶ssIII-2插入序列的分化小 苗， 对入选的转基因植株进行热米饭的抗性淀粉 含量检测， 选留抗性淀粉含量高于 10% 的转基因 植株， 继续种植评价抗性淀粉含量的表达稳定性， 繁殖抗性淀粉含量稳定高于 10% 的优良株系。本 发明的改良抗性淀粉含量的水稻， 对糖尿病人群 实施饮食疗法具有重。

3、要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法， 包括以下步骤 ： 1）取直链淀粉含量 25% 以上水稻品种的成熟胚为外植体， 接种至诱导培养基， 在 251、 光强 3000 勒克司光条件下诱导形成愈伤组织 ； 2） 将诱导形成 2 周的愈伤组织， 转移至继代培养基， 继代培养至愈伤组织进入成倍增 殖期 ； 3） 将成倍增殖的愈伤组织， 在 251避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养 。

4、2 天 ； 4） 将经过预培养的愈伤组织， 在农杆菌悬浮液中浸泡 10 分钟， 之后弃去菌液， 用无菌 滤纸吸干， 接种于共培养基上， 在 251避光的黑暗条件下共培养 2 天 ； 5） 将上述共培养愈伤组织， 洗净、 晾干后， 转移到筛选培养基， 在 251避光的黑暗条 件下培养 6 周， 收集新长出的抗性愈伤组织， 转移至新的筛选培养基上， 再进行连续 2 轮继 代筛选， 每隔 3 周转继次 ； 6）取 3 轮筛选后的抗性愈伤组织， 转移至分化培养基， 在 251、 光强 3000 勒克 司光条件下诱导分化成苗， 对抗性植株进行组织化学染色和分子检测， 选留含目的基因插 入序列的的转基因植。

5、株， 所说的目的基因插入序列是指目的基因可溶性淀粉合成酶基因 ssIII-2、 标记基因葡糖苷酸酶基因 GUS 和筛选基因抗潮霉素基因 HPT 的插入序列， 目的基 因可溶性淀粉合成酶基因 ssIII-2 片段长 780bp ； 7） 取入选的转基因植株， 田间种植后收获种子， 测定热米饭的抗性淀粉含量， 选留抗性 淀粉含量高于 10% 的转基因植株 ； 8） 继续种植步骤 7） 筛选的转基因株系， 评价抗性淀粉含量的表达稳定性， 繁殖抗性淀 粉含量稳定高于 10% 的优良株系， 为培育的改良抗性淀粉含量的水稻。 2. 根据权利要求 1 所述的改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法， 其特征在于所说。

6、的 诱导培养基为 N6 基本培养基添加 2,4-D1.5mg、 蔗糖 30g 和琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 3. 根据权利要求 1 所述的改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法， 其特征在于所说的 继代培养基为 N6 基本培养基添加 2,4-D 1mg、 蔗糖 30g 和琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 4. 根据权利要求 1 所述的改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法， 其特征在于所说的 共培养基为 N6 基本培养基添加 2,4-D 0.5mg、 乙酰丁香酮 1mg、 蔗糖 30g、 和琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 5. 根据权利要求 1 所述的改良抗性淀粉含量。

7、的水稻的培育方法， 其特征在于所说的 筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、 潮霉素30mg、 羧卞300 mg、 蔗糖30g和琼脂 粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 6. 根据权利要求 1 所述的改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法， 其特征在于所说的 分化培养基为 N6 基本培养基添加 6-BA1mg、 NAA0.5mg、 KT0.5mg、 羧卞 200mg、 蔗糖 30g 和琼 脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 7. 根据权利要求 2-6 所述的改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法， 其特征在于所说 的 N6 基本培养基为 KNO3 2830mg、 (NH4)2SO。

8、4 463mg、 CaCl22H2O 166mg、 MgSO47H2O 185mg、 KH2P04 400mg、 MnSO44H2O 4.4mg、 ZnSO47H2O 1.5mg、 FeSO47H2O 27.8mg、 Na2-EDTA2H2O 37.3mg、 H3BO3 1.6mg、 肌醇 100mg、 烟酸 0.5mg、 维生素 B6 0.5mg、 维生素 B1 0.5mg 和甘氨酸 2mg。 权 利 要 求 书 CN 102577948 A 2 1/3 页 3 一种改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法 技术领域 0001 本发明涉及一种水稻的培育方法， 尤其是改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法。。

9、 背景技术 0002 据卫生部的统计， 2010 年我国糖尿患者约 9200 万人， 占我国总人口的 9.3%， 耐糖 量低人群更是高达 1.42 亿人。 0003 糖尿病等血液系统慢性疾病正在呈现出快速增长、 向农村蔓延、 低龄化的演变趋 势， 越来越严重地影响着人类社会的生存和发展 （第一大生命杀手， 严重影响生命质量， 年 医疗费用高达千亿元） ， 而且目前尚无根治之法。 0004 医学研究表明 ： 除遗传因素外， 糖尿病等血液系统慢性疾病主要起因于日常饮食 起居等生活习惯， 而高糖、 高脂肪、 高蛋白的饮食结构则是罪魁祸首， 尤其是高糖这一 “元 凶” 。稻米主食 “高糖” 的核心在于。

10、可消化淀粉的比例过高 （导致贪食、 肥胖和高血糖） ， 而抗 性淀粉的比例过低 （目前一般籼稻米的抗性淀粉含量仅为 1%， 粳稻的含量仅有 0.1%， 而达 到现代人健康需求的含量应为 10%） 。 0005 因此， 依照我国传统 “药食同源” 、“寓药于食” 的理念， 预防糖尿病等高危慢性病 的发生， 改进病患者生活质量的重要途径是改善一日三餐的大米营养构成， 而培育满足人 们健康需求的美味口感与功能性水稻品种则是这一途径的根本。 高抗性淀粉含量专用水稻 品种选育与开发是吃出健康的关键和核心。抗性淀粉的形成， 不但与水稻本身的直连淀粉 含量直接有关， 也与支链淀粉的链长结构密切相关， 同时与。

11、淀粉晶体结构相关。 可溶性淀粉 合成酶基因ssIII-2， 在支链淀粉合成过程中具有特定的功能， 主要负责支链淀粉中等长度 支链的合成， 对分支链短链的延伸， 中长链的合成起明显作用， 促进晶体层的形成并影响着 淀粉的晶体模式。 发明内容 0006 正是在上述背景下， 本发明的目的是提出一种改良抗性淀粉含量的水稻的培育方 法， 以获得高抗性淀粉含量水稻， 实施饮食疗法从源头预防和控制糖尿病。 0007 本发明的改良抗性淀粉含量的水稻的培育方法， 包括以下步骤 ： 1）取直链淀粉含量 25% 以上水稻品种的成熟胚为外植体， 接种至诱导培养基， 在 251、 光强 3000 勒克司光条件下诱导形成。

12、愈伤组织 ； 2） 将诱导形成 2 周的愈伤组织， 转移至继代培养基， 继代培养至愈伤组织进入成倍增 殖期 ； 3） 将成倍增殖的愈伤组织， 在 251避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养 2 天 ； 4） 将经过预培养的愈伤组织， 在农杆菌悬浮液中浸泡 10 分钟， 之后弃去菌液， 用无菌 滤纸吸干， 接种于共培养基上， 在 251避光的黑暗条件下共培养 2 天 ； 5） 将上述共培养愈伤组织， 洗净、 晾干后， 转移到筛选培养基， 在 251避光的黑暗条 说 明 书 CN 102577948 A 3 2/3 页 4 件下培养 6 周， 收集新长出的抗性愈伤组织， 转移至新的筛选培养基上。

13、， 再进行连续 2 轮继 代筛选， 每隔 3 周转继次 ； 6）取 3 轮筛选后的抗性愈伤组织， 转移至分化培养基， 在 251、 光强 3000 勒克 司光条件下诱导分化成苗， 对抗性植株进行组织化学染色和分子检测， 选留含目的基因插 入序列的的转基因植株， 所说的目的基因插入序列是指目的基因可溶性淀粉合成酶基因 ssIII-2、 标记基因葡糖苷酸酶基因 GUS 和筛选基因抗潮霉素基因 HPT 的插入序列， 目的基 因可溶性淀粉合成酶基因 ssIII-2 片段长 780bp ； 7） 取入选的转基因植株， 田间种植后收获种子， 测定热米饭的抗性淀粉含量， 选留抗性 淀粉含量高于 10% 的转。

14、基因植株 ； 8） 继续种植步骤 7） 筛选的转基因株系， 评价抗性淀粉含量的表达稳定性， 繁殖抗性淀 粉含量稳定高于 10% 的优良株系， 为培育的改良抗性淀粉含量的水稻。 0008 本发明中， 所说的诱导培养基为 N6 基本培养基添加 2,4-D1.5mg、 蔗糖 30g 和琼脂 粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0009 本发明中， 所说的继代培养基为 N6 基本培养基添加 2,4-D 1mg 蔗糖 30g 和琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0010 本发明中， 所说的共培养基为 N6 基本培养基添加 2,4-D 0.5mg、 乙酰丁香酮 1mg、 蔗糖 30g 和琼脂。

15、粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0011 本发明中， 所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、 潮霉素30mg、 羧 卞 300 mg、 蔗糖 30g 和琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0012 本发明中， 所说的分化培养基为 N6 基本培养基添加 6-BA1mg、 NAA0.5mg、 KT0.5mg、 羧卞 200mg、 蔗糖 30g 和琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0013 上述的 N6 基本培养基为 KNO3 2830mg、 (NH4)2SO4 463mg、 CaCl22H2O 166mg、 MgSO47H2O 185mg、 KH2P。

16、04 400mg、 MnSO44H2O 4.4mg、 ZnSO47H2O 1.5mg、 FeSO47H2O 27.8mg、 Na2-EDTA2H2O 37.3mg、 H3BO3 1.6mg、 肌醇 100mg、 烟酸 0.5mg、 维生素 B6 0.5mg、 维生素 B1 0.5mg 和甘氨酸 2mg。 0014 本发明中， 所说的农杆菌的菌株为EHA105， 内含质粒pCAM1305， pCAM1305的T-DNA 区域携带目的基因插入序列， 包括目的基因可溶性淀粉合成酶基因ssIII-2、 标记基因葡糖 苷酸酶基因 GUS 和筛选基因抗潮霉素基因 HPT。目的基因可溶性淀粉合成酶基因ssI。

17、II-2 片段长 780bp， 与玉米启动子 Ubi-1 和 nos 终止子共同构成表达框架。菌株为 EHA10 方便购 买或赠送获得， 在一般植物遗传实验室均有保存， 参见文献吴关庭等， 中国农业科学， 2005， 38(12) ： 2395-2402。 0015 上述的标记基因葡糖苷酸酶基因GUS的组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989, (6): 168-169， 筛选基因抗潮霉素基因HPT的分子检 测方法参见文献吴关庭等， 中国农业科学， 2005， 38(12) ： 2395-2402。 0016 本发明中， 。

18、所说的抗性淀粉含量检测方法， 参见文献杨朝柱等， 中国水稻科学， 2005， 19(6): 516-520。 0017 上述的稳定性是指入选水稻中抗性淀粉含量在不同年份间 （2 年以上） 、 季节间 （2 季以上） 以及地点间 （2 个地点以上） 的含量变化不显著。 0018 本发明培育的改良抗性淀粉含量的水稻， 具有以下优点 ： 说 明 书 CN 102577948 A 4 3/3 页 5 本发明首先利用可溶性淀粉合成酶基因ssIII-2， 调控直链淀粉含量 25% 以上水稻的 支链淀粉的链长结构， 优化淀粉晶体结构， 培育出高抗性淀粉含量水稻。 这对糖尿病人群实 施饮食疗法具有重要意义。 。

19、附图说明 0019 图 1 是本发明所用的可溶性淀粉合成酶基因ssIII-2插入序列的载体构建示意 图。 具体实施方式 0020 以下通过具体实例进一步说明本发明。 0021 实施例 1 ： 以取直链淀粉含量 31.5% 水稻品种 R102 的成熟胚为外植体， 接种至诱导培养基， 在 251、 光强 3000 勒克斯光条件下诱导形成愈伤组织 ； 取诱导形成 2 周的愈伤组织， 转移至继代培养基， 继代培养至愈伤组织进入成倍增殖 期 ； 取成倍增殖的愈伤组织， 在 251、 避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养 2 天 ； 取经过预培养的愈伤组织 （约 300 个培养皿， 含 2000 块以。

20、上的愈伤组织） ， 在农杆菌悬 浮液中浸泡 10 分钟， 之后弃去菌液， 用无菌滤纸吸干， 接种于共培养基上， 在 251、 避光 的黑暗条件下共培养 2 天 ； 取上述共培养愈伤组织， 洗净、 晾干后， 转移到筛选培养基， 在 251、 避光的黑暗条 件下培养 6 周， 收集新长出的抗性愈伤组织 （约 250 块愈伤组织） ， 转移至新的筛选培养基 上， 再进行连续 2 轮继代筛选， 每隔 3 周转继次 ； 取 3 轮筛选后的抗性愈伤组织 （约 50 块愈伤组织） ， 转移至分化培养基， 在 251、 光 强 3000 勒克斯光条件下诱导分化成苗 61 株， 对抗性植株进行标记基因 GUS 。

21、组织化学染色 和筛选基因 HPT 分子检测， 选留含目的基因可溶性淀粉合成酶基因ssIII-2插入序列的转 基因植株 21 株 （目的基因插入序列的载体构建如图 1 所示） 。 0022 取入选的转基因植株， 田间种植后收获种子， 进行热米饭的抗性淀粉含量检测， 选 留抗性淀粉含量高于 10% 的转基因植株 5 株 ； 继续种植转基因株系 ； 2008-2010 连续 3 年， 分别在浙江杭州 （春季） 、 浙江富阳 （夏季） 、 海南陵水 （冬季） 三地 三季评价抗性淀粉含量的表达稳定性， 繁殖抗性淀粉含量稳定高于 10% 的优良株系， 最终 培育高抗性淀粉含量水稻 3 个， T-R102-1、 T-R102-2、 T-R102-3， 其抗性淀粉含量分别为 11.5%、 15.2%、 17.5%， 而原高直链淀粉含量水稻品种 R102 热米饭的抗性淀粉含量分别为 1.69%。 说 明 书 CN 102577948 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102577948 A 6 。