技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种适用于猪禽的发酵液体饲料及其 制备方法和应用，具体地说是涉及一种由多种有益微生物发酵而成的液 体饲料及其制备方法和应用。
背景技术
抗生素的滥用在养殖业中的弊端已凸现，进行绿色健康养殖，生产、 应用绿色安全饲料已成为一种趋势。发酵饲料因其是通过发酵消除抗营 养因子，提高采食量和营养物质的消化吸收率，提高动物的整体健康水 平，减少呼吸道和消化道的疾病发生率，降低氨和臭气的排放，改善生 态环境等，近几年备受青睐。发酵饲料的发酵方法有固体发酵法和液体 发酵法，但发酵出来的产品普遍存在质量低、杂菌污染严重、易变质、 使用效果不理想等缺陷，发酵方法本身也各有不足。如：专利CN1399905A 公开了一种猪循环饲料的制备方法，该方法将微量元素、氨基酸、饼粕 类等与固体微生物菌种一起混合于水泥砖石结构的发酵窖内，排出空气， 然后密封发酵10天以上，其弊端是发酵环境不可控，不能保证产品质量， 而且微生物在固相发酵中不能很好地附着于底物表面，繁殖重复性差， 且发酵周期长，发酵效果远低于液体发酵。专利CN1973661A公开了一 种液体发酵饲料的制备方法及其发酵设备，该法是配合好的饲料与培养 好的菌种一起进入发酵罐发酵，发酵好的饲料通过饲料输出管输送到喂 料区即可进行饲喂，该液体饲料发酵方法简单，现场操作，保证发酵饲 料的质量，但是设备投入比较大，在一般的养殖场很难实现。专利 CN1192328A公开了一种液体发酵饲料的制备方法，该法将发酵底物与发 酵菌分装入袋子密封，放置于恒温室中进行发酵，该法发酵时间短，分 成小份不易污染杂菌，但是由于发酵的过程是在袋中进行，发酵条件不 可调控，发酵产品质量参差不齐，而且发酵过程中易出现涨袋现象，不 易保存。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包含中草药、多种益生菌、发酵出来的 饲料质量高、发酵耗时短的猪禽用发酵液体饲料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供该猪禽用发酵液体饲料的制备方法所制 得的发酵液体饲料及其在制备猪禽用全价配合饲料中的应用。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种猪禽用发酵液体饲料的制备方法，其特征在于：将 乳酸杆菌Lactobacillus gasseri、发酵乳酸杆菌Lactobacillus feimentium、 枯草芽孢杆菌B.subtilis、纳豆芽孢杆菌Bacillus natto和酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae经一级斜面培养、二级液体培养后，按重量配比 放入含有黄芪、Na2HPO4、氮源、碳源的发酵培养基的固体发酵罐中发 酵；步骤如下：
1)一级斜面培养：
将乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌分别于28～38℃培养18～36小时；将枯 草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别于30～40℃培养16～32小时；将酿酒酵 母于26～36℃培养20～30小时；
2)二级液体培养：
将步骤1)得到的乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌于28～38℃培养18～30 小时；将步骤1)得到的枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌于30～40℃培养 18～24小时；将步骤1)得到的酿酒酵母于26～36℃培养18～28小时； 得到上述各菌的种子液；
3)发酵：将发酵培养基粉碎到40～100目，置于固体发酵罐中，加 水调整发酵罐中固形物含量到30～50wt％，升温至108～122℃，并保温 20～40min，冷却至30℃以下，无菌条件下按重量配比接入乳酸杆菌、 发酵乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母种子液，种子 液的总重量为发酵培养基总重量的1～10wt％，28～38℃、搅拌速度30～ 80rpm、罐压0.04～0.07MPa、通风比为1∶0.6～1.0的条件下培养30～ 40h，得到发酵液体饲料；
4)包装：将得到的发酵液体饲料无菌状态下分装入塑料罐或透气的 塑料袋中。
其中，该猪禽用发酵液体饲料的制备方法中乳酸杆菌、发酵乳酸杆 菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母种子液的重量配比为：乳 酸杆菌15～25wt％，发酵乳酸杆菌15～25wt％，枯草芽孢杆菌10～ 20wt％，纳豆芽孢杆菌10～20wt％，酿酒酵母20～36wt％。
本制备方法中所用的氮源可以为大豆饼粕、棉籽饼粕、菜籽饼粕、 花生饼粕、胡麻饼粕、向日葵(仁)饼粕中的任一种、两种或多种的混 合物；所用的碳源可以为红糖、糖蜜、葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖、玉 米粉、麸皮中的任一种、两种或多种的混合物；氮源的含氮量与碳源的 含碳量的质量比控制在3～20∶1。
本制备方法的发酵培养基中中草药黄芪的加入对提高动物的免疫力 有很好的作用，在发酵培养基中的加入量为1～5wt％，Na2HPO4的加入 量为0.5～1.5wt％。
本发明还提供了上述猪禽用发酵液体饲料的制备方法所制得的发酵 液体饲料。
本发明的发酵液体饲料可作为蛋白浓缩饲料使用，可用于制备猪禽 用全价配合饲料。
利用本发明猪禽用发酵液体饲料的制备方法所制得的发酵液体饲料 为一种稠状液体，有较浓的醇香味；其固形物含量达到30～50wt％，活 菌数高，如：乳酸杆菌数≥108CFU/ml，芽孢杆菌数≥109CFU/ml，酿 酒酵母菌数≥108CFU/ml，pH≤5；发酵液体饲料中含有蛋白质、多肽、 小肽、氨基酸、黄芪多糖及乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、枯草芽胞杆菌、 纳豆芽胞杆菌、酿酒酵母多种有益微生物，适用于制备猪禽的各种全价 配合饲料。
本发明的猪禽用发酵液体饲料的制备方法与已有技术相比具有以下 优越性：
(1)多菌混合发酵且配比合理，缩短反应时间，增加微生物种类，提升 产品性能；
(2)将中药黄芪与饼粕类饲料同时发酵，增加产品的免疫功能；
(3)发酵在密封的固体发酵罐中进行，发酵不易染菌，条件易控制，发 酵出来的饲料质量高。
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是 为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1
1)一级斜面培养：
将乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌分别于28培养36小时；上述两种菌的 培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.5wt％、牛肉提取物1wt％、 柠檬酸三铵0.1wt％、乙酸钠(3H2O)0.7wt％、酵母浸粉0.2wt％；葡萄 糖1wt％；磷酸氢二钾0.3wt％；吐温800.1wt％；琼脂1.3wt％；
将枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别于30培养32小时；上述两种 菌的培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.3wt％、葡萄糖0.4wt ％、牛肉膏1.5wt％、磷酸二氢钾0.4wt％、琼脂3wt％；
将酿酒酵母于26℃培养30小时；酿酒酵母的培养基为按下述比例配 制的混合物：大豆蛋白胨0.2wt％、葡萄糖0.3wt％、酵母膏0.5wt％、 麦芽膏1wt％、琼脂粉2wt％；
2)二级液体培养：
将步骤1)得到的乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌于28℃培养30小时；上 述两种菌所用的培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.5wt％、牛 肉提取物1wt％、柠檬酸三铵0.1wt％、乙酸钠(3H2O)0.7wt％、酵母 浸粉0.2wt％；葡萄糖1wt％；磷酸氢二钾0.3wt％；吐温800.1wt％；
将步骤1)得到的枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌于40℃培养18小时； 上述两种菌所用的培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨0.5wt％、 葡萄糖0.5wt％、牛肉膏1.5wt％、磷酸二氢钾0.3wt％、3.08％硫酸锰溶 液1.5wt％；
将步骤1)得到的酿酒酵母于26℃培养28小时；培养基为按下述比 例配制的混合液：红糖1.5wt％、大豆蛋白胨1.2wt％、酵母膏0.7wt％、 磷酸二氢钾0.1wt％、硫酸镁0.02wt％、pH6.5～7.0；得到上述各菌的种 子液；
3)发酵：将发酵培养基粉碎到40目，置于固体发酵罐中，加水调 整发酵罐中固形物含量到30wt％，通高压蒸汽升温至108℃，并保温 40min，自然冷却至30℃以下，无菌条件下按重量配比接入各菌种子液： 乳酸杆菌20wt％、发酵乳酸杆菌20wt％、枯草芽孢杆菌20wt％、纳豆芽 孢杆菌20wt％和酿酒酵母20wt％，种子液的总重量为发酵培养基总重量 的10wt％，28℃、搅拌速度80rpm、罐压0.04MPa、通风比为1∶0.6的 条件下培养36h，得到发酵液体饲料；
发酵培养基中氮源为大豆粕20wt％、棉籽粕5wt％，碳源为糖蜜， 所加入氮源的含氮量与碳源的含碳量的重量百分比为3∶1，黄芪1wt％， Na2HPO41.5wt％；
4)包装：将得到的发酵液体饲料无菌状态下分装入塑料罐中。
实施例2
1)一级斜面培养：
将乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌分别于38培养18小时；上述两种菌的 培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨1wt％、牛肉提取物0.5％、 柠檬酸三铵0.3wt％、乙酸钠(3H2O)0.7wt％、酵母浸粉0.7wt％；葡 萄糖2wt％；磷酸氢二钾0.1wt％；吐温800.05wt％；琼脂1.6wt％；
将枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别于37培养18小时；上述两种 菌的培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨1wt％、葡萄糖2wt％、 牛肉膏0.3wt％、磷酸二氢钾0.4wt％、琼脂4wt％；
将酿酒酵母于30℃培养24小时；酿酒酵母的培养基为按下述比例配 制的混合物：大豆蛋白胨0.7wt％、葡萄糖1.0wt％、酵母膏0.1wt％、 麦芽膏0.2wt％、琼脂粉3wt％；
2)二级液体培养：
将步骤1)得到的乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌于38℃培养18小时；上 述两种菌所用的培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨1wt％、牛肉 提取物0.5wt％、柠檬酸三铵0.1wt％、乙酸钠(3H2O)0.7wt％、酵母浸 粉0.2wt％；葡萄糖1wt％；磷酸氢二钾0.4wt％；吐温800.05wt％；
将步骤1)得到的枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌于40℃培养18小时； 上述两种菌所用的培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1wt％、葡 萄糖2wt％、牛肉膏0.5wt％、磷酸二氢钾0.6wt％、3.08％硫酸锰溶液 0.5wt％；
将步骤1)得到的酿酒酵母于24℃培养24小时；培养基为按下述比 例配制的混合液：红糖2.5wt％，大豆蛋白胨2.0wt％，酵母膏0.2wt％， 磷酸二氢钾0.4wt％，硫酸镁0.02wt％，pH6.5～7.0；得到上述各菌的种 子液；
3)发酵：将发酵培养基粉碎到100目，置于固体发酵罐中，加水调 整发酵罐中固形物含量到50wt％，通高压蒸汽升温至122℃，并保温 20min，自然冷却至30℃以下，无菌条件下按重量配比接入各菌种子液： 乳酸杆菌25wt％、发酵乳酸杆菌25wt％、枯草芽孢杆菌10wt％、纳豆芽 孢杆菌10wt％和酿酒酵母30wt％，种子液的总重量为发酵培养基总重量 的10wt％，38℃、搅拌速度50rpm、罐压0.05MPa、通风比为1∶0.8的 条件下培养32h，得到发酵液体饲料；
发酵培养基中氮源为大豆粕30wt％、棉籽粕5wt％、菜籽粕5wt％， 碳源为糖蜜，所加入氮源的含氮量与碳源的含碳量的质量百分比为20∶1， 黄芪5wt％，Na2HPO40.5wt％；
4)包装：将得到的发酵液体饲料无菌状态下分装入透气的塑料袋中。
实施例3
1)一级斜面培养：
将乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌分别于37培养24小时；上述两种菌的 培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.8wt％、牛肉提取物0.5wt ％、柠檬酸三铵0.2wt％、乙酸钠(3H2O)0.5wt％、酵母浸粉0.5wt％； 葡萄糖1.5wt％；磷酸氢二钾0.2wt％；吐温800.08wt％；琼脂1.5wt％；
将枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别于37培养18小时；上述两种 菌的培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.5wt％、葡萄糖1.5wt ％、牛肉膏1.0wt％、磷酸二氢钾0.5wt％、琼脂3wt％；
将酿酒酵母于30℃培养24小时；酿酒酵母的培养基为按下述比例配 制的混合物：大豆蛋白胨0.5wt％、葡萄糖0.8wt％、酵母膏0.3wt％、 麦芽膏0.5wt％、琼脂粉3wt％；
2)二级液体培养：
将步骤1)得到的乳酸杆菌和发酵乳酸杆菌于37℃培养24小时；上 述两种菌所用的培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.8％、牛肉 提取物0.5wt％、柠檬酸三铵0.2wt％、乙酸钠(3H2O)0.5wt％、酵母浸 粉0.5wt％；葡萄糖1.5wt％；磷酸氢二钾0.2wt％；吐温800.08wt％；
将步骤1)得到的枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌于35℃培养20小时； 上述两种菌所用的培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨0.5wt％、 葡萄糖1.5wt％、牛肉膏1.0wt％、磷酸二氢钾0.5wt％、3.08％硫酸锰 溶液1.0wt％；
将步骤1)得到的酿酒酵母于30℃培养22小时；培养基为按下述比 例配制的混合液：红糖2.0wt％，大豆蛋白胨1.5wt％，酵母膏0.5wt％， 磷酸二氢钾0.3wt％，硫酸镁0.05wt％，pH6.5～7.0；得到上述各菌的种 子液；
3)发酵：将发酵培养基粉碎到80目，置于固体发酵罐中，加水调 整发酵罐中固形物含量到35wt％，通高压蒸汽升温至115℃，并保温 30min，自然冷却至30℃以下，无菌条件下按重量配比接入各菌种子液： 乳酸杆菌15wt％、发酵乳酸杆菌15wt％、枯草芽孢杆菌17wt％、纳豆芽 孢杆菌17wt％和酿酒酵母36wt％，种子液的总重量为发酵培养基总重量 的5wt％，35℃、搅拌速度800rpm、罐压0.05MPa、通风比为1∶1.0的 条件下培养40h，得到发酵液体饲料；
发酵培养基中氮源为大豆粕25wt％、胡麻粕2wt％、菜籽粕3wt％， 碳源为葡萄糖，所加入氮源的含氮量与碳源的含碳量的质量百分比为20∶ 1，黄芪5wt％，Na2HPO40.5wt％；
4)包装：将得到的发酵液体饲料无菌状态下分装入透气的塑料袋中 实施例4实施例2制备的发酵液体饲料在制备仔猪全价饲料中的应用
按重量配比称取实施例2制备的发酵液体饲料、玉米、麸皮，粉碎 后，加入磷酸氢钙、仔猪预混料，具体配比如下：
发酵液体饲料32wt％，玉米60wt％，麸皮2.5wt％，碳酸氢钙1.5 wt％，4wt％仔猪预混料。
实施例5实施例1制备的发酵液体饲料在制备生长育肥猪全价饲料中的 应用
按下述重量配比称取实施例1制备的发酵液体饲料、玉米、麸皮， 粉碎后，加入磷酸氢钙、生长育肥猪预混料，具体配比如下：
发酵液体饲料15wt％，豆粕16wt％，玉米64.5wt％，麸皮2.5wt ％，碳酸氢钙1wt％，1wt％生长育肥猪预混料。
实施例6实施例3制备的发酵液体饲料在制备肉鸡全价饲料中的应用
按下述重量配比称取实施例3制备的发酵液体饲料、玉米、麸皮， 粉碎后，加入石粉、肉鸡预混料，具体配比如下：
发酵液体饲料15wt％，豆粕10wt％，玉米60wt％，麸皮8.5％，磷 酸氢钙1.3wt％，石粉1.2wt％，4％肉鸡预混料。
实施例7实施例4制备的仔猪全价饲料饲喂试验
选用28天断奶的(杜×长×大)三元杂交健康商品仔猪120头，体 重为7.6kg左右，按体重相近、遗传基础相似的原则，采用完全随机单因 子设计分2组进行试验，每组设3个重复(栏)，每重复10头(开始体 重组间差异不显著，p＞0.05)，公母各半。试验组日粮采用实施例4制备 的仔猪全价饲料，对照组日粮是将实施例4仔猪全价饲料中发酵液体饲 料用豆粕替代，试验期35天，测定仔猪的生产性能，结果见表1。
表1仔猪生产性能统计表
注：右肩标有不同字母，表示差异显著(p＜0.05)
从表1可见试验组与对照组间平均日采食量差异不显著；但试验组 日增重比对照组提高了9.86％，料重比下降了9.25％，腹泻率下降34.29 ％。试验组与对照组比较，料重比与腹泻率均差异显著，说明饲喂添加 发酵液体饲料的全价饲料可以降低仔猪腹泻的发生率，同时可以提高料 重比。
实施例8实施例6制备的肉鸡全价饲料的饲喂试验
选用1日龄商品代艾维因混合健雏480只，采用完全随机单因子设 计分2组进行试验。每组设4个重复，每重复30只(初始体重组间差异 不显著，P＞0.05)。试验期49天。试验组日粮采用实施例6制备的肉鸡 全价饲料，对照组日粮是将实施例6肉鸡全价饲料中的发酵液体饲料用 豆粕替代，测定肉鸡的生产性能，并测定肉鸡淋巴细胞转化率(测定方 法见《诊断学》)，结果详见表2和表3。
表2肉鸡生产性能分析表
注：右肩标有不同字母，表示差异极显著(p＜0.01)。
结果表明：试验组料重比明显低于对照组(P＜0.01)，比对照组降低 了7.50％；死亡率试验组显著低于对照组(P＜0.01)，比对照组下降 75.65％；试验组鸡增重与对照组有极显著差异(P＜0.01〕，试验组鸡增 重比对照组提高10.24％，说明添加发酵液体饲料的全价饲料能显著提高 肉鸡的的生产性能。
表3发酵液体饲料对肉鸡淋巴细胞转化率的影响
注：同行数据右肩标有不同大写字母者为差异达到极显著水平(p＜0.01)
结果表明：添加本发明发酵液体饲料的全价饲料能显著提高机体T 淋巴细胞活力，提高淋巴细胞的转化率。与对照组相比，试验组OD值 比对照组提高69.4％，两组淋巴细胞转化率差异显著(P＜0.01)，说明发酵 液体饲料能明显刺激免疫系统的发育、调节机体免疫力，从而增强机体 的免疫功能和抗病力。