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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611208810.1 (22)申请日 2016.12.23 (71)申请人 叶宗耀 地址 525132 广东省茂名市化州市笪桥镇 柑村官田村28号 (72)发明人 叶宗耀 (74)专利代理机构 北京精金石专利代理事务所 (普通合伙) 11470 代理人 刘晔 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种萝芙木快速增殖培养基及其应用 (57)摘要 本发明属于通过组织培养技术的植物再生 领域， 具体涉及到一种萝芙木快速增殖培养基及 其应。
2、用， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 0.5-1mg/L 6-苄基嘌呤、 0.2-0.5mg/L 2,4-二氯 苯氧乙酸、 0.1-0.2mg/L赤霉酸、 0.5-1g维生素E、 1000-1500mg/L萝芙木乳汁和30-40g/L蔗糖， 本 发明培养的萝芙木幼苗移栽成活率在90以上， 并且培养基成分来源广泛， 增殖速度快， 增殖系 数高， 适合产业化。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106718913 A 2017.05.31 CN 106718913 A 1.一种萝芙木快速增殖培养基， 其特征在于， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 0.5- 1mg/L 6-苄基嘌呤、 0.2。
3、-0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.1-0.2mg/L赤霉酸、 0.5-1g维生素 E、 1000-1500mg/L萝芙木乳汁和30-40g/L蔗糖。 2.根据权利要求1所述的萝芙木快速增殖培养基， 其特征在于， 所述的增殖培养基组成 为B5培养基、 0.8mg/L 6-苄基嘌呤、 0.35mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.15mg/L赤霉酸、 0.8g维 生素E、 1300mg/L萝芙木乳汁和35g/L蔗糖。 3.根据权利要求1或2所述的萝芙木快速增殖培养基在萝芙木增殖培养中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106718913 A 2 一种萝芙木快速增殖培养基。
4、及其应用 技术领域 0001 本发明属于通过组织培养技术的植物再生领域， 具体涉及到一种萝芙木快速增殖 培养基及其应用。 背景技术 0002 萝芙木： 直立常绿灌木， 高可达3m， 具乳汁， 属于一种药材， 功能主治镇静， 降压， 活 血止痛， 清热解毒。 用于高血压病， 头痛， 眩晕， 失眠， 高热不退， 外用治跌打损伤， 毒蛇咬伤 等。 萝芙木根中分离出利血平、 阿吗碱、 萝莱碱、 蛇根亭碱、 阿吗灵、 山马蹄碱、 萝芙木甲素、 锥洛斯明碱、 霹雳萝芙辛碱、 一种单萜类生物碱等多种生物碱， 含量为12， 其中利血平 具有良好的降压作用。 萝芙木中尚含熊果酸0.2， 熊果酸的抗肿瘤作用广泛，。
5、 极有可能成 为低毒有效的新型抗癌药物。 因此， 萝芙木具有很高的药用价值， 而且萝芙木的种植也已经 得到国家的推广。 0003 由于连年的采挖， 资源急剧减少， 从20世纪80年代中期开始， 生产厂家就把药用部 位由根扩展到全株， 而且为保护野生资源， 满足企业生产需求， 越来越多的研究机构开展了 萝芙木规范化种植研究。 0004 萝芙木的繁殖主要是种子与扦插繁殖， 但是种子繁殖发芽率低， 生长速度慢， 周期 长等缺点， 而扦插繁殖操作复杂， 成活率低等缺点而不能广泛推广， 因此， 为了促进萝芙木 快速繁殖， 对萝芙木组织进行了培养基的研究， 摆脱了外部环境对植株的影响， 而且可以对 优良的。
6、品种进行筛选， 对品种进行优化， 因此， 植物培养基对萝芙木的快速繁殖十分重要。 0005 红果萝芙木植物组织培养及快速繁殖 ， 张丽珍， 等， 江苏农业科学出版社， 2015 年第43卷第6期公开了红果萝芙木不同时期的培养基， 以红果萝芙木茎段为外植体， 研究其 再生条件， 结果表明： 丛生芽诱导培养基为MS+1.0mg/L 6BA+0.05mg/L IBA； 继代增殖、 壮 苗培养基分别为MS+0.30.5mg/L 6BA+0.02mg/L IBA、 MS+0.10.2mg/L 6-BA+0.01mg/ L IBA； 根分化的最适培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L 。
7、IBA。 0006 公开号为101731149A的中国专利申请公开了一种利用组织培养技术快速繁殖云 南萝芙木的方法， 该发明以萝芙木嫩枝带芽茎段作外植体， 接种在启动培养基上诱导腋芽 产生， 启动培养基组成为MS+2.0-4.0mg/LBA+0.05-0.1mg/LNAA。 增殖培养MS+2.5-5.0mg/ LBA+0.1-0.5mg/LNAA， 增殖系数为8-12， 每4-5周重复继代一次。 生根培养基为添加1.0mg/ LNAA或IBA或NAA+IBA1.0mg/L的1/2MS培养基， 5-6周后将生根苗移栽到炼苗基质中， 20- 30保湿遮阴炼苗3-4周转栽或大田种植， 成活率达90。。
8、 此发明方法操作简单， 繁殖速度 快， 遗传稳定性好， 为工厂化育苗提供技术支撑。 0007 但是上述技术中增殖培养使用的是1个单位的MS培养基， 铵态氮含量过高， 容易伤 害外植体， 造成成活率低。 发明内容 0008 为了解决现有技术的不足， 本发明公开了一种萝芙木快速增殖培养基及其应用， 说 明 书 1/4 页 3 CN 106718913 A 3 本发明公开的培养基是在B5培养基的基础上， 添加适量的植物激素， 并且加入了萝芙木乳 汁和蔗糖， 极大地加快了萝芙木的快速增殖。 0009 一种萝芙木快速增殖培养基， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 0.5-1mg/L 6- 苄基嘌呤、 。
9、0.2-0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.1-0.2mg/L赤霉酸、 0.5-1g维生素E、 1000- 1500mg/L萝芙木乳汁和30-40g/L蔗糖。 0010 进一步的， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 0.8mg/L 6-苄基嘌呤、 0.35mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.15mg/L赤霉酸、 0.8g维生素E、 1300mg/L萝芙木乳汁和35g/L蔗糖。 0011 其中B5培养基的组成为大量元素： KNO32500， MgSO47H2O 250， CaCl22H2O 150， (NH4)2SO4134， NaH2PO4.H2O 150； 微量元素： KI 0.。
10、75， H3BO3 3.0， MnSO44H2O 10， ZnSO4 7H2O 2.0， Na2MoO42H2O 0.25， CoCl26H2O 0.025， CuSO45H2O 0.025； 铁盐： Na2-EDTA 37.3， FeSO47H2O 27.8； 有机成分： 肌醇100， 烟酸1.0， 盐酸吡哆醇1.0， 盐酸硫铵10， 单位为 mg/L。 0012 B5培养基的主要特点是含有较低的铵， 而铵这一营养成分过多对萝芙木有抑制生 长的作用， 愈伤组织B5培养基上生长得更好。 0013 与现有技术相比， 本发明添加萝芙木乳汁丰富了要培养加的营养物质， 采用B5培 养基是由于培养基中无。
11、机盐含量较低， 而且本发明还使用了维生素E， 防止植株愈伤组织发 生褐化。 具体实施方式 0014 通过以下具体实施例对本发明作进一步说明， 使本领域技术人员更加理解本发明 技术方案， 但并非是对本发明的限制。 本发明培养基购自北京拜尔迪生物技术有限公司供 应的Sigma的B5培养基。 试验涉及到的萝芙木品种为云南萝芙木； 椰子汁： 郑州绿尔生物科 技发展有限公司。 0015 实施例1 0016 进一步的， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 0.8mg/L 6-苄基嘌呤、 0.35mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.15mg/L赤霉酸、 0.8g维生素E、 1300mg/L萝芙木乳汁和35。
12、g/L蔗糖。 0017 所述的快速增殖培养基的制备方法为： 向B5培养基中加入6-苄基嘌呤、 2,4-二氯 苯氧乙酸、 赤霉酸、 维生素E、 萝芙木乳汁和蔗糖， 搅拌均匀即得。 0018 实施例2 0019 一种萝芙木快速增殖培养基， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 1mg/L 6-苄基 嘌呤、 0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.2mg/L赤霉酸、 0.5g维生素E、 1500mg/L萝芙木乳汁和 30g/L蔗糖。 0020 所述的快速增殖培养基的制备方法与实施例1类似。 0021 实施例3 0022 一种萝芙木快速增殖培养基， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 0.5mg/L。
13、 6-苄 基嘌呤、 0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.1mg/L赤霉酸、 1g维生素E、 1000mg/L萝芙木乳汁和 40g/L蔗糖。 0023 所述的快速增殖培养基的制备方法与实施例1类似。 0024 对比例1 说 明 书 2/4 页 4 CN 106718913 A 4 0025 进一步的， 所述的增殖培养基组成为B5培养基、 0.8mg/L 6-苄基嘌呤、 0.35mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、 0.15mg/L赤霉酸、 0.8g维生素E、 1300mg/L椰子汁和35g/L蔗糖。 0026 与实施例1相比， 区别是不添加萝芙木乳汁， 替换为椰子汁。 0027 所述的快速增。
14、殖培养基的制备方法与实施例1类似。 0028 试验例1培养试验 0029 试验对象为： 实施例1-3与对比例1制备的萝芙木快速增殖培养基。 0030 培养方法： 采摘长势较优的萝芙木嫩枝， 在无菌条件下， 消毒后用水冲洗1个小时， 剪取带节的2cm茎段作为外植体， 接种在B5培养基上， 诱导腋芽的产生， 当腋芽处的不定芽 生长到1-2cm时， 进行增殖培养， 将不定芽的顶芽和带芽茎段作为外植体接种于增殖培养基 中， 培养条件为24， 光照时间为16小时， 光照强度为2500LX， 每20天将不定芽在增殖培养 基上进行继代培养一次。 0031 具体结果如表1所示， 数值均为平均值。 0032 表。
15、1增殖培养基上的生长状况(增值系数为一个腋芽长出的植株数) 0033 0034 从表1中可以看出， 本发明公开的实施例1-3培养基相对于对比例1培养基， 增殖系 数高， 生长速度快， 不定芽较粗， 叶片为深绿色， 而且愈伤组织不发生褐化， 获得比较健壮的 幼苗， 幼苗质量更好。 0035 试验例2移栽成活率 0036 试验方法： 将试验例1得到的丛生苗在增殖培养基上继续培养20天， 生出若干根， 移到普通房间， 并将封口打开， 3天后将生根苗移出， 然后洗去培养基， 移栽到炼苗基质中浇 透水(珍珠岩： 泥炭土重量比为2： 1)， 25下放置在植物恒温室中进行培养， 20天后， 移栽到 外部环境。
16、中进行种植， 计算一个月后植株的成活量， 具体结果如表2所示。 0037 表2移栽成活率与生长状况 0038 培养基移栽成活率生长状况 实施例193长势旺盛、 叶片深绿、 茎部粗壮 实施例292.5长势旺盛、 叶片深绿、 茎部粗壮 说 明 书 3/4 页 5 CN 106718913 A 5 实施例391长势旺盛、 叶片深绿、 茎部粗壮 对比例185长势旺盛、 叶片绿色、 茎部稍细 0039 从表2中可以里看出， 本发明实施例1-3的移栽成活率均在90以上， 大于对比例1 中85的移栽成活率， 说明本发明公开的培养基进一步的提高了萝芙木的成活率， 有利于 萝芙木的快速增殖。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106718913 A 6 。