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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710065352.9 (22)申请日 2017.02.06 (71)申请人 张志刚 地址 010010 内蒙古自治区呼和浩特市乌 兰察布东街70号农牧业大厦农牧场科 技站 申请人 任俊光 (72)发明人 张志刚 任俊光 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 何叶喧 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种动物鲜精的保存方法及其专用鲜精保 存稀释液 (57)摘要 本发明公开了一种动物鲜精的。
2、保存方法及 其专用鲜精保存稀释液。 本发明所提供的动物鲜 精的保存方法， 包括如下步骤： 采用鲜精保存稀 释液对动物鲜精进行保存； 所述鲜精保存稀释液 中含有3847mg/mL Tris、 0.0510.064万单 位/mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 2638mg/mL柠檬酸、 911mg/mL葡萄糖、 0.35 0.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油。 实 验证明， 采用本发明所提供的方法保存种公羊鲜 精24h-96h， 然后对母羊进行输精， 母羊受胎率在 83.5-86.2之间， 与母羊自然交配的受胎率 无显著差异。 因此， 采用本发明所提。
3、供的方法可 以保存动物鲜精， 具有重要的应用价值。 权利要求书1页 说明书6页 CN 106857500 A 2017.06.20 CN 106857500 A 1.一种动物鲜精的保存方法， 包括如下步骤： 采用鲜精保存稀释液对动物鲜精进行保 存； 所述鲜精保存稀释液中含有3847mg/mL Tris、 0.0510.064万单位/mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 2638mg/mL柠檬酸、 911mg/mL葡萄糖、 0.350.42mg/ mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油。 2.如权利要求1所述的保存方法， 其特征在于： 所述 “采用鲜精保存稀释液对动。
4、物鲜精 进行保存” 的方式为将所述动物鲜精和所述鲜精保存稀释液混合， 然后保存。 3.如权利要求1或2所述的保存方法， 其特征在于： 所述保存的参数为： 35保存 96h以下。 4.如权利要求1至3中任一所述的保存方法， 其特征在于： 所述鲜精保存稀释液为含有 3847mg/mL Tris、 0.0510.064万单位/mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 26 38mg/mL柠檬酸、 911mg/mL葡萄糖、 0.350.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油的 水溶液。 5.如权利要求1至4中任一所述的方法， 其特征在于： 所述动物鲜精和所述鲜精保存。
5、稀 释液的体积配比为1:35。 6.如权利要求1至5任一所述的保存方法， 其特征在于： 所述动物为羊属动物。 7.如权利要求6所述的保存方法， 其特征在于： 所述羊属动物为杜泊羊、 萨福克羊或德 美绵羊。 8.一种鲜精保存稀释液， 其特征在于： 所述鲜精保存稀释液中含有3847mg/mLTris、 0.0510.064万单位/mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 2638mg/mL柠檬酸、 9 11mg/mL葡萄糖、 0.350.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油。 9.如权利要求8所述的鲜精保存稀释液， 其特征在于： 所述鲜精保存稀释液为含有38 。
6、47mg/mL Tris、 0.0510.064万单位/mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 26 38mg/mL柠檬酸、 911mg/mL葡萄糖、 0.350.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油的 水溶液。 10.d1)或d2)或d3)： d1)权利要求1至7任一所述的保存方法在养殖中的应用； d2)权利要求8或9所述的鲜精保存稀释液在保存动物鲜精中的应用； d3)权利要求8或9所述的鲜精保存稀释液在养殖中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106857500 A 2 一种动物鲜精的保存方法及其专用鲜精保存稀释液 技术领域 0001。
7、 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种动物鲜精的保存方法及其专用鲜精保存 稀释液。 背景技术 0002 人工授精是羊优良种群高效扩繁的有力手段， 精液品质的优劣决定了人工授精技 术的成败。 目前， 国内大部分羊场采用低温保存的方法短时间储存羊鲜精， 鲜精的有效保存 时间仅为1-2天。 随着保存时间的延长， 精液的活力降低， 精子的质膜完整性被破坏， 精子在 母羊生殖道的存活时间也缩短， 进而导致胚胎的死亡率增加和受胎率降低。 因此， 如何有效 保存羊鲜精在品种繁育中具有重要的作用。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是如何保存动物鲜精。 0004 为解决上述技术问题， 本发明首先提。
8、供了一种动物鲜精的保存方法。 0005 本发明所提供的动物鲜精的保存方法， 包括如下步骤： 采用鲜精保存稀释液对动 物鲜精进行保存； 所述鲜精保存稀释液中可含有3847mg/mL Tris、 0.0510.064万单位/ mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 2638mg/mL柠檬酸、 911mg/mL葡萄糖、 0.35 0.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油。 0006 上述保存方法中， 所述 “采用鲜精保存稀释液对动物鲜精进行保存” 的方式可为将 所述动物鲜精和所述鲜精保存稀释液混合， 然后保存。 0007 上述保存方法中， 所述保存的参数为： 。
9、35(如3或4或5)保存96h以下 (如24h以下或48h以下或72h以下或24h或48h或72h或96h)。 0008 上述保存方法中， 所述鲜精保存稀释液可为含有3847mg/mL Tris、 0.051 0.064万单位/mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 2638mg/mL柠檬酸、 911mg/mL 葡萄糖、 0.350.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油的水溶液。 0009 上述保存方法中， 所述动物鲜精和所述鲜精保存稀释液的体积配比为1:35(如 1:3或1:4或1:5)。 0010 上述保存方法中， 所述动物可为羊属动物。 所述羊属动。
10、物具体可为杜泊羊、 萨福克 羊或德美绵羊。 0011 为解决上述技术问题， 本发明还提供了一种鲜精保存稀释液。 0012 本发明所提供的鲜精保存稀释液中可含有3847mg/mL Tris、 0.0510.064万单 位/mL青霉素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 2638mg/mL柠檬酸、 911mg/mL葡萄糖、 0.350.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油。 0013 所述鲜精保存稀释液可为含有3847mg/mL Tris、 0.0510.064万单位/mL青霉 素、 0.0580.071万单位/mL链霉素、 2638mg/mL柠檬酸、 911mg/。
11、mL葡萄糖、 0.35 0.42mg/mL维生素B12和0.09-0.11mL/mL甘油的水溶液。 说 明 书 1/6 页 3 CN 106857500 A 3 0014 本发明还保护d1)或d2)或d3)； d1)上述任一所述的保存方法在养殖中的应用； d2) 上述任一所述的鲜精保存稀释液在保存动物鲜精中的应用； d3)上述任一所述的鲜精保存 稀释液在养殖中的应用。 所述动物可为羊属动物。 所述羊属动物具体可为杜泊羊、 萨福克羊 或德美绵羊。 0015 上述任一所述鲜精保存稀释液中具体可含有38mg/mL Tris、 0.051万单位/mL青霉 素、 0.058万单位/mL链霉素、 26mg。
12、/mL柠檬酸、 9mg/mL葡萄糖、 0.35mg/mL维生素B12和 0.09mL/mL甘油。 0016 上述任一所述鲜精保存稀释液中具体可含有42mg/mL Tris、 0.058万单位/mL青霉 素、 0.064万单位/mL链霉素、 32mg/mL柠檬酸、 10mg/mL葡萄糖、 0.38mg/mL维生素B12和 0.10mL/mL甘油。 0017 上述任一所述鲜精保存稀释液中具体可含有47mg/mL Tris、 0.064万单位/mL青霉 素、 0.071万单位/mL链霉素、 38mg/mL柠檬酸、 11mg/mL葡萄糖、 0.42mg/mL维生素B12和 0.11mL/mL甘油。 0。
13、018 上述任一所述鲜精保存稀释液具体可为含有38mg/mL Tris、 0.051万单位/mL青霉 素、 0.058万单位/mL链霉素、 26mg/mL柠檬酸、 9mg/mL葡萄糖、 0.35mg/mL维生素B12和 0.09mL/mL甘油的水溶液。 0019 上述任一所述鲜精保存稀释液具体可为含有42mg/mL Tris、 0.058万单位/mL青霉 素、 0.064万单位/mL链霉素、 32mg/mL柠檬酸、 10mg/mL葡萄糖、 0.38mg/mL维生素B12和 0.10mL/mL甘油的水溶液。 0020 上述任一所述鲜精保存稀释液具体可为含有47mg/mL Tris、 0.064万。
14、单位/mL青霉 素、 0.071万单位/mL链霉素、 38mg/mL柠檬酸、 11mg/mL葡萄糖、 0.42mg/mL维生素B12和 0.11mL/mL甘油的水溶液。 0021 上述任一所述青霉素以国际标准品青霉素G钠盐的重量0.6 g作为1个单位。 0022 上述任一所述链霉素是以链霉素硫酸盐的重量1 g作为1个单位。 0023 实验证明， 采用本发明所提供的方法保存羊鲜精， 保存24h时平均精子活力为 83， 保存48h时平均精子活力为76， 保存72h时平均精子活力为69， 保存96h时平均精 子活力为67； 将保存24h-96h的羊鲜精对母羊进行输精， 母羊受胎率在83.5-86.2。
15、之 间， 与母羊自然交配的受胎率无显著差异。 因此， 采用本发明所提供的方法可以保存动物鲜 精， 具有重要的应用价值。 具体实施方式 0024 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 0025 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0026 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0027 杜泊羊记载于如下文献中： 巩峰， 杨维仁， 杨在宾.杜泊羊生长期蛋白质需要量 J.动物营养学报， 2013， 25(12)： 928-2933. 0028 萨福克羊记载于如下文献。
16、中： 李卉敏， 王学礼， 马长春， 付宏雅.萨福克羊引进与利 用效果J.中国草食动物科学， 2011， 31(5)： 56-58. 说 明 书 2/6 页 4 CN 106857500 A 4 0029 德美绵羊记载于如下文献中： 张学计， 刘孝德， 刘昭勤等. “澳美” 和 “中美” 羊改良 “苏美” 、“德美” 羊的效果J.中国畜牧杂志， 1989(6). 0030 小尾寒羊记载于如下文献中： 殷子惠， 姜运良等.小尾寒羊BMPR- B基因的多态性、 效应及连锁分析J.畜牧兽医学报， 2006， 37(5):510-513. 0031 青霉素以国际标准品青霉素G钠盐的重量0.6 g作为1个。
17、单位。 0032 链霉素是以链霉素硫酸盐的重量1 g作为1个单位。 0033 实施例1、 鲜精保存稀释液的制备 0034 按照表1的配方制备鲜精保存稀释液甲。 按照表2的配方制备鲜精保存稀释液乙。 按照表3的配方制备鲜精保存稀释液丙。 0035 表1 0036 试剂配制78mL鲜精保存稀释液甲的用量在鲜精保存稀释液甲中的浓度 Tris2.97g38mg/mL 青霉素4.0万单位0.051万单位/mL 链霉素4.5万单位0.058万单位/mL 柠檬酸2.00g26mg/mL 葡萄糖0.72g9mg/mL 维生素B120.027g0.35mg/mL 甘油7.0mL0.09mL/mL 水71.0mL。
18、/ 0037 注：“/” 表示不存在。 0038 表2 0039 0040 0041 注：“/” 表示不存在。 0042 表3 0043 试剂配制78mL鲜精保存稀释液丙的用量在鲜精保存稀释液丙中的浓度 Tris3.63g47mg/mL 青霉素5.0万单位0.064万单位/mL 说 明 书 3/6 页 5 CN 106857500 A 5 链霉素5.5万单位0.071万单位/mL 柠檬酸3.00g38mg/mL 葡萄糖0.88g11mg/mL 维生素B120.033g0.42mg/mL 甘油8.6mL0.11mL/mL 水69.4mL/ 0044 注：“/” 表示不存在。 0045 实施例2、。
19、 实施例1的制备的鲜精保存稀释液在保存羊鲜精中的应用 0046 实验地点： 内蒙古自治区巴彦淖尔市五原县巴美肉羊养殖有限公司、 力农肉羊养 殖有限公司和包头市内蒙古蒙源肉羊种业(集团)有限公司 0047 实验时间： 2016年10月7日至2016年10月12日 0048 健康种公羊为3只杜泊羊、 3只萨福克羊和3只德美绵羊。 0049 健康发情母羊共1188只； 母羊的品种为小尾寒羊。 0050 健康发情母羊随机分成六个大组， 每组198只。 0051 实验具体方案： 0052 1、 2016年10月7日分别采集健康种公羊的精液， 得到种公羊鲜精。 将种公羊鲜精用 实施例1的制备的鲜精保存稀释。
20、液乙进行稀释(稀释体积比为1:3-5)， 得到种公羊鲜精保存 液。 将该种公羊鲜精保存液置于4， 无菌保存。 0053 2、 2016年10月7日进行下述实验： 0054 (1)在显微镜下观察种公羊鲜精保存液的精子活力； 0055 (2)将第一大组母羊随机分为9小组， 每组22只； 然后每组应用种公羊鲜精保存液 输精， 早晚各输精一次； 完成输精后45天， 统计受胎率。 0056 3、 2016年10月8日进行下述实验： 0057 (1)取步骤1中置于4无菌保存24h的种公羊鲜精保存液， 在显微镜下观察精子活 力； 0058 (2)将第二大组母羊随机分为9小组， 每组22只； 然后每组应用步骤。
21、1中置于4无 菌保存24h的种公羊鲜精保存液输精， 早晚各输精一次； 完成输精后45天， 统计受胎率。 0059 4、 2016年10月9日进行下述实验： 0060 (1)取步骤1中置于4无菌保存48h的种公羊鲜精保存液， 在显微镜下观察精子活 力； 0061 (2)将第三大组母羊随机分为9小组， 每组22只； 然后每组应用步骤1中置于4无 菌保存48h的种公羊鲜精保存液输精， 早晚各输精一次； 完成输精后45天， 统计受胎率。 0062 5、 2016年10月10日进行下述实验： 0063 (1)取步骤1中置于4无菌保存72h的种公羊鲜精保存液， 在显微镜下观察精子活 力； 0064 (2)。
22、将第四大组母羊随机分为9小组， 每组22只； 然后每组应用步骤1中置于4无 菌保存72h的种公羊鲜精保存液输精， 早晚各输精一次； 完成输精后45天， 统计受胎率。 0065 6、 2016年10月11日进行下述实验： 0066 (1)取步骤1中置于4保存无菌96h的种公羊鲜精保存液， 在显微镜下观察精子活 说 明 书 4/6 页 6 CN 106857500 A 6 力； 0067 (2)将第五大组母羊随机分为9小组， 每组22只； 然后每组应用步骤1中置于4无 菌保存96h的种公羊鲜精保存液输精， 早晚各输精一次； 完成输精后45天， 统计受胎率。 0068 7、 2016年10月12日进。
23、行下述实验： 0069 (1)取步骤1中置于4无菌保存120h的种公羊鲜精保存液， 在显微镜下观察精子 活力； 0070 (2)将第六大组母羊随机分为9小组， 每组22只； 然后每组应用步骤1中置于4无 菌保存120h的种公羊鲜精保存液输精， 早晚各输精一次； 完成输精后45天， 统计受胎率。 0071 精子活力()： 取少量待测精液滴于恒温保存于37条件下的载玻片上， 在显微 镜下随机选定一个区域计数100个， 凡是活动的精子为有活力的精子， 100个精子中有活力 的精子的数量即为精子活力， 单位为。 待测精液为种公羊鲜精保存液、 步骤1中置于4无 菌保存24h的种公羊鲜精保存液、 步骤1中。
24、置于4无菌保存48h的种公羊鲜精保存液、 步骤1 中置于4无菌保存72h的种公羊鲜精保存液、 步骤1中置于4无菌保存96h的种公羊鲜精 保存液或步骤1中置于4无菌保存24h的种公羊鲜精保存液。 0072 部分结果见表4和表5。 结果表明， 2016年10月7日种公羊鲜精保存液的平均精子活 力为95， 2016年10月8日置于4保存24h的种公羊鲜精保存液的平均精子活力为83， 2016年10月9日置于4保存48h的种公羊鲜精保存液的平均精子活力为76， 2016年10月 10日置于4保存72h的种公羊鲜精保存液的平均精子活力为69， 2016年10月11日置于4 保存96h的种公羊鲜精保存液的。
25、平均精子活力为67， 2016年10月12日置于4保存120h 的种公羊鲜精保存液的平均精子活力为53。 受胎率统计结果显示， 2016年10月7日-2016 年10月11日输精的母羊受胎率在83.5-86.2之间， 与母羊自然交配的受胎率无显著差 异； 2016年10月12日输精的母羊受胎率在55.7， 与母羊自然交配的受胎率有显著差异。 因 此， 使用实施例1的制备的鲜精保存稀释液保存种公羊鲜精， 在4低温的存储条件下， 可保 存96h； 96h内精液完全符合授精要求。 0073 表4.2016年10月7日的部分实验结果 0074 0075 表5.待测精液精子活力的部分结果 说 明 书 5/6 页 7 CN 106857500 A 7 0076 0077 按照上述方法， 将鲜精保存稀释液乙替换为鲜精保存稀释液甲或鲜精保存稀释液 乙， 其它步骤均不变， 得到的实验结果与采用鲜精保存稀释液乙保存种公羊鲜精的实验结 果无显著差异。 因此， 实施例1的制备的鲜精保存稀释液均可保存种公羊鲜精。 说 明 书 6/6 页 8 CN 106857500 A 8 。