一种天然植物提取物的制备方法及用途.pdf

一种天然植物提取物的制备方法及用途，属于植物提取技术领域。包括以下步骤：将附生美丁花原料经粉碎过筛后，采用渗漉提取、真空薄膜浓缩、大孔树脂吸附富集等方法制得附生美丁花提取物。所得的的附生美丁花提取物中含有11.5％～18.6％总黄酮，21.3％～32.6％的总酚酸，该提取物具有很强的抑菌及抗氧化作用，同时还具有一定的降血压、降血糖辅助作用，可用作食品防腐剂、食品抗氧剂及食品添加剂，该提取物的制备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，其提取物收率及功效成分的含量高。

1.一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）原料处理：将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉，过20～40目筛；2）提取：将药材装入渗漉筒中，用溶剂浸泡4～8 小时后，用40%～80％的含水乙醇做溶剂进行渗漉提取，原料重量为1kg含水乙醇用量为6～16升，按流速为10～20 mL·min的速度收集渗漉液；  3）减压浓缩：将渗漉液在水浴温度60℃～90℃，真空度0.090～0.095 MPa，待浓缩液进液流速为200～350 mL·min的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到每毫升浓缩液含0.5～1.0克原药材；4）大孔树脂纯化：将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1：15～20；先用HO洗脱，再依次用10%～80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为10～25 mL·min，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%～60%含水乙醇各部位的洗脱液；5）减压浓缩及干燥：将合并的洗脱液在50℃～70℃，真空度0.090～0.095 MPa，待浓缩液进液流速为200～350 mL·min的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过60～100目分样筛，即得附生美丁花提取物干粉。 2.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2）中：浸泡时间为5～7小时，用50%～70％的含水乙醇做溶剂进行渗漉提取，原料重量为1kg含水乙醇用量为8～12升，流速为12～18 mL·min。 3.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3）中：水浴温度70℃～80℃，真空度0.092 MPa，进液流速为230～320 mL·min；每毫升浓缩液含0. 6～0.8克原药材。 4.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：色谱柱的径高比为1：16～18，先用HO洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为12～20 mL·min；合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液。 5.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：先用HO洗脱，再依次用15%含水乙醇、25%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、75%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，合并25%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱液。 6.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5）中：真空浓缩温度60℃～65℃，真空度为0.092 MPa，进液流速为230～320 mL·min。 7.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法所制备的天然提取物在制备抗氧化、抑菌制剂中的应用。

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，具体为一种天然植物提取物的制备方法及用途。

背景技术

黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界的重要的生物活性物质，现代医学研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗病毒、抗肿瘤、抑菌、保护心脑血管、调节免疫等方面的作用，是目前天然活性成分研究的热点，具有很好的开发应用价值。

植物多酚类化合物是一类广泛存在于天然植物、水果蔬菜等中的次生代谢产物，是一类天然的强还原性物质，在抗氧化和自由基清除方面具有比常用抗氧化剂更强的作用，植物酚酸类还具有多方面的生物活性，尤其在预防心脑血管、抗癌以及抗衰老方面发挥着十分重要的作用。

附生美丁花（Medinilla arboricola）为野牡丹科酸脚杆属植物，属多年生小灌木，喜高温多湿和半阴环境，不耐寒，分布于热带及亚热带地区,生于低海拔至中海拔地区林中、荫处、水旁岩石上或攀援于树上。据文献报道，野牡丹科植物不少种类都具有清热解毒、收敛止血的功效，可治久咳、消化不良、月经过多、外伤出血、跌打肿痛等症。近年来，国内外的科学研究也发现，野牡丹科酸脚杆属植物中的化学成分为鞣质、黄酮、氨基酸及萜类等成分。它们在生物活性上具有护肝、降血糖、降血压、抗氧化、抗菌消炎等方面的作用，且部分已应用于临床。关于附生美丁花总黄酮及总酚酸的制备方法及其用途，经文献检索，尚未见研究报道。

近年来从中草药中提取黄酮及酚酸类化合物的方法多采用超声提取法、回流提取法及冷浸提取法，这些方法往往具有溶剂用量大、提取时间长、操作麻烦、工作效率较低等缺点。而分离富集总黄酮及总酚酸类多采用提取液浓缩后用乙酸乙酯及正丁醇反复萃取、再结合大孔树脂或硅胶柱色谱富集纯化。以上操作存在操作步骤及洗脱步骤多，有机溶剂用量大，收率低，生产成本较高的缺点，尤其是提取纯化过程中的加热浓缩环节较多，容易造成有效成分破坏或流失，总黄酮的提取率及转移率不高，且常要用到乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇等有毒有害溶剂，对环境造成污染，同时提取物中常存在重金属含量超标现象。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种天然植物提取物的制备方法的技术方案，具体为从附生美丁花中提取制备总黄酮及总酚酸的方法，其制备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，提取物收率及功效成分的含量高。

所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）原料处理：将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉，过20～40目筛；

2）提取：将药材装入渗漉筒中，用溶剂浸泡4～8 小时后，用40%～80％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为1kg则含水乙醇用量为6～16升，按流速为10～20 mL·min-1的速度收集渗漉液； 

 3）减压浓缩：将渗漉液在水浴温度60℃～90℃，真空度0.090～0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为200～350 mL·min-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到每毫升浓缩液含0.5～1.0克原药材的浓缩液；

4）大孔树脂纯化：将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1：15～20；先用H2O洗脱，再依次用10%～80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为10～25 mL·min-1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%～60%含水乙醇各部位的洗脱液，

5）减压浓缩及干燥：将合并的洗脱液在50℃～70℃，真空度0.090～0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为200～350 mL·min-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过60～100目分样筛，即得附生美丁花提取物干粉。

所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2）中：浸泡时间为5～7小时，用50%～70％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为1kg则含水乙醇用量为8～12升，流速为12～18 mL·min-1，优选15～17 mL·min-1。 

所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3）中：水浴温度70℃～80℃，真空度0.092 Mpa，进液流速为230～320 mL·min-1，优选250～300 mL·min-1；每毫升浓缩液含0. 6～0.8克原药材；

所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：色谱柱的径高比为1：16～18，先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为12～20 mL·min-1，优选15～18 mL·min-；合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液。

所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中：先用H2O洗脱，再依次用15%含水乙醇、25%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、75%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，合并25%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱液。

所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5）中：真空浓缩温度60℃～65℃，真空度为0.092 Mpa，进液流速为230～320 mL·min-1，优选250～300 mL·min-1。

所述的一种天然植物提取物在制备防治抗氧化、抑菌制剂中的应用。

上述一种天然植物提取物的制备方法具有下述有益效果：

1）本发明首次对附生美丁花采用含水溶剂进行渗漉法提取、真空薄膜闪蒸浓缩，结合大孔树脂吸附来分离富集黄酮及多酚类活性成分，得到了含有大量总黄酮及总酚酸等活性成分的附生美丁花提取物。该提取方法具有溶剂用量少、提取效率高，不加热，有利于热敏性成分不被破坏的特点，该浓缩技术具有浓缩液受热时间极短、浓缩速度快、效率高，操作简单、使用方便、节能环保等优点。

2）采用该方法能最大限度地将功效成分提取富集完全，且除杂完全，得到了含有大量总黄酮及总酚酸等活性成分的附生美丁花提取物。经测定该提取物干粉的收率达到18.7%～35.4%。经紫外法测定，总黄酮的含量达到11.5％～18.6％，总酚酸的含量达到21.3 ％～32.6％，提高了功效成分的提取率。

3）本发明提供的附生美丁花提取物的制备方法，其工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，其提取物收率及功效成分的含量高。

4）通过微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定附生美丁花提取物中重金属的含量，发现采用该方法制备的附生美丁花提取物中重金属含量很低，完全符合《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》的标准。

5）经初步活性试验表明，附生美丁花提取物具有一定的抗氧化及抑菌活性，同时还具有一定的降血压、降血糖等辅助作用，可用作食品防腐剂、食品抗氧剂及食品添加剂，因此具有很好的开发应用前景。

具体实施方式

现结合本发明的实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1

1）原料处理：将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉，过20目筛；

2）提取：将药材装入渗漉筒中，用溶剂浸泡5小时后，用60％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为1kg则含水乙醇用量为10升，按流速为12 mL·min-1的速度收集渗漉液； 

 3）减压浓缩：将渗漉液在水浴温度60℃，真空度为0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为220 mL·min-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，每毫升浓缩液含0.5克原药材；

4）大孔树脂纯化：将得到的浓缩液通过Diaion HP-20大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1：15。先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为20 mL·min-1，分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液；

5）减压浓缩及干燥：将合并的洗脱液在60℃，真空度0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为300 mL·min-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过80目分样筛，即得附生美丁花提取物干粉。

实施例2

步骤1）中附生美丁花粉碎成粗粉，过40目筛；步骤2）中浸泡时间为6小时，用50%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为1kg则含水乙醇用量为12升，流速为15 mL·min-1；步骤3）中水浴温度70℃，真空度0.090Mpa，进液流速为200 mL·min-1，每毫升浓缩液含0. 6克原药材；步骤4）中色谱柱的径高比为1：16，先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、25%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、75%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，合并25%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱液；步骤5）中真空浓缩温度65℃，真空度为0.090 Mpa，进液流速为200 mL·min-1；其它同实施例1。

实施例3

步骤1）中附生美丁花粉碎成粗粉，过40目筛；步骤2）中浸泡时间为7小时，用70％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为1kg则含水乙醇用量为11升，流速为18 mL·min-1；步骤3）中水浴温度80℃，真空度0.092Mpa，进液流速为250 mL·min-1，每毫升浓缩液含0.8克原药材；步骤4）中色谱柱的径高比为1：17，先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、60%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，合并30%含水乙醇、50%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液；步骤5）中真空浓缩温度70℃，进液流速为250 mL·min-1；其它同实施例1。

实施例4

步骤3）中浸泡时间为6小时，用65％的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为1kg则含水乙醇用量为8升，流速为16 mL·min-1；步骤3）中水浴温度90℃，进液流速为300 mL·min-1，每毫升浓缩液含0.9克原药材；步骤4）中色谱柱的径高比为1：18；步骤5）中进液流速为300mL·min-1；其它同实施例1。

实施例5

步骤2）中进液流速为17mL·min-1；步骤3）中进液流速为350 mL·min-1，每毫升浓缩液含1.0克原药材；步骤5）中进液流速为280mL·min-1；其它同实施例1。

上述步骤中用H2O及10％含水乙醇洗脱是为了除掉水溶性杂质，最后都用70%丙酮洗脱除掉全部杂质，使大孔吸附树脂再生，可反复使用。

以下通过相应的试验对通过本发明制备的提取物进行总黄酮、总酚酸及重金属元素的含量测定。

1）附生美丁花提取物中总黄酮的含量测定：

测定条件：UV-2102PCS 紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供），芦丁的最大吸收波长：510 nm。

标准曲线的绘制：准确称取干燥恒重的芦丁对照品15.2 mg，加60%乙醇溶解并定容置100 mL的量瓶中,摇匀得浓度为0.152 mg·mL-1的对照品溶液。分别取上述芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，用60%乙醇补充至5 mL，各加入0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置5 min后再各加入10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀。5 min后再加入4 mL 的1 mol·L-1氢氧化钠溶液，混匀，用60%乙醇稀释至刻度。10 min后于510 nm处测吸光度，试剂为空白参比，以芦丁质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归, 得芦丁含量与吸光度之间的回归方程：Ａ=11. 750Ｃ+0.367，R2=0.9987。

样品的含量测定：精密称定干燥的附生美丁花提取物干粉（实施例1）适量，用60%乙醇溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL 容量瓶中，添加60%乙醇溶液使总量约为5 mL，按照上述绘制标准曲线的方法，依次加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液和氢氧化钠溶液，混匀，用60%乙醇稀释至10 mL刻度。静置15 min后测定吸光值。重复3次测定，根据回归方程换算出样品中总黄酮的含量，计算出附生美丁花提取物中总黄酮的平均含量为11.5％～18.6％。

以实施例2-5进行同样的试验，也能达到本发明所述的有益效果。

2）附生美丁花提取物中总酚酸的含量测定

测定条件：UV-2102PCS 紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所提供），没食子酸的最大吸收波长：765 nm。

标准曲线的绘制：准确称取干燥恒重的没食子酸对照品16.61 mg，用蒸馏水溶解并定容于100 mL量瓶中，制成浓度为0.1661 mg·mL-1的对照品溶液。分别吸取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL(相当于含没食子酸分别为0、0.1661、0.3220、0.4980、0.6640、0.8300、0.9960 mg) 置于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na2CO3溶液定容至10 mL，放置暗处2 h，于765 nm处测定吸光度，试剂为空白参比。以没食子酸质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得没食子酸的回归方程Y=45.792X+0.32209, R2=0.9972。

样品的含量测定：精密称定干燥的附生美丁花提取物干粉（实施例1）适量，用蒸馏水溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL 容量瓶中，加蒸馏水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na2CO3溶液定容至10 mL，静置15 min后于765 nm处测定吸光值。重复3次测定，根据回归方程换算出样品中总酚酸的含量，计算出附生美丁花提取物中总酚酸的平均含量为21.3 ％～32.6％。

以实施例2-5进行同样的试验，也能达到本发明所述的有益效果。

3）附生美丁花提取物中重金属元素的含量测定：

仪器与测定条件：采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定附生美丁花提取物中重金属元素的含量。X-Series型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)；MARS-5型微波消解仪(美国CEM公司)， 附RTP-300 Plus温控；Milli-Q Academic超纯水处理器(美国Millipore公司)。硝酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。仪器工作参数如下表。

ICP-MS工测定条件及工作参数

工作参数 设定值 工作参数 设定值 正向功率/(W) 1200 采样深度 130 扫描模式 跳峰 冷却气流量/( L· min-1) 13.02 扫描次数 100 辅助气流量/( L· min-1) 0.70 驻留时间/(μs) 10000 雾化气流量/( L· min-1) 0.84 采样时间/(s) 49 进样时间/(s) 45 样品提升率/(mL·min-1) 1.0 清洗时间/(s) 60

样品的预处理及微波消解：精密称取附生美丁花提取物（实施例1）粉末0.1 g ( 称准至0.0001 g) ，置于聚四氟乙烯微波消解罐的内罐中，加入5 mL浓硝酸，轻微振荡静置0.5 h，放入微波消解仪中，按微波消解程序进行消解，消解完毕后冷却至室温，取出内罐将消解液转移并定容到50 mL容量瓶中，同时备一份空白溶液做对照。

微波消解程序

消解程序 功率/W 升温时间/min 控制压力/kPa 温度/℃ 持续时间/min 1 1200 5 340 120 2 2 1200 3 689 150 3 3 1200 3 1000 180 6

对消解罐内的压力、温度、升温时间进行优选，发现采用三个程序的逐渐升温、升压方式进行微波消解，获得了无残渣、澄清透明的消化液，整个微波处理只需要11 min。

标准溶液的配制及线性范围：铬、砷、镉、铅、铜标准贮备溶液(美国SPEX CertiPrep Inc.)，浓度为10 mg · L-1，分别储存于聚乙烯塑料瓶中，然后根据测定的需要配成适当浓度的混合标准溶液（含1％硝酸）。

用逐步稀释法从标准储备液中移出一定量的标准溶液，用高纯水稀释配制成标准溶液，铬、砷、镉、铅、铜元素的标准系列浓度为2.0、5.0、10.0、20.0 μg · L-1，标准溶液中含1％HNO3。分别加入内标溶液，在选定的优化条件下，采用ICP-MS进行测定，标准溶液进入ICP-MS后，仪器给出了各元素的工作曲线及线性关系。5种元素的线性回归方程、线性相关系数、线性范围及检出限如下表。

线性方程和相关系数

元素 线性回归方程 线性相关系数 线性范围(μg · L-1) 检出限(μg · L-1) Cr Y=3.53×102 X+1.21×103 0.999 8 0～1000 0.20 As Y=4.57×102 X+9.57×10-1 0.999 7 0～1000 5.65×10-2 Cd Y=9.48×102 X+4.11 0.999 8 0～1000 5.13×10-3 Pb Y=1.02×104 X+9.80×102 0.999 8 0～1000 1.57×10-2 Cu Y=6.54×102 X+2.57×102 0.999 6 0～1000 7.53×10-2

样品测定结果：仪器点火，泵入高纯水，检测各元素的空白计数，然后泵入2 μg · L-1的混合标准溶液，检测仪器的灵敏度。上述各步正常且仪器稳定后，即可按照仪器的工作参数开始测定。将消解好的样品溶液依次吸入ICP-MS仪，测定溶液中的各元素含量，同时测定样品空白以及标准溶液，结果样品中Cu的含量为5.68 μg · g-1；Cr的含量为0.87μg · g-1；As的含量为0.036 μg · g-1； Cd的含量为0.047 μg·g-1；Pb的含量为0.78 μg·g-1  。                  

铬、镉、铅、铜、砷属重金属及砷盐，为有害元素，被人体吸收后可引起蓄积性中毒。铜虽为人体必需元素，但过量也有害。这些重金属及砷盐的限量指标主要依据《中国药典》和《药用植物及其制剂进出口绿色行业标准》来评价。参照此标准，即Cu≤20.0 μg·g -1， Cd≤0.3 μg·g -1，Pb≤5.0 μg·g -1，As≤2.0 μg·g -1，此标准中没有铬，因此参照绿色食品标准（Cr≤1.0 μg·g -1）。上述试验测定结果表明，附生美丁花提取物（实施例1）中有害重金属元素Cd， Cr ，Pb，Cu、As的含量均低于限量标准，符合药用植物及其制剂进出口绿色行业标准及绿色食品标准。

以实施例2-5进行同样的试验，也能达到本发明所述的有益效果。

为进一步说明本发明在医药领域中的作用，下面通过部分抗氧化和抑菌试验结果来说明。

4）抗氧化试验结果：

1,1-二苯基苦基苯肼( 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH ) 是一种稳定的有机自由基, 通过检测样品对DPPH 自由基的清除能力可以显示其抗氧化能力的强弱。近年来，利用DPPH 溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的测定方法被证明是一种灵敏、简单易行的有效方法。本试验采用DPPH试剂来评价附生美丁花提取物的抗氧化能力。

DPPH自由基清除能力测定：DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的以氮为中心自由基，DPPH·在溶液中可生成具有典型紫色的稳定溶液，并在517nm 处有强烈吸收。当它与自由基清除剂作用时， 由于清除剂与DPPH孤对电子配对而使其在517nm处的吸光度减小，使溶液的典型紫色变浅，其吸光度的变化与其所接受的电子成定量关系。即吸光度越小，自由基清除剂的清除能力越强，因而可用分光光度法进行定量分析。

实验条件：Tecan Infinite M200酶标仪；UV-2102 PCS紫外可见分光光度计；101-3电热鼓风恒温干燥箱；KQ-250B型超声波清洗器；R201B旋转蒸发仪。1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（1,1-Diphenyl-2 -picryl-hydrazyl, DPPH）购自sigma公司，酶标板： 96微孔板，其他试剂均为分析纯。

DPPH溶液及供试品溶液的配制：DPPH溶液的配制：准确称取一定量DPPH试剂，用70%乙醇溶解，并定量转入100 mL容量瓶中，用70 %乙醇定容，摇匀得质量浓度为59.0 μg·mL-1 的DPPH 贮备液，置于冰箱中冷藏备用。

供试品溶液的制备：分别精确称取通过本发明方法得到的附生美丁花提取物干粉125 mg（实施例1），用70%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中。然后分别取1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL用70%乙醇定容于5 mL量瓶中，配置成浓度为0.25 mg· mL-1, 0.50 mg·mL-1，0.75 mg·mL-1，1.00 mg·mL-1，1.25 mg·mL-1的供试品溶液，将得到的供试品溶液置于4℃冰箱中保存待用。

测定方法与结果：用点样用移液枪在96孔酶标板中分别加入不同浓度的供试品溶液200 μL和DPPH试液100 μL。样品加入后震荡30s， 26℃保温30 min后，在用Infinite M 200酶标仪在517 nm波长下测定其吸光值(Ap)，同时测定不加DPPH的样品空白吸光值 (Ac) 和加DPPH但不加样品的吸光值(Amax)。以各供试样品的浓度（μg/mL）为横坐标，以测得的自由基清除率(Y)为纵坐标绘制准曲线，得到回归方程Y=0.05621X+5.7633，r=0.9957，根据回归方程计算IC50。供试品测定过程中用Trolox作阳性对照，并以此换算出被测供试样品总的抗氧化能力，测定结果表示为达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox浓度。用Trolox作阳性对照，以Trolox (X)浓度为横坐标，以测得的自由基清除率(Y)为纵坐标绘制标准曲线，Y=0.3754X+0.8843，r=0.9948。自由基清除率= 1- (Ap-Ac)/Amax ×100%。

IC50值是一个常用于评价抗氧化能力的参数，它是指抗氧化剂清除50%的DPPH自由基时所需的浓度。其值越小，表示达到50%清除率时，所用的自由基清除剂的浓度剂量越小，其自由基清除效果也就越好，对应的参试样品抗氧化活性越强。

计算结果Trolox对DPPH清除率的IC50值为21.59 μg/mL，供试样品对DPPH清除率的IC50值为36.85 μg/mL。表明供试样品达到半数清除率时的用量是Trolox用量的1.7倍。实验结果表明，供试样品对DPPH自由基具有较强的清除能力，且清除率在配制浓度范围内随供试样品溶液浓度的增大而提高。表明本发明制备的附生美丁花提取物（实施例1）具有较强的抗氧化活性。

以实施例2-5进行同样的试验，也能达到本发明所述的有益效果。

4）抑菌试验结果

抑菌活性的测定采用琼脂扩散滤纸片法，根据抑菌环直径判断抑菌能力。滤纸片直径6.0 mm，灭菌干燥后备用。每个样品做3 次重复实验，数据采用SPSS1010进行分析，组间比较采用t 检验。

供试样品溶液的配制：分别称取一定量由本发明制备的附生美丁花提取物（实施例1），加蒸馏水定容至容量瓶中，然后依次稀释为不同浓度的水溶液，并以消毒蒸馏水做空白对照。

菌种活化与灭菌处理：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌冷藏菌种分别接入2支营养琼脂斜面培养基活化，30℃培养24 h。培养基、其他实验所用器材和试剂均在120℃下湿热高压灭菌2 h。

抑菌实验及抑菌圈的测定：抑菌圈测量是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂培养基内成球形立体状扩散，抑制试验菌的繁殖，在抑菌物质的周围形成的透明圈。将无菌小滤纸片高温蒸汽灭菌干燥后备用。用无菌移液管吸取各种菌悬液加入无菌培养皿中，夹取浸透样品溶液的滤纸片，将其放在培养基表面。将放好滤纸片的含菌培养皿分别在恒温箱中培养，取出，测量并记录形成的抑菌环的直径。

最小抑菌浓度(MIC)测定结果：MIC的测定采用二倍稀释法。将不同浓度的样品溶液分别用移液管移入各个平皿内，倒入已经高温灭菌的培养基中充分混匀，冷却凝固后，每皿中加入菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀进行培养。取出观察结果，以不长菌的溶液浓度做为最低抑菌浓度MIC，结果供试样品对金黄色葡萄球菌的抑菌试验结果MIC为21.83 μg·mL-1，对大肠杆菌的抑菌试验结果MIC为38.29 μg·mL-1。

样品的抑菌试验结果

实验菌种 抑菌环直径( mm) 抑菌试验结果MIC (μg · mL-1) 金黄色葡萄球菌 33.46 21.83 大肠杆菌 23.55 38.29

该试验结果表明，供试样品的水溶液对供试菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均具有较强的抑制作用,且随浓度的增加抑菌效果增强。该试验结果表明附生美丁花提取物（实施例1）具有一定的抑菌活性。

经初步体外活性试验表明，附生美丁花提取物有一定的抗氧化及抑菌活性，因此具有很好的开发应用价值。以实施例2-5进行同样的试验，也能达到本发明所述的有益效果。

经相应试验表明，附生美丁花提取物同时还具有一定的降血压、降血糖等辅助作用，可用作食品防腐剂、食品抗氧剂及食品添加剂。