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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610357881.1 (22)申请日 2016.05.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105941153 A (43)申请公布日 2016.09.21 (73)专利权人 浙江胜元环境建设有限公司 地址 312000 浙江省绍兴市柯桥区王坛镇 舜江花园 (72)发明人 宋晓燕 张瑞明 潭江 (74)专利代理机构 广州天河万研知识产权代理 事务所(普通合伙) 44418 代理人 刘强 陈轩 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (。
2、56)对比文件 CN 103385173 A,2013.11.13,全文. Min Sil Ahn等.Effects of Basal media， growth regulators and addition agents on callus formation and plant regeneration for anther culture of hemerocallis spp Korean journal of horticultural Science & Technology .2002,第20卷(第2期),摘要. Dong-Sheng Han等.Production of do。
3、ubled haploid plants through colchicine treatment of anther-derived haploid calli in the Asiatic hybrid lily Connecticut King . Journal of Japanese society for horticultural science .1999,第68卷(第5 期),第979页左栏第1段、 2 秋水仙素处理. C.H.CHEN等.In vitro induction of tetraploid plants from colchicine-treated diplo。
4、id daylily callus. Euphytica .1979, (第28期),第705-709页. 审查员 陈佩 (54)发明名称 一种萱草种质脱毒复壮方法 (57)摘要 本发明提供了一种萱草种质脱毒复壮方法， 该种质脱毒复壮方法详细步骤包括：（1） 选材待 接种萱草花蕾；（2） 配制萱草花药诱导培养基； （3） 花药消毒与接种；（4） 花药诱导培养；（5） 花药 愈伤组织分化与生根培养；（6） 萱草幼苗的炼苗 与移栽；（7） 非二倍体萱草植株的剔除。 本发明的 萱草种质脱毒复壮方法通过萱草花药培养途径 获得了萱草花粉植株， 进而剔除花培群体中的非 二倍体萱草杂株获得萱草二倍体植株， 。
5、该种质脱 毒复壮方法脱毒效果显著， 可以将萱草种质复 壮， 极大提高萱草的品质和产量。 权利要求书2页 说明书6页 CN 105941153 B 2018.07.20 CN 105941153 B 1.一种萱草种质脱毒复壮方法， 其特征在于： 该种质脱毒复壮方法的详细步骤如下： （1） 选材待接种萱草花蕾 在萱草正常现蕾开花季节， 选择大部分花药处于单核晚期的花蕾， 用冰壶带回实验室， 用湿润的纱布包裹后置于4冰箱中低温预处理3-5d； （2） 配制萱草花药诱导培养基 萱草花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成： 大量元素： KNO3 25002700mg/L， NH4NO3 1600。
6、1800mg/L， KH2PO4 440480mg/L， MgSO47H2O 350390mg/L， CaCl22H2O 820860mg/L； 微量元素： MnSO44H2O 2025mg/L， ZnSO47H2O 8.09.0mg/L， H3BO3 6.06.5mg/L， KI 0.80.85mg/L， CuSO45H2O 0.020.03mg/L， CoCl26H2O 0.020.03mg/L， Na2MoO4 2H2O 0.20.3mg/L； 铁盐： Na2-EDTA2H2O 3540mg/L， FeSO47H2O 2530mg/L； 有机成分： 肌醇90110mg/L， 维生素B1 。
7、0.090.11mg/L， 维生素B6 0.450.55mg/L， 烟酸0.450.55mg/L， 甘氨酸1.82.2mg/L， 丝氨酸0.750.85mg/L， 谷氨酞胺0.75 0.85mg/L； 激素： 2， 4-D 3.23.6mg/L， KT 2.02.4mg/L； 凝固剂： 植物凝胶 6.06.5g/L； 活性添加剂： 椰乳1416g/L， 甘露醇2024g/L， 水解蛋白 0.81.0g/L， 活性炭0.35 0.45g/L； 碳源： 蔗糖2733g/L， 麦芽糖1317g/L； 将大量元素、 微量元素、 铁盐、 有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮备， 配制时， 预先量。
8、出配制培养基总量一半体积的蒸馏水， 分别加入一定体积或质量的大量元 素、 微量元素、 铁盐、 有机成分、 活性添加剂， 定容， 加热至60-80， 然后加入碳源、 凝固剂和 激素， 搅拌至沸腾后， 培养基完全融解， 停止加热， 调节pH为5.8-6.0， 然后将培养基分装于 500ml的三角瓶中， 每瓶盛120ml150ml的培养基， 密封后置于温度为121、 压力为15kPa 高压蒸汽条件下灭菌20min， 自然冷却凝固； （3） 花药消毒与接种 萱草花蕾低温预处理后， 将花蕾用自来水冲洗1020min， 在超净工作台无菌条件下， 先用75%酒精消毒2min， 再用0.1%升汞+2-3滴吐温。
9、-80消毒15min， 无菌水冲洗34次后， 从 花蕾中取出带有花丝的花药， 接种到步骤 （2） 的萱草花药诱导培养基上； （4） 花药诱导培养 将接种花药后的培养基进行花药诱导培养， 45-60d后诱导出萱草花药愈伤组织； （5） 花药愈伤组织分化与生根培养 无菌条件下将诱导成功的萱草花药愈伤组织转接到分化培养基上， 光照条件下分化培 养25-40d， 萱草分化出大量的绿芽， 将高于1.5cm的小芽切下， 转接入生根培养基上生根培 养， 35d后即观察到萱草绿苗发育出旺盛的根系； （6） 萱草幼苗的炼苗与移栽 将萱草幼苗的三角瓶封口膜打开炼苗， 710d后将幼苗从三角瓶中取出， 清洗掉根部 。
10、的培养基残留， 移栽入温室内， 遮荫一周后， 常规大田栽培； 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 105941153 B 2 （7） 非二倍体萱草植株的剔除 移栽后的萱草生长到现蕾期时， 根据植株高度差异， 将群体植株高度后20%和前20%的 植株剔除； 所述步骤 （4） 中花药诱导培养的培养条件控制为： 温度24-26， 湿度65%-80%， 黑暗 条件； 所述步骤 （5） 中分化培养的培养基配方为： MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+秋水仙素 0.03mg/L+DMSO 0.3g/L； 培养条件控制为： 温度25-27， 湿度65%-80%， 光照为1600- 。
11、2000Lx， 光周期为14h光/10h暗； 所述步骤 （5） 中生根培养的培养基配方为： 1/2MS+多效唑1.5mg/L； 培养条件控制为： 温 度26-28， 湿度65%-80%， 光照为2500-3000Lx， 光周期为12h光/12h暗。 2.根据权利要求1所述的萱草种质脱毒复壮方法， 其特征在于： 所述的萱草为二倍体萱 草， 即体细胞含2n=22条染色体的萱草品种。 3.根据权利要求1所述的萱草种质脱毒复壮方法， 其特征在于： 所述步骤 （1） 的萱草花 药诱导培养基的配方为按每升蒸馏水中由以下物质配制而成： 大量元素： KNO3 2600mg/L， NH4NO3 1700mg/L。
12、， KH2PO4 460mg/L， MgSO47H2O 370mg/L， CaCl22H2O 840mg/L； 微量元素： MnSO4 4H2O 22.5mg/L， ZnSO47H2O 8.5mg/L， H3BO3 6.25mg/L， KI 0.825mg/ L， CuSO45H2O 0.025mg/L， CoCl26H2O 0.025mg/L， Na2MoO42H2O 0.25mg/L； 铁盐： Na2-EDTA2H2O 37.5mg/L， FeSO47H2O 27.5mg/L； 有机成分： 肌醇100mg/L， 维生素B1 0.1mg/L， 维生素B6 0.5mg/L， 烟酸0.5mg/L。
13、， 甘氨酸 2.0mg/L， 丝氨酸0.8mg/L， 谷氨酞胺0.8mg/L； 激素： 2， 4-D 3.4mg/L， KT 2.2mg/L； 凝固剂： 植物凝胶6.25g/L； 活性添加剂： 椰乳15g/L， 甘露醇22g/L， 水解蛋白0.9g/L， 活性炭0.4g/L； 碳源： 蔗糖30g/L， 麦芽糖15g/L。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 105941153 B 3 一种萱草种质脱毒复壮方法 技术领域 0001 本发明涉及园林科学领域， 尤其涉及一种通过花药培养途径高效脱除萱草病毒从 而大大提升萱草种质的品质和产量的萱草种质脱毒复壮方法。 背景技术 0002 萱草 （H。
14、emerocallis fulva） 是百合科、 萱草属的多年生宿根草本， 别名萱花菜、 忘 忧草、 宜男草等， 原产中国， 被称为中国的 “母亲花” 。 萱草品种繁多， 花色鲜艳， 花型优美， 广 为人民所喜爱。本草纲目 曰：“萱草本作谖。 谖， 忘也。 ” 古人以为萱草可以使人忘忧， 故谓 之忘忧草。风土记 中记载：“ 妊妇佩其草则生男 ， 故称为宜男” 。 0003 我国的萱草种植历史久远、 种质资源丰富， 自古以来被人们视为传统的名花、 名 菜， 亦为名药。 有关萱草的一句俗语称其 “观为花、 食为菜、 用为药” 。 可见萱草其身价值颇 多、 功用颇广。 0004 萱草生长强健， 适应。
15、性强， 喜湿润也耐旱， 喜阳光又耐半荫， 被广泛应用于园林中 的花丛、 花境、 地被、 花坛等配植。 近年来， 随着生态节约型绿化理念的推广， 宿根花卉在园 林绿化中广泛应用， 人们对萱草新品种的需求也越来越大， 我国萱草的生产面积逐年增大， 因此萱草栽培有着广泛的应用前景和很高的经济价值。 0005 目前， 商业上萱草主要采用茎芽扦插繁殖法、 分株繁殖法、 组织培养法等无性繁殖 为主， 长期的无性繁殖将会使萱草体内逐渐积累大量病毒致使植物发生病毒病， 如黄瓜花 叶病毒、 百合潜隐病毒等， 并导致种性退化。 病毒病对萱草的危害表现主要有： 植株严重矮 化， 花叶畸形， 坏死斑， 产量下降， 种。
16、质明显退化， 开花少且小， 有的甚至盲花， 严重时整株枯 死， 严重制约了我国萱草的品质和产量。 0006 减少和消除萱草病毒病、 生产优质无毒种苗是萱草种球商品化生产面临的一个重 要问题。 目前， 生产上主要是通过热处理、 组培茎尖脱毒和化学处理等方法进行脱毒。 然而， 目前的萱草脱毒方法并不完善， 各种脱毒方法均有其不足之处。 热处理是利用病毒和植物 对温度敏感性的差异不同， 利用高温对植物进行处理， 高温使病毒钝化， 在植物体内很难繁 殖， 部分植物细胞耐高温加速细胞分裂和繁殖， 从而获得无病毒的新生植物组织部分， 再进 一步繁殖得到无病毒苗， 然而热处理不能脱除所有病毒， 且影响萱草存。
17、活率； 茎尖培养脱毒 是利用病毒在植物体内分布不均匀， 在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒， 因此， 采用茎 尖离体培养的方法可以脱除病毒， 其缺点是植物的存活率很低； 化学处理法是将抗病毒药 剂注射进植物体内或者加入培养基中， 以达到除去病毒的目的， 一般要与茎尖组织培养相 结合应用， 可一定程度的提高茎尖脱毒效率和存活率。 0007 花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上， 来改变花药内花 粉粒的发育程序， 使其分裂形成细胞团， 进而分化成胚状体， 形成愈伤组织， 由愈伤组织再 分化成植株的一种技术， 花药培养主要用途为培育单倍体植株， 由于小孢子基本不携带病 毒， 通过花。
18、药培养培育的植株几乎能达到完全脱毒的目的， 因此， 若将离体的萱草花药培育 成单倍体植株， 进而选择萱草的单倍体植株加倍的正常植株来育苗， 可以较好的达到萱草 说 明 书 1/6 页 4 CN 105941153 B 4 脱毒的目的。 0008 然而， 目前萱草花药培养的体系并未建立， 但百合科其它种的花药培养得到的不 少的研究， 且成功培育出了花培株， 我们在百合科其它种植物的花培体系的基础上， 尝试并 摸索萱草花药培养的适用培养基和培养条件， 建立起了一种适用于萱草花药培养的体系， 采用该花培体系可以将萱草小孢子成功培育成二倍体植株， 从而达到对萱草种质脱毒复壮 的目的， 我们的研究结果对。
19、于萱草的种质培育具有较大的意义。 发明内容 0009 发明的目的是针对现有技术存在的缺陷， 提供了一种通过花药培养途径高效脱除 萱草病毒从而大大提升萱草种质品质和产量的萱草种质脱毒复壮方法。 0010 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 0011 一种萱草种质脱毒复壮方法， 其特征在于： 该种质脱毒复壮方法的详细步骤如下： 0012 （1） 选材待接种萱草花蕾 0013 在萱草正常现蕾开花季节， 选择大部分花药处于单核晚期的花蕾， 用冰壶带回实 验室， 用湿润的纱布包裹后置于4冰箱中低温预处理3-5d； 0014 （2） 配制萱草花药诱导培养基 0015 萱草花药诱导培养基按每升蒸馏水中由。
20、以下物质配制而成： 0016 大量元素： KNO3 25002700mg/L， NH4NO3 16001800mg/L， KH2PO4 440480mg/L， MgSO47H2O 350390mg/L， CaCl22H2O 820860mg/L； 0017 微量元素： MnSO44H2O 2025mg/L， ZnSO47H2O 8.09.0mg/L， H3BO3 6.0 6.5mg/L， KI 0.80.85mg/L， CuSO45H2O 0.020.03mg/L， CoCl6H2O 0.020.03mg/L， NaMoO42H2O 0.20.3mg/L； 0018 铁盐： Na2-EDTA2。
21、H2O 3540mg/L， FeSO47H2O 2530mg/L； 0019 有机成分： 肌醇 90110mg/L， 维生素B1 0.090.11mg/L， 维生素B6 0.45 0.55mg/L， 烟酸 0.450.55mg/L， 甘氨酸 1.82.2mg/L， 丝氨酸 0.750.85mg/L， 谷氨酞 胺 0.750.85mg/L； 0020 激素： 2， 4-D 3.23.6mg/L， KT 2.02.4mg/L； 0021 凝固剂： 植物凝胶 6.06.5g/L； 0022 活性添加剂： 椰乳1416g/L， 甘露醇2024g/L， 水解蛋白 0.81.0g/L， 活性炭 0.350。
22、.45g/L； 0023 碳源： 蔗糖2733g/L， 麦芽糖1317g/L； 0024 将大量元素、 微量元素、 铁盐、 有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮 备， 配制时， 预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水， 分别加入一定体积或质量的大量 元素、 微量元素、 铁盐、 有机成分、 活性添加剂， 定容， 加热至60-80， 然后加入碳源、 凝固剂 和激素， 搅拌至沸腾后， 培养基完全融解， 停止加热， 调节pH为5.8-6.0， 然后将培养基分装 于500ml的三角瓶中， 每瓶盛120ml150ml的培养基， 密封后置于温度为121、 压力为 15kPa高压蒸汽条件下灭菌20mi。
23、n， 自然冷却凝固； 0025 （3） 花药消毒与接种 0026 萱草花蕾低温预处理后， 将花蕾用自来水冲洗1020min， 在超净工作台无菌条件 说 明 书 2/6 页 5 CN 105941153 B 5 下， 先用75%酒精消毒2min， 再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min， 无菌水冲洗34次后， 从花蕾中取出带有花丝的花药， 接种到步骤 （2） 的萱草花药诱导培养基上； 0027 （4） 花药诱导培养 0028 将接种花药后的培养基进行花药诱导培养， 45-60d后诱导出萱草花药愈伤组织； 0029 （5） 花药愈伤组织分化与生根培养 0030 无菌条件下将诱导成功的萱。
24、草花药愈伤组织转接到分化培养基上， 光照条件下分 化培养25-40d， 萱草分化出大量的绿芽， 将高于1.5cm的小芽切下， 转接入生根培养基上生 根培养， 35d后即观察到萱草绿苗发育出旺盛的根系； 0031 （6） 萱草幼苗的炼苗与移栽 0032 将萱草幼苗的三角瓶封口膜打开炼苗， 710d后将幼苗从三角瓶中取出， 清洗掉 根部的培养基残留， 移栽入温室内， 遮荫一周后， 常规大田栽培； 0033 （7） 非二倍体萱草植株的剔除 0034 移栽后的萱草生长到现蕾期时， 根据植株高度差异， 将群体植株高度后20%和前 20%的植株剔除。 0035 所述的萱草为二倍体萱草， 即体细胞含2n=2。
25、2条染色体的萱草品种。 0036 所述步骤 （1） 的萱草花药诱导培养基的最佳配方为： 0037 按每升蒸馏水中由以下物质配制而成： 0038 大量元素： KNO3 2600mg/L， NH4NO3 1700mg/L， KH2PO4 460mg/L， MgSO47H2O 370mg/ L， CaCl22H2O 840mg/L； 0039 微量元素： MnSO44H2O 22.5mg/L， ZnSO47H2O 8.5mg/L， H3BO3 6.25mg/L， KI 0.825mg/L， CuSO45H2O 0.025mg/L， CoCl6H2O 0.025mg/L， NaMoO42H2O 0.2。
26、5mg/L； 0040 铁盐： Na2-EDTA2H2O 37.5mg/L， FeSO47H2O 27.5mg/L； 0041 有机成分： 肌醇 100mg/L， 维生素B1 0.1mg/L， 维生素B6 0.5mg/L， 烟酸 0.5mg/L， 甘氨酸 2.0mg/L， 丝氨酸 0.8mg/L， 谷氨酞胺 0.8mg/L； 0042 激素： 2， 4-D 3.4mg/L， KT 2.2mg/L； 0043 凝固剂： 植物凝胶 6.25g/L； 0044 活性添加剂： 椰乳15g/L， 甘露醇22g/L， 水解蛋白 0.9g/L， 活性炭 0.4g/L； 0045 碳源： 蔗糖30g/L， 麦。
27、芽糖15g/L。 0046 所述步骤 （4） 中花药诱导培养的培养条件控制为： 温度24-26， 湿度65%-80%， 黑暗条件。 0047 所述步骤 （5） 中分化培养的培养基配方为： MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+秋水 仙素 0.03mg/L+DMSO 0.3g/L； 培养条件控制为： 温度25-27， 湿度65%-80%， 光照为 1600-2000Lx， 光周期为14h光/10h暗。 0048 所述步骤 （5） 中生根培养的培养基配方为： 1/2MS+多效唑 1.5mg/L； 培养条件控制 为： 温度26-28， 湿度65%-80%， 光照为2500-3000。
28、Lx， 光周期为12h光/12h暗。 0049 本发明相比现有技术有如下优点： 0050 本发明通过试验并优化百合科植物花药培养途径的培养基配方， 摸索出了一种高 效率地诱导萱草花药诱导培养的培养基， 使得萱草的花培效率达到了脱毒生产脱毒植株的 产业化效率要求。 说 明 书 3/6 页 6 CN 105941153 B 6 0051 由于萱草花药中的花粉基本不携带病毒， 通过花药培养途径培育的萱草花粉植株 几乎能达到完全脱毒的目的， 我们对花粉植株进行病毒检测也发现， 该脱毒方法几乎达到 100%脱毒， 大大提高了萱草种质， 获得了产量和品质均得到极大提升的萱草脱毒系。 具体实施方式 0052。
29、 下面结合实施案例对本发明作进一步说明， 而非限制本发明。 0053 实施例1 0054 2014年6月中旬， 选择大田栽培的萱草二倍体品种重瓣鞭炮和金娃娃的花药分别 进行花培诱导脱毒， 其详细步骤如下： 0055 （1） 选材待接种花蕾 0056 6月25日， 在重瓣鞭炮和金娃娃现蕾开花时， 选择大部分花药处于单核晚期的花 蕾， 用冰壶带回实验室， 用湿润的纱布包裹后置于4冰箱中低温预处理4d； 0057 （2） 配制萱草花药诱导培养基 0058 萱草花药诱导培养基按每升蒸馏水中由以下物质配制而成： 0059 大量元素： KNO3 2600mg/L， NH4NO3 1700mg/L， KH2。
30、PO4 460mg/L， MgSO47H2O 370mg/ L， CaCl22H2O 840mg/L； 0060 微量元素： MnSO44H2O 22.5mg/L， ZnSO47H2O 8.5mg/L， H3BO3 6.25mg/L， KI 0.825mg/L， CuSO45H2O 0.025mg/L， CoCl6H2O 0.025mg/L， NaMoO42H2O 0.25mg/L； 0061 铁盐： Na2-EDTA2H2O 37.5mg/L， FeSO47H2O 27.5mg/L； 0062 有机成分： 肌醇 100mg/L， 维生素B1 0.1mg/L， 维生素B6 0.5mg/L， 烟。
31、酸 0.5mg/L， 甘氨酸 2.0mg/L， 丝氨酸 0.8mg/L， 谷氨酞胺 0.8mg/L； 0063 激素： 2， 4-D 3.4mg/L， KT 2.2mg/L； 0064 凝固剂： 植物凝胶 6.25g/L； 0065 活性添加剂： 椰乳15g/L， 甘露醇22g/L， 水解蛋白 0.9g/L， 活性炭 0.4g/L； 0066 碳源： 蔗糖30g/L， 麦芽糖15g/L； 0067 将大量元素、 微量元素、 铁盐、 有机成分和激素分别配制成一定浓度倍数的母液贮 备， 配制时， 预先量出配制培养基总量一半体积的蒸馏水， 分别加入一定体积或质量的大量 元素、 微量元素、 铁盐、 有。
32、机成分、 活性添加剂， 定容， 加热至60-80， 然后加入碳源、 凝固剂 和激素， 搅拌至沸腾后， 培养基完全融解， 停止加热， 调节pH为5.8-6.0， 然后将培养基分装 于500ml的三角瓶中， 每瓶盛120ml150ml的培养基， 密封后置于温度为121、 压力为 15kPa高压蒸汽条件下灭菌20min， 自然冷却凝固； 0068 （3） 花药消毒与接种 0069 将重瓣鞭炮和金娃娃的花蕾低温预处理4d后， 将花蕾用自来水冲洗1020min， 在 超净工作台无菌条件下， 先用75%酒精消毒2min， 再用0.1%升汞+2-3滴吐温-80消毒15min， 无菌水冲洗34次后， 从花蕾中。
33、取出带有花丝的花药， 接种到步骤 （2） 的萱草花药诱导培养 基上； 0070 （4） 花药诱导培养 0071 将接种花药后的培养基进行花药诱导培养， 花药诱导培养的培养环境控制为： 温 度24-26、 湿度65%-80%、 黑暗条件， 45天后开始诱导出萱草花药愈伤组织； 说 明 书 4/6 页 7 CN 105941153 B 7 0072 （5） 花药愈伤组织分化与生根培养 0073 花药诱导55天后大部分萱草花药愈伤组织生长至大麦粒大小， 无菌条件下将诱导 成功的萱草花药愈伤组织转接到分化培养基上 （分化培养的培养基配方为： MS+1.0mg/L 6- BA+0.1mg/L NAA+秋。
34、水仙素 0.03mg/L+DMSO 0.3g/L） ， 光照条件下分化培养， 分化培养条件 控制为： 温度25-27、 湿度65%-80%、 光照为1600-2000Lx、 光周期为14h光/10h暗， 培养 25-40d后， 萱草愈伤分化出大量的绿芽， 将高于1.5cm的小芽切下， 转接入生根培养基上 （生 根培养的培养基配方为： 1/2MS+多效唑 1.5mg/L） 进行生根培养， 生根培养条件控制为： 温 度26-28、 湿度65%-80%、 光照为2500-3000Lx、 光周期为12h光/12h暗， 35d后即可观察到 萱草绿苗发育出旺盛的根系； 0074 （6） 萱草幼苗的炼苗与移。
35、栽 0075 生根培养45d后， 将萱草幼苗的三角瓶封口膜打开炼苗， 8d后将幼苗从三角瓶中取 出， 清洗掉根部的培养基残留， 移栽入温室内， 遮荫一周后， 常规大田栽培； 0076 （7） 非二倍体萱草植株的剔除 0077 采用根尖压片法观察所得萱草植株的倍性， 统计重瓣鞭炮和金娃娃花培群体中染 色体类型植株的比例， 得到结果如下表1所示， 标记大田栽培的各染色体类型， 可以发现大 田移栽后的萱草生长到现蕾期时， 染色体类型为单倍体类型的植株普遍植株矮小， 生长缓 慢且不育， 而四倍体和非整倍体 （染色体数目大多介于二倍体和四倍体之间） 的植株发育高 大， 因此可以 0078 根据植株高度差。
36、异， 将群体植株高度后20%和前20%的植株剔除， 这样剩余的萱草 花培植株基本为二倍体植株。 0079 0080 将通过本发明得到的萱草花培植株进行萱草病毒检测， 检测的病毒为萱草常染病 毒-黄瓜花叶病毒和百合潜隐病毒， 共调查重瓣鞭炮和金娃娃花培植株各80株， 重瓣鞭炮和 金娃娃花培群体的脱毒比例如下表2。 0081 0082 由表2可以发现， 本发明的萱草种质脱毒复壮方法基本可以达到完全脱毒的效果。 我们对脱毒萱草的大田栽培也发现， 萱草脱毒苗普遍较未脱毒萱草植株生长发育快， 开花 早， 花朵数量多， 花蕾更大， 而且花色更加鲜艳， 因此本发明的萱草种质脱毒复壮方法可以 极大的提升萱草种质， 而且本发明技术成本较低， 易于产业化推广。 因此， 本发明对优质萱 草的培育具有重要的产业化价值。 0083 上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点， 并不能以此限制本发明的 保护范围。 凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰， 都应该涵盖在本发明的保护范围 说 明 书 5/6 页 8 CN 105941153 B 8 之内。 说 明 书 6/6 页 9 CN 105941153 B 9 。