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1、(10)授权公告号 CN 101548646 B (45)授权公告日 2011.12.07 CN 101548646 B *CN101548646B* (21)申请号 200910072102.3 (22)申请日 2009.05.25 A01H 4/00(2006.01) A01G 31/00(2006.01) (73)专利权人 东北林业大学 地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴 路 26 号 专利权人 由香玲 (72)发明人 由香玲 詹亚光 代金玲 谭啸 尹静 范桂枝 曾凡锁 齐凤慧 (54) 发明名称 一种通过体细胞胚及次生体细胞胚发生途径 快繁龙牙楤木的方法 (57) 摘要 本。
2、发明提供了一种通过体细胞胚和次生体细 胞胚发生途径快繁龙牙楤木的方法。本发明以龙 牙楤木幼苗的叶子、 叶柄和根段为外植体， 在 IBA 浓度分别为 3.0mg/L、 2.0mg/L、 0.3mg/L 和 2蔗 糖的 SH 培养中暗培养 35 天， 三种外植体的体细 胞胚诱导率都可达到 100， 且平均每个外植体 都产生较多的体细胞胚数 (8.6-11.3 个 )。蔗糖 浓度和 IBA 都可以影响次生体细胞胚的产生， 在 3.0mg/L IBA+2蔗糖 +SH 培养基的培养条件下， 中暗培养 4 周后， 100的体细胞胚上都有次生体 细胞胚生成。将获得的成熟初生体细胞胚和次生 体细胞胚转入无激素。
3、的 WPM 培养基中， 都可迅速 萌发生长为小苗。 约5cm的健壮小苗移栽土壤中， 成活率可达 89。本发明提供的培养简单、 再生 周期短、 可持续获得再生植株的方法， 可用于龙牙 楤木苗木产业化生产。 (51)Int.Cl. 审查员 岑喆鑫 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 CN 101548646 B1/1 页 2 1. 一种通过初生体细胞胚和次生体细胞胚发生途径快繁龙牙楤木的方法， 其特征在 于 ： 以萌发无菌实生苗的叶盘、 叶柄、 根段为外植体诱导初生体细胞胚， 再利用初生体细胞 胚为材料， 继续诱导次生体细胞胚发。
4、生， 然后使诱导的初生和次生体细胞胚萌发、 生长， 最 后移栽到土壤中， 完成植株的再生过程 ； 所述的初生体细胞胚诱导方法为 ： 添加 2蔗糖和 IBA 的 SH 培养基为基本培养条件 下， 叶盘、 叶柄、 根段三种外植体分别在 3.0、 2.0、 0.3mg/L 浓度的 IBA 培养 5 周， 体细胞胚的 诱导达到最佳 ； 所述的次生体细胞胚诱导方法为 ： 约1cm长的成熟初生体细胞胚在3.0mg/L IBA+SH 培养基 +2蔗糖条件下培养 4 周， 次生体细胞胚诱导最佳 ； 所述的无菌实生苗为种子层积 4 个月后， 选择开荚的、 合子胚发育成熟的种子， 在超净 工作台中利用常规消毒处理。
5、后取出合子胚， 接种于事先准备好的 1/2MS 培养基中， 使胚萌 发长成无菌小苗 ； 所述的培养环境是在温度2426， 光照强度10001500Lx， 光/暗周期16h/8h， 湿 度 60 70。 权 利 要 求 书 CN 101548646 B1/5 页 3 一种通过体细胞胚及次生体细胞胚发生途径快繁龙牙楤木 的方法 技术领域 0001 本发明设及一种通过初生体细胞发生及其次生体细胞发生的方式， 简单快速无性 繁殖龙牙楤木的方法。 主要是利用一种外源激素(IBA)， 从幼苗的叶片、 叶柄、 根诱导产生初 生体细胞， 再以初生体细胞胚为材料诱导次生体细胞胚， 获得大量再生苗。 本发明属于农。
6、业 生物技术领域。 0002 背景技术 0003 龙牙楤木 (Aralia elate Seem.)， 属五加科楤木属的小乔木， 是一种食药两用的 植物。 其嫩芽含有人体必需的各种氨基酸和微量元素， 是一种很好的保健食品， 也是我国主 要出口创汇的野菜品种之一 赵恒田等， 农业系统科学与综合研究， 2004。龙牙楤木也是 一种重要的药物资源。其提取物具有抗炎、 镇静、 利尿、 强心、 免疫和防癌等作用， 对人类的 肿瘤、 衰老、 心血管病等退行性疾病的治疗和预防有重要意义。近年来， 由于龙牙楤木国内 外食、 药市场需求的增长， 掠夺性采挖严重， 加上其自然繁殖率低等原因， 导致其野生资源 数量。
7、非常有限。 0004 研究者们对龙牙楤木有性和无性繁殖都进行了大量研究。 龙牙楤木种子具有休眠 的特性， 自然发芽大约需6个月， 其繁殖率较低。 人工对其种子进行催熟处理， 至少也需要3 个月时间种子才能开夹成熟。且种子繁殖变异率较大， 商品性降低。对无性繁殖方法 - 扦 插法， 其育苗成活率低， 成本高 赵恒田等， 中国农学通报， 2008。而且传统的种子繁殖与 枝条扦插繁殖， 往往造成资源的浪费与植被的破坏。因此， 为了提供大量质龙牙楤木种苗， 许多研究者对其组培快繁技术进行了研究。龙牙楤木已经从两个途径获得再生苗 ： 器官发 生和体细胞胚发生。器官发生主要是以龙牙楤木的茎尖、 幼叶、 嫩。
8、茎、 休眠芽为外植体， 附 加不同种类和浓度的植物生长调节物质诱导愈伤组织、 丛生芽、 生根小苗而形成再生植株 曲芳等， 中国蔬菜， 2002 ； 秦亚平等， 安徽农业科学， 2004。该植株再生方式过程相对繁 琐， 变异性大。而体细胞胚发生再生途径相对简单， 变异性低。姬惜珠等 中国农学通报， 2005 利用龙牙楤木一年生幼茎和根为外植体， 添加植物生长调节物质 (2， 4-D) 诱导胚性 愈伤组织， 然后通过调整外源激素的种类和浓度诱导细胞分化、 体细胞胚发生、 发育， 大约 75 天获得了体细胞胚再生植株。本发明中， 我们通过体细胞胚发生途径获得再生植株的方 法过程更简单， 所需时间更短。
9、 (35 天 )， 而且次生体细胞胚能够持续地获得再生植株， 极大 地提高植物再生效率， 为龙牙楤木育种和苗木规模化生产奠定了基础。 0005 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种更简单， 效率更高的龙芽楤木无性繁殖方法 - 体细胞 胚发生和次生体细胞胚方式。 该发明为龙芽楤木进一步的分子育种、 规模化生产奠定基础。 0007 本发明主要是涉及诱导龙芽楤木体细胞胚发生和获得大量次生体细胞胚的组织 培养方法， 包括外植体种类、 外源植物生长调节物、 培养基组成等。 0008 具体的技术路线包括以下几个部分的内容 ： 0009 1、 龙牙楤木体细胞胚的诱导 ： 说 明 书 CN 101548。
10、646 B2/5 页 4 0010 1) 将龙牙楤木种子进行层积， 使其中的合子胚成熟 0011 2) 用常规方法消毒种子后， 取出其成熟的合子胚接种于 1/2MS 培养基中进行萌 发。一周后以萌发小苗的叶子、 叶柄、 根段为外植体， 于 SH+IBA(0.3-5.0mg/L)+ 蔗糖 (2 ) 的培养基中诱导体细胞胚发生。暗培 3 周后， 产生不定根， 再过两周体细胞胚很快形成。直 接形成子叶胚。 统计发现， 适合不同外植体诱 导体细胞胚的最佳IBA浓度分别为3.0mg/L， 2.0mg/L， 0.3mg/L 0012 3) 体细胞胚的萌发 ： 将体细胞胚转移至无激素的 WPM 培养基， 进。
11、行光培养， 其迅速 萌发生长 0013 4) 体胚苗的移栽 ： 将生长约为 5cm 的健壮小苗， 移栽至 1 1 的沙子和草炭土中。 放置在温室中。4 周后， 其移栽成活率为 89 0014 2、 次生体细胞胚的生成 ： 我们在进行体细胞胚萌发苗培养过程中， 发现有少量的 次生体细胞胚生成， 因此进行详细考察了蔗糖浓度(1-7)和IBA(0.3-4.0mg/L)处理对次 生体细胞胚生成的影响， 目的是提高无性繁殖的效率。 在次生体细胞胚诱导过程中， 可观察 到不同发育时期的体细胞胚。通过组织切片和电子显显微镜扫描， 也证实了次生体细胞胚 的形成。形成的次生体细胞胚转移至无激素的 1/2WPM 。
12、培养基中， 次生体细胞胚迅速萌发， 形成小苗。经过土壤移栽， 其成活率与初生体细胞胚苗无显著差异。 0015 本发明中所用的培养基都是按常规处理 ( 调整 pH 值为 5.8， 经过高温高压灭菌 (121、 1.5 个大气压、 15 分钟 ) 后使用的。 0016 本发明的培养环境是在常规组织培养室 ( 温度 24 26， 光照强度 1000 1500Lx， 光 / 暗周期 16h/8h， 湿度 60 70 ) 中进行的。 0017 本发明的技术特征 ： 0018 1)适合叶子、 叶柄和根段的诱导体细胞胚的最佳IBA浓度分别为3.0mg/L， 2.0mg/ L， 0.3mg/L 0019 2)。
13、 次生体细胞胚形成较高的处理是 3.0mg/L IBA 0020 3) 获得体细胞胚和次生体细胞胚的操作更简单 0021 4) 可以持续不断的获得次生体细胞胚， 持续地形成再生植株 附图说明 0022 附图 1 叶子、 叶柄、 根段为外植体诱导体细胞胞胚 ( 比例尺为 1cm)。A1、 A2、 A3 ： 分 别为叶子、 叶柄、 根段培养 2 周后产生的不定根 ； B1、 B2、 B3 ： 分别为三种外植体继续培养 3 周后产生的体细胞胚 ； C ： 根段诱导的体细胞胚放大图 ； D ： C 中体细胞胚的分离图 0023 附图 2 从体细胞胚上生成的次生体细胞胚 ( 比例尺为 1mm) 0024。
14、 附图3通过电子显微镜扫描观察到的次生体细胞胚(A)和由组织切片观察到的球 形胚 (B) 0025 附图 4 体细胞胚萌发生长为小苗 (A)( 比例尺为 1cm)、 移栽前长成的小苗 (B)( 比 例尺为 1cm) 和移栽 4 周后的小苗 (C)( 比例尺为 5cm) 具体实施方式 0026 实例 1 龙芽楤木体细胞胚发生的诱导及其植株的再生 说 明 书 CN 101548646 B3/5 页 5 0027 1) 材料来源及层积处理 0028 龙芽楤木种子采自黑龙江省林业多种经营研究所 ( 牡丹江市 ) 种子园。由于龙芽 楤木成熟的果实中， 合子胚没有发育成熟， 所以种子发芽存在休眠， 要打破。
15、休眠， 必须进行 合子胚后熟处理。我们用的处理方法是层积处理， 即将种子先经过简单的消毒处理后与湿 沙混合， 置于 4冰箱中。 0029 2) 无菌实生苗的获得 0030 种子层积 4 个月后， 选择开荚的、 合子胚发育成熟的种子， 在超净工作台中利用常 规消毒处理后取出合子胚， 接种于事先准备好的1/2MS培养基中， 使胚萌发长成无菌小苗。 0031 3) 体细胞胚的诱导 0032 小苗萌发一周后， 切割 11cm 叶盘、 1cm 叶柄和 1cm 根段作为外植体， 接种于含有 IBA(0.3-5.0mg/L) 和蔗糖 (2 ) 的 SH 培养基中暗培养。每个处理重复培养 5 个培养皿， 每个。
16、培养皿放置 7 个外植体。3 周后， 外植体出现了不定根。再过 2 周， 体细胞胚由根部直 接形成子叶胚， 观察不到中间发育过程。 0033 利用统计学软件 spss 分析统计的结果 ( 见下表 ) 发现， IBA 能有效的从叶子、 叶 柄和根段上诱导体细胞胚， 诱导率达到 100， 但不同的外植体适合的 IBA 浓度不同， 分别 为 3.0mg/L， 2.0mg/L， 0.3mg/L。 0034 IBA 对不同外植体体细胞胚诱导的影响 0035 说 明 书 CN 101548646 B4/5 页 6 0036 注 ： Turkey 多重比较。相同字母为相差不显著。 0037 5) 体细胞胚的。
17、萌发、 成苗和移栽 0038 上述形成的成熟子叶胚， 转到不加任何生长调节剂的 1/2WPM 培养基中进行光培 养。体细胞胚迅速萌发成小苗。2 周后长成约 5cm 的小苗， 经过 5-7 天的练苗， 移入草炭土 与沙子之比为 1 1 的土壤中， 放入温室。4 周后的它们的成活率为 89 0039 实例 3 次生体细胞胚发生的诱导及其植株再生 0040 1) 次生体细胞胚的诱导 0041 选取长度约 1cm 的体细胞胚， 接种于含有不同浓度的蔗糖 (1-7 ) 的 SH 培养基 中， 和含有不同浓度 (0.2-3.0mg/L) 的 IBA 及 2蔗糖的 SH 培养基中诱导次生体细胞胚。 每个处理。
18、包含 5 个培养皿， 每个培养皿接种 12 个外植体。暗培养条件。 0042 4 周后， 由统计结果 ( 见下表 ) 显示， IBA 比蔗糖更能促进次生体细胞胚的形成， 其 最佳浓度为 3.0mg/L。 0043 蔗糖和 IBA 对次生体细胞胚发生的影响 0044 说 明 书 CN 101548646 B5/5 页 7 0045 2) 次生体细胞胚形成及其观察 0046 在次生体细胞胚形成过程中， 可观察到处于不同发育时期的体细胞胚， 通过组织 切片和电子显微镜进一步确认了次生体细胞胚的形成。 。 0047 3) 体细胞胚的萌发、 成苗和移栽 0048 将形成的次生体细胞胚移入无激素的 1/2SH 培养基中， 未发育成熟的体细胞胚都 能发育成熟， 达到子叶胚时期。将成熟的子叶次生体细胞胚转接于无激素的 WPM 培养基中， 次生体细胞胚迅速萌发， 形成小苗。 移栽土壤和生长条件与初生体细胞胚苗相同， 其成活率 与初生体细胞胚苗无显著差异。 说 明 书 CN 101548646 B1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 101548646 B2/3 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101548646 B3/3 页 10 图 4 说 明 书 附 图 。