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1、(10)申请公布号 CN 104126432 A (43)申请公布日 2014.11.05 CN 104126432 A (21)申请号 201410333695.5 (22)申请日 2014.07.14 A01G 7/00(2006.01) (71)申请人 武汉市蔬菜科学研究所 地址 430345 湖北省武汉市黄陂武湖农业生 态园市农科院蔬菜所 (72)发明人 张敏 谈太明 徐长城 谈杰 黄树苹 王春丽 (74)专利代理机构 北京方圆嘉禾知识产权代理 有限公司 11385 代理人 董芙蓉 (54) 发明名称 茄子褐纹病抗性的快速鉴定方法 (57) 摘要 本发明公开了茄子褐纹病抗性的快速鉴定方。
2、 法， 包括下述步骤 ： 1) 将茄子褐纹病菌株接种在 培养基上进行活化， 然后接种于新的培养基， 取培 养好的菌块用于接种 ； 2) 在待测茄子果实样品上 划出伤口， 将菌块从伤口中平放入茄子果实表皮 下进行接种， 用无菌脱脂棉球覆盖伤口表面， 然后 在茄子果实表面喷洒无菌水并用保鲜膜封口进 行保湿 ； 3) 在室温下放置保湿的茄子果实， 然后 用十字交叉法统计茄子果实表皮的病斑直径 d1、 d2， 并计算病斑面积， 根据病斑面积大小划分该茄 子对褐纹病的抗性水平。本发明的方法能够在室 内快速完成茄子褐纹病抗性鉴定， 该方法操作简 单， 周期短， 并且室内操作易于控制接种环境条 件。 (51。
3、)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104126432 A CN 104126432 A 1/1 页 2 1. 茄子褐纹病抗性的快速鉴定方法， 其特征在于包括下述步骤 ： 1) 将茄子褐纹病菌株 接种在培养基上进行活化， 然后接种于新的培养基， 取培养好的菌块用于接种 ； 2) 在待测 茄子果实样品上划出伤口， 将菌块从伤口中平放入茄子果实表皮下进行接种， 用无菌脱脂 棉球覆盖伤口表面， 然后在茄子果实表面喷洒无菌水并用保鲜膜封口进行保湿 ； 3) 在室温 下放置。
4、保湿的茄子果实， 然后用十字交叉法统计茄子果实表皮的病斑直径 d1、 d2， 并计算病 斑面积， 根据病斑面积大小划分该茄子对褐纹病的抗性水平。 2. 根据权利要求 1 的快速鉴定方法， 其特征在于步骤 1) 采用的培养基为 PDA 培养基， 在 25培养箱中黑暗培养活化至少一代。 3. 根据权利要求 2 的快速鉴定方法， 其特征在于培养活化三代， 将活化好的菌株接种 到新的 PDA 培养基。 4.根据权利要求1的快速鉴定方法， 其特征在于步骤1)菌块的选取方法为将活化后的 菌株接种于新的培养基， 待菌株菌丝生长至培养皿边缘时用直径为 10mm 的打孔器打取菌 落边缘的菌块。 5. 根据权利要。
5、求 1 的快速鉴定方法， 其特征在于步骤 2) 伤口的长度与接种的菌块一 致。 6. 根据权利要求 5 的快速鉴定方法， 其特征在于步骤 2) 伤口的长度为 10mm。 7. 根据权利要求 1 的快速鉴定方法， 其特征在于步骤 3) 室温下放置保湿约 10 天。 8. 根据权利要求 1 的快速鉴定方法， 其特征在于步骤 3) 的病斑面积 S 按照公式 S 3.14*d1*d2/4 计算。 9.根据权利要求1的快速鉴定方法， 其特征在于还包括在步骤1)前对茄子果实进行预 处理的步骤， 包括将生长旺盛健康的茄子果实表面清洗干净并去除萼片， 然后进行酒精消 毒和紫外杀菌。 权 利 要 求 书 CN 。
6、104126432 A 2 1/3 页 3 茄子褐纹病抗性的快速鉴定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种病害抗性的鉴定方法， 尤其涉及茄子的褐纹病抗性的快速鉴定方 法， 属于农业生物学领域。 背景技术 0002 茄 子 (Solanum melongena) 作 为 一 种 世 界 性 的 蔬 菜， 经 常 遭 受 褐 纹 病 菌 (Phomopsis vexans) 的严重危害， 近几年我国几乎所有栽培茄子的地区都有该病大量发生 的报道。 众多的研究表明， 针对该病菌的防治方法中化学防治的前景并不理想， 最经济有效 的措施还是培育高抗褐纹病品种。 0003 在这之中， 研发人员面临了一个。
7、严峻的问题就是如何快速鉴定选育的新茄子品种 是否具有茄子褐病抗性。传统的方法是通过至少一年 ( 通常是连续 2-3 年 ) 的田间病圃自 然诱发病害进行茄子品种抗性分析， 据此来完成一个品种的抗性鉴定。 ， 该方法不仅费时费 力， 且由于环境变化、 栽培条件等一些因素导致抗性鉴定重复间出现较大差异， 从而影响抗 性的真实性。目前已有一些关于室内接种鉴定茄子褐纹病的方法， 但都没有具体的操作方 法和鉴定标准， 不能系统的完成抗性鉴定工作。 发明内容 0004 针对现有技术的缺陷， 本发明公开了一种茄子褐纹病抗性的快速鉴定方法， 是一 种在室内环境下短时间内即可进行的鉴定方法， 能够用于茄子抗褐纹。
8、病抗源的筛选， 该方 法操作简单， 周期短 ( 一股在一个月内即可完成 )， 采用室内操作易于控制接种环境条件， 为茄子褐纹病抗性鉴定提供了一种新的快速有效的途径。 0005 为实现上述目的， 本发明是通过下述技术方案实现的 ： 0006 茄子褐纹病抗性的快速鉴定方法， 包括下述步骤 ： 1) 将茄子褐纹病菌株接种在培 养基上进行活化， 然后接种于新的培养基， 取培养好的菌块用于接种 ； 2) 在待测茄子果实 样品上划出伤口， 将菌块从伤口中平放入茄子果实表皮下进行接种， 用无菌脱脂棉球覆盖 伤口表面， 然后在茄子果实表面喷洒无菌水并用保鲜膜封口进行保湿 ； 3) 在室温下放置保 湿的茄子果实。
9、， 然后用十字交叉法统计茄子果实表皮的病斑直径 d1、 d2， 并计算病斑面积 S， 根据病斑面积大小划分该茄子对褐纹病的抗性水平。 0007 其中， 步骤 1) 采用的培养基为 PDA 培养基 ( 马铃薯去皮 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂粉 12g， 用蒸馏水定容 1000m1)， 茄子褐纹病菌株于 25培养箱中黑暗培养活化至少一代。将 活化好的菌株接种到新的 PDA 培养基上。 0008 接种菌块原则上需要待菌株菌丝生长至培养皿边缘时取离菌落中心相等的位置 用直径为 10mm 的打孔器打取菌块。 0009 为了避免由于接种菌株致病力差异导致鉴定结果不准确， 本发明在实施鉴定前进 行了。
10、茄子褐纹病强致病力菌株的筛选， 分别于不同地区采集茄子病果进行病原分离鉴定， 然后将病原菌株接种于不同品种茄子果上观察发病情况， 取发病最为严重的 2 个强致病力 说 明 书 CN 104126432 A 3 2/3 页 4 菌株进行后续接种实验。 0010 在步骤 2) 中， 在茄子果实样品表皮划出的伤口长度与菌块的大小一致， 以便放入 菌块， 因此伤口的长度为 10mm。接种时菌块菌丝面朝向茄子果里面。 0011 在本发明中， 步骤 3) 室温下放置保湿培养 10 天。病斑面积 S 按照公式 S 3.14*d1*d2/4 计算。 0012 其中， 采用本发明的方法， 茄子褐纹病抗性分级标准。
11、如下表 1 所示 ： 0013 表 1 ： 茄子褐纹病菌抗性的划分标准 0014 0015 该分级标准制定方法是 ： 将 2 个强致病力菌株分别进行接种试验， 由于不同茄子 品种对不同致病菌株会出现不同抗性， 为严格筛选抗性资源， 每个茄子品种接种后取病斑 面积较大的一组数据作为该品种的抗性鉴定依据。 将获得的大量的不同茄子品种发病数据 进行聚类分析， 并结合实际发病情况， 确定了上述划分标准， 采用上述划分标准与采用传统 的田间病圃发病统计分析的结果是一致的。 0016 进一步的， 本发明的快速鉴定方法还包括在步骤 1) 前对茄子果实进行预处理的 步骤， 包括将生长旺盛健康的茄子果实表面清洗。
12、干净并去除萼片， 然后进行酒精消毒和紫 外杀菌。 0017 通过上述步骤， 能够防止其它杂物和病虫害对鉴定结果的影响。 0018 申请人在研究过程中进行的大量实验证实， 本发明的鉴定方法能够准确、 快速的 鉴定茄子褐纹病菌株抗性， 该方法操作简单， 周期短， 易于控制接种环境条件， 适合大规模 推广使用。 具体实施方式 0019 种植不同类型的茄子种质资源共 50 余份， 正常栽培管理， 待结果盛期取正常商品 果进行室内接种试验， 分别用两个强致病力菌株 ( 编号 PV-F2、 PV-F5) 进行接种， 十天后观 察并测定试验结果， 取致病力强的菌株发病数据作为该品种最后试验结果， 每个品种至。
13、少 重复试验 2 次， 根据表 1 茄子褐纹病抗性分级标准进行品种抗性鉴定。连续进行两年试验， 最后抗性结果取两年平均。 0020 具体实验方法如下 ： 0021 1. 首先采集各个品种的正常商品茄子果实， 每个品种随机取 10 个茄子果实， 用清 水将表面清洗干净， 并去除萼片， 然后用 75酒精进行表面消毒， 并于无菌操作台中用紫外 灯照射 30 分钟然后晾干 ； 0022 2. 将茄子褐纹病菌的强致病力菌株 PV-F2、 PV-F5 分别接种在 PDA 培养基上于 说 明 书 CN 104126432 A 4 3/3 页 5 25培养活化三代， 然后接种于新的 PDA 平板中央， 待菌丝。
14、生长至培养皿边缘时用 10mm 打 孔器打取菌落边缘菌块用于接种 ； 0023 3. 将步骤 1 中准备好的待鉴定茄子果实平放于洁净的托盘上， 用灭菌的手术刀在 茄子果上划出约10mm长度的伤口， 将步骤2中准备的接种菌块从伤口中平放入茄子果表皮 下进行接种， 菌丝面朝向茄子果内面， 并用无菌脱脂棉球覆盖伤口表面上， 然后在茄子果表 面喷洒无菌水并用保鲜膜封口进行保湿， 于 25下放置 10 天后用 “十字交叉” 法统计病斑 直径 d1、 d2。以空白琼脂块接种茄子为对照， 每个品种重复 5 次 ； 0024 4. 按照表 1 的划分方法以病斑面积大小进行抗性划分， 病斑面积按照公式 S 3.14*d1*d2/4 进行计算。 0025 5. 根据表 1 中分级标准进行抗性分级。 0026 6. 第二年重复试验一次， 参照第一年试验结果进行比较分析， 最终确定品种抗性 水平。 0027 根据两年试验结果显示， 不同茄子品种能够很好的进行抗性划分， 试验结果可重 复性高， 结果比较稳定一致， 并且与田间观察的各个茄子品种实际抗性水平一致。 0028 由上述实验可见， 本发明的快速鉴定方法能够快速准确、 简易有效、 低成本的鉴定 茄子品种对褐纹病菌的抗性， 适于大规模推广使用。 说 明 书 CN 104126432 A 5 。