一种促进伤口愈合酸奶的制备方法.pdf

《一种促进伤口愈合酸奶的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种促进伤口愈合酸奶的制备方法.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710402793.3 (22)申请日 2017.06.01 (83)生物保藏信息 CGMCC No.8211 2013.09.17 CGMCC No.8213 2013.09.17 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风华路 818号 (72)发明人 刘明学 曾小群 潘道东 吴振 孙洁 孙杨赢 曹锦轩 向宛倩 (74)专利代理机构 宁波奥圣专利代理事务所 (普通合伙) 33226 代理人 何仲 (51)Int.Cl. A23C 9/123(20。

2、06.01) A23C 9/133(2006.01) (54)发明名称 一种促进伤口愈合酸奶的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种促进伤口愈合酸奶的制 备方法， 特点是包括将奶粉与温水按质量比15： 100的比例混合后灭菌得到复原乳的步骤； 将西 红柿汁、 菠菜汁、 艾叶汁、 黑豆浆汁和蜂蜜水按等 比例混合的步骤； 将复原乳与混合浆汁按体积比 3： 1比例充分混合均匀均质杀菌； 在混合发酵原 料中按质量比0.1%0.11%的接种量加入酸奶发 酵剂菌粉， 然后按质量体积比12%的接种量加 入干酪乳杆菌XS1以及质量体积比12%的接种 量加入植物乳杆菌RUB1发酵剂， 搅拌5 min后， 装 。

3、入经高压蒸汽灭菌后的瓶中封口发酵， 优点是能 提高机体免疫避免伤口感染， 抗氧化， 促进造血， 促进伤口细胞分裂生长、 延长酸奶保质期。 权利要求书1页 说明书8页 CN 107279286 A 2017.10.24 CN 107279286 A 1.一种促进伤口愈合酸奶的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： （1） 复原乳的制作： 将奶粉与6070的温水按质量比15： 100的比例混合后， 充分搅拌 溶解， 进行巴氏灭菌， 得到复原乳； （2） 混合浆汁的制备： 将西红柿汁、 菠菜汁、 艾叶汁、 黑豆浆汁和蜂蜜水按质量比1： 1： 1： 1： 1混合形成混合浆汁， 充分搅拌均匀； （3） 混。

4、合液制备： 将复原乳与混合浆汁按体积比3： 1比例充分混合均匀后， 再加入复原 乳质量67的白砂糖， 搅拌均匀得到混合液； （4） 均质杀菌： 将混合液加入到高压均质机中， 控制混合液温度为65-75， 均质压力为 15-25Mpa； 将均质过的混合液于9095高温杀菌， 保持5min， 得到混合发酵原料； （5） 功能性发酵剂的制备： 分别将保藏于-40冰箱中的干酪乳杆菌XS1和植物乳杆菌 RUB1菌种， 放于室温解冻， 按质量体积比1%的接种量加入灭菌后的MRS液体培养基中， 置于 37培养箱中静置培养8 h， 得到中间发酵剂； 再吸取中间发酵剂以质量体积比2%的接种量 加入灭菌后的MRS。

5、 液体培养基中， 置于37培养箱中静置培养8 h， 即分别得到干酪乳杆菌 XS1发酵剂和植物乳杆菌RUB1发酵剂； （6） 接种： 在步骤 （4） 得到的混合发酵原料中按质量比0.1%0.11%的接种量加入酸奶 发酵剂菌粉， 然后按质量体积比12%的接种量加入干酪乳杆菌XS1以及质量体积比12% 的接种量加入植物乳杆菌RUB1发酵剂， 搅拌5 min后， 装入经高压蒸汽灭菌后的瓶中封口； （7） 发酵： 在42的恒温培养箱中静置发酵45h， 停止发酵后 ， 于05下冷藏， 即得 到促进伤口愈合的酸奶。 2.根据权利1所述的一种促进伤口愈合酸奶的制备方法， 其特征在于： 步骤 （2） 所述的 西。

6、红柿汁的制备过程为选取新鲜西红柿洗净切块， 用榨汁机榨汁3分钟， 经8层纱布过滤后 获得西红柿汁； 所述的菠菜汁的制备过程为选取新鲜的菠菜洗净切碎， 用榨汁机榨汁3分 钟， 经8层纱布过滤后获得菠菜汁； 所述的艾叶汁的制备过程为选取新鲜的艾叶洗净， 用榨 汁机榨汁3分钟， 经8层纱布过滤获得艾叶汁； 所述的黑豆浆的制备过程为选择颗粒饱满且 无杂质的黑豆， 用浓度0.5wt的NaHCO3溶液20浸泡1012 h后， 将黑豆用温度为80、 浓度为0.5wt的NaHCO3溶液漂烫10min， 迅速冷却， 脱去种皮， 按黑豆与水的质量比为1： 3 的比例， 磨浆得黑豆浆， 再将黑豆浆煮沸5分钟， 最后。

7、将黑豆浆用8层纱布过滤； 所述的蜂蜜 水的制备过程为将品质良好的蜂蜜取50mL加150mL的温开水化开。 3.根据权利1所述的一种促进伤口愈合酸奶的制备方法， 其特征在于： 步骤 （6） 中所述 的酸奶发酵剂菌粉由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按质量比1： 1的比例混合而成。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107279286 A 2 一种促进伤口愈合酸奶的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种酸奶， 尤其是涉及一种促进伤口愈合酸奶的制备方法。 背景技术 0002 创伤愈合是指机体遭受外力作用， 皮肤等组织出现离断或缺损后的愈复过程， 为 包括各种组织的再生和肉芽组织增生、 瘢痕组。

8、织形成的复杂组合， 表现出各种过程的协同 作用。 一般小伤口会很容易愈合， 但对于这些伤口较大同时伴随失血较多等情况， 病人或伤 者身体抵抗力恢复力下降致使伤口难以愈合甚至被感染。 所以快速便捷的补充一些营养物 来提高身体的抵抗力恢复能力尤为重要。 在术后病人一般很虚弱难以通过正常的饮食来补 充相应的营养物质， 这时就需要一种便捷易吸收并富含所需营养的流体食品来促进病人的 伤口恢复。 0003 针对术后病人伤口难以愈合的特点， 可以补充蛋白质、 糖类、 脂质、 维生素 （C、 A、 B2 等） 、 微量元素 （锌、 铁、 钙等） 来促进造血提高免疫力， 促进细胞分裂生长， 防止伤口感染最 终达。

9、到促进伤口愈合的目的。 蛋白质类物质、 糖类、 脂质都是细胞生长代谢分裂过程中不可 缺少的营养物质。 维生素、 微量元素在调解人体代谢免疫方面具有很好的作用。 当然锌、 铁、 钙等微量元素也是细胞的重要组成物质， 具有促进细胞生长的功能。 这些营养物也是身体 产生血液不可或缺的， 而人体免疫力和血液有着很大的联系。 在酸奶中加入这些物质含量 高的原料无疑可以加快伤口周围细胞的分裂生长， 进而促进伤口愈合。 0004 番茄能清热止渴， 养阴凉血、 生津止渴。 生吃能补充维生素C。 煮熟后食用， 所含的 番茄红素和其他抗氧化剂含量会显著上升， 起到降低心脏病的风险和抗衰老的作用。 可食 用部分97。

10、%。 每l00g中含能量79kJ， 水分94.4g、 蛋白质0.9g、 脂肪0.2g， 膳食纤维0.5g， 碳水 化合物3.5g、 胡萝 卜素550 g、 视黄醇当量92 g、 硫胺素0.03mg、 核黄素0.03mg、 尼克酸0.6mg； 维生素19mg， 维生素E 0.57mg； 钾163mg、 钠5mg、 钙10mg、 镁9mg， 铁0.4mg， 锰0.08mg、 锌 0.13mg、 铜0.06mg， 磷2mg； 硒0.15 g。 且含腺嘌呤、 胆碱、 番茄碱以及抗炎、 利尿、 降压的成 分。 0005 菠菜为苋科植物菠菜的带根全草， 菠菜有润肺滑肠、 清热除烦的功效。 菠菜营养成 分极。

11、其丰富， 菠菜叶含锌5668mg/Kg(干重)， 叶酸1.22ug/g， 氨基酸和叶黄素、 -胡萝 卜素、 新- -胡萝 卜素B、 新- -胡萝 卜素。 菠菜素U等类胡萝 卜素、 还含 -菠菜甾醇、 胆甾醇以及甾醇酯 和甾醇甙、 万寿菊素、 菠叶素， 和一种青紫色萤光物质2-乙酰基-3-对羟基苯丙烯酰基内消 旋酒石酸。 菠菜含水分、 碳水化合物、 蛋白质、 脂肪、 膳食纤维、 胡萝 卜素、 维生素B1、 维生素 B2、 维生素C、 钾、 钠、 钙、 磷、 铣、 镁等营养元素。 菠菜还可以促进人体健康， 防止衰老， 防治缺 铁性贫血;菠菜中的维生素C和叶酸含量丰富， 可以增强产妇对铁元素的吸收力。

12、， 是缺铁性 贫血的理想食物， 菠菜中的膳食纤维能起到很好的通便作用。 菠菜具有促进培养细胞增殖 的作用。 菠菜中所含的胡萝 卜素， 在人体内转变成维生素A， 能维护正常视力和上皮细胞的健 康， 增加预防传染病的能力。 0006 研究发现， 每100克黑豆中： 水分9.9g、 灰分： 4 .6g、 维生素E(T)1736mg、 锌4.8mg、 说 明 书 1/8 页 3 CN 107279286 A 3 热量381KJ、 膳食纤维10.2g、 钙： 224mg、 硒6.79ug、 能量1594KJ、 胡萝 卜素30mg、 磷500mg、 铜 156mg、 蛋白质36g、 硫胺素ug、 钾137。

13、7mg、 锰2 .83mg、 脂肪15.9g、 核黄素0.33 mg、 钠3mg、 铁 7mg、 碳水化合物33.6mg、 尼克酸2mg、 镁243mg、 维生素A5 mg， 含粗脂肪高达12g以上， 检测发 现其中含有至少19种脂肪酸， 而且不饱和脂肪酸含量竟然高达80%， 其中亚油酸含量就占了 约55. 08%。 亚油酸作为不饱和脂肪酸的一种， 是人体中十分重要的必须脂肪酸， 对胆固醇 代谢具有至关重要的调节作用， 只有当胆固醇与亚油酸结合时才能在体内转运而进行正常 代谢。 而当亚油酸缺乏时, 胆固醇将与饱和脂肪酸结合并在人体内沉积， 导致动脉硬化的 发生。 因此， 亚油酸又有 “血管清道。

14、夫” 的美誉。 0007 蕲艾叶主要成份为乙酸乙酯、 1.8桉叶油素、 水合莰烯、 樟脑、 2松油醇、 葛缕酮等 化学物， 其精油的出油率蕲艾 （1 .06%） 为一般艾 （0.54%） 的两倍。 同时， 蕲艾含侧柏酮 （15.6%） 和异侧柏酮 （2.7%） ， 而一般艾则未见此成份。 蕲艾油有明显的平喘、 镇咳、 祛痰及清 炎作用。 现代实验研究证明， 艾叶具有抗菌及抗病毒作用， 艾草还具有散寒除湿， 调经止血 的功效， 对女性月经不调、 经痛腹痛都有一定的疗效。 0008 蜂蜜中含有果糖、 葡萄糖、 酶、 蛋白质、 维生素及多种矿物质。 常吃可以防治贫血、 心脏病、 肠胃病等， 并能提高。

15、人体免疫力。 单糖： 葡萄糖和果糖可直接被人体消化吸收。 酶 类： 各种酶能够促进人体对多种物质的消化吸收。 乙酰胆碱： 消除疲劳、 兴奋神经、 提高记忆 力。 黄酮： 抗氧化， 提高机体免疫力。 蜂蜜是被广泛认知的天然营养食品。 试验表明， 蜂蜜中 含有与人体血清浓度相似的各种无机盐， 如铁、 钙、 铜、 锰、 钾、 磷等， 还有多种维生素和有机 酸， 因此蜂蜜被称为 “血清之王” 。 此外， 蜂蜜还具有护肤美容、 抗菌消炎、 促进组织再生、 促 进长寿、 改善睡眠、 保肝作用、 抗疲劳、 促进儿童生长发育、 保护心血管、 润肺止咳等作用。 目 前， 具有促进伤口愈合功效的功能性酸奶尚未见报。

16、道。 发明内容 0009 本发明所要解决的技术问题是提供一种能提高机体免疫避免伤口感染， 抗氧化， 促进造血， 促进伤口细胞分裂生长、 延长酸奶保质期的促进伤口愈合的酸奶及其制备方法。 0010 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 一种促进伤口愈合酸奶的制备方 法， 包括以下步骤： （1） 复原乳的制作： 将奶粉与6070的温水按质量比15： 100的比例混合后， 充分搅拌 溶解， 进行巴氏灭菌， 得到复原乳； （2） 混合浆汁的制备： 将西红柿汁、 菠菜汁、 艾叶汁、 黑豆浆汁和蜂蜜水按质量比1： 1： 1： 1： 1混合形成混合浆汁， 充分搅拌均匀； （3） 混合液制备： 将复原乳。

17、与混合浆汁按体积比3： 1比例充分混合均匀后， 再加入复原 乳质量67的白砂糖， 搅拌均匀得到混合液； （4） 均质杀菌： 将混合液加入到高压均质机中， 控制混合液温度为65-75， 均质压力为 15-25Mpa； 将均质过的混合液于9095高温杀菌， 保持5min， 得到混合发酵原料； （5） 功能性发酵剂的制备： 分别将保藏于-40冰箱中的干酪乳杆菌XS1和植物乳杆菌 RUB1菌种， 放于室温解冻， 按质量体积比1%的接种量加入灭菌后的MRS液体培养基中， 置于 37培养箱中静置培养8 h， 得到中间发酵剂； 再吸取中间发酵剂以质量体积比2%的接种量 加入灭菌后的MRS 液体培养基中， 置。

18、于37培养箱中静置培养8 h， 即分别得到干酪乳杆菌 说 明 书 2/8 页 4 CN 107279286 A 4 XS1发酵剂和植物乳杆菌RUB1发酵剂； （6） 接种： 在步骤 （4） 得到的混合发酵原料中按质量比0.1%0.11%的接种量加入酸奶 发酵剂菌粉， 然后按质量体积比12%的接种量加入干酪乳杆菌XS1以及质量体积比12% 的接种量加入植物乳杆菌RUB1发酵剂， 搅拌5 min后， 装入经高压蒸汽灭菌后的瓶中封口； （7） 发酵： 在42的恒温培养箱中静置发酵45h， 停止发酵后 ， 于05下冷藏， 即得 到促进伤口愈合的酸奶。 后熟的目的以防止过酸， 促进芳香物质的产生。 00。

19、11 步骤 （2） 所述的西红柿汁的制备过程为选取新鲜西红柿洗净切块， 用榨汁机榨汁3 分钟， 经8层纱布过滤后获得西红柿汁； 所述的菠菜汁的制备过程为选取新鲜的菠菜洗净切 碎， 用榨汁机榨汁3分钟， 经8层纱布过滤后获得菠菜汁； 所述的艾叶汁的制备过程为选取新 鲜的艾叶洗净， 用榨汁机榨汁3分钟， 经8层纱布过滤获得艾叶汁； 所述的黑豆浆的制备过程 为选择颗粒饱满且无杂质的黑豆， 用浓度0.5wt的NaHCO3溶液20浸泡1012 h后， 将黑 豆用温度为80、 浓度为0.5wt的NaHCO3溶液漂烫10min， 迅速冷却， 脱去种皮， 按黑豆与 水的质量比为1： 3的比例， 磨浆得黑豆浆，。

20、 再将黑豆浆煮沸5分钟， 最后将黑豆浆用8层纱布 过滤； 所述的蜂蜜水的制备过程为将品质良好的蜂蜜取50mL加150mL的温开水化开。 0012 步骤 （6） 中所述的酸奶发酵剂菌粉由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按质量比1： 1 的比例混合而成。 0013 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本发明一种促进伤口愈合酸奶的制备方法， 首次在酸奶中添加了艾叶， 艾叶具有的抗菌作用， 而且酸奶的酸性环境可以提高艾叶中挥 发油的抗菌作用， 同时在功能性发酵剂的抑菌的双重作用下， 使酸奶的保质期延长至40- 50d； 由于蜂蜜富含有机糖类， 它的加入促进了黑豆中黄酮类物质的溶解与保护， 使得本酸 奶在促。

21、进伤口愈合的同时也具有很好的抗氧化作用。 每100mL酸奶中大约含有2.53.0mg的 Fe元素。 该酸奶促进细胞分裂提高了20%25%。 本酸奶能调解培养的巨噬细胞分泌TNF- （肿 瘤坏死因子 ） 和IL-1 （白细胞介素1 ） 的量 （P0.05） 。 具有改善便秘， 预防和治疗贫血、 增 强免疫、 抑菌抗炎， 促进伤口愈合的功效。 0014 综上所述， 本发明促进伤口愈合酸奶的制备方法， 以西红柿、 菠菜、 艾叶、 黑豆、 蜂 蜜这些食品为原料， 添加于牛奶中， 生产促进伤口愈合的酸奶， 简化了生产工艺， 最大限度 的保留的原料的营养价值， 降低了成本， 各营养物质之间又相互促进吸收提。

22、高了产品的营 养价值和经济效益。 所得到的促进伤口愈合的酸奶颜色淡黄， 质地均匀， 有黑豆的豆香、 蔬 菜艾叶的清香、 食用时能感觉到豆沙的质感， 不粗糙、 不涩口； 口感酸甜适宜， 回味有蜂蜜的 甘甜， 富含营养成分、 维生素、 微量元素能提高机体免疫避免伤口感染， 抗氧化， 促进造血， 促进伤口细胞分裂生长、 保质期延长的酸奶， 有助于伤口愈合， 减少手术或受伤病人的痛 苦。 0015 分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)， 菌株为RUB1， 保藏号为 CGMCC No.8211， 于2013年09月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心。

23、， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所。 0016 分类命名为干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)， 菌株为XS1， 保藏号为CGMCC No.8213， 于2013年09月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所。 0017 上述植物乳杆菌RUB1 （保藏编号为CGMCC No.8211） 与干酪乳杆菌XS1 （保藏编号为 说 明 书 3/8 页 5 CN 107279286 A 5 CGMCC No.8213） 具有很好的抑菌作用， 对沙门氏菌、 单增李斯。

24、特菌、 金黄色葡萄球菌、 大肠 杆菌和蜡样芽孢杆菌等致病菌有很好的抑制作用。 具体实施方式 0018 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0019 一、 实验方法 受伤后常伴有失血， 而Fe元素在造血的过程中扮演着重要的角色。 伤口的愈合的过程 中需要上皮细胞的分裂生长来实现。 一般细菌感染导致的炎症是抑制伤口愈合的重要因 素。 所以本实验通过测定酸奶中Fe元素的含量， 促进小鼠肠上皮细胞的分裂生长以及培养 的巨噬细胞分泌的炎症因子TNF- 和IL-1 的量作为检测标准来确定该酸奶的功能。 0020 1、 酸奶中Fe元素含量的测定 （1） 仪器和材料： 原子吸收分光光度计 （AA-680。

25、0日本岛津公司） ， 马弗炉， 铁元素的空心 阴极灯等。 本专利的酸奶， 普通酸奶， 双氧水， 浓硫酸， 硝酸， 超纯水， 铁元素的标准工作液等 （2） 实验检测： 在室温下用移液管移取4mL样品与干锅中， 加入4mL浓硫酸2mL双氧水， 静 置约10min,然后放在电炉上加热至冒出白烟为止。 待其冷却至5060。 再向坩埚中加入 2mL浓硫酸， 盖上坩埚盖。 将装有预处理样品的坩埚依次放入马弗炉中完全灰化。 调温至600 650， 约2h后取出， 观察坩埚中的样品是否已成纯白色的灰分， 如果是则已经完全灰化。 冷却后， 用稀硝酸充分溶解灰分， 并移入100mL容量瓶中， 用超纯水定容， 摇匀。

26、备用。 同时做 样品空白。 0021 表 1标准溶液系列 表2 仪器工作条件 注： 空气流量为8.0L/min。 0022 回收率和精密度试验： 去同一样品3份， 分别加入一定量标准溶液， 与其他标准样 品同样方法消化处理， 进行样品加标准回收率试验以检验测定结果的可靠性。 取样品重复 测定3次， 以检验方法的精密度每个样品处理完分别加上测定3次， 取其平均值为检测结果。 0023 样品中Fe元素的含量： 据仪器测定的线性范围， 适当稀释或浓缩样品溶液， 测其吸 光度。 经回归分析得出回归方程， 将测得的吸光度值代人回归方程， 计算出该样品中Fe 元 素的含量， 以5次平行测定的平均值表示样品。

27、中Fe元素的含量。 0024 2、 该酸奶对促进肠上皮细胞分裂生长的检测 （1） 细胞培养： 应用含有200mL/L胎牛血清、 青霉素-链霉素双抗液、 pH值为7.2的DMEM培 养液在37、 50mL/LCO2条件下培养小鼠肠上皮细胞， 每天换液一次； 说 明 书 4/8 页 6 CN 107279286 A 6 （2） 采用细胞计数法检测该酸奶对肠上皮细胞分裂生长的作用： 当细胞生长达融合状 态时， 消化传代， 计数， 均匀传代3瓶， 放入3750mL/LCO2孵箱培养24h， 细胞贴壁后， 在号 瓶中加入适量该酸奶， 在号瓶中加入普通酸奶， 号瓶做空白对照。 分别在第1、 2、 3、 4。

28、天 消化计数细胞。 0025 3、 培养的巨噬细胞株的TNF- 和IL-1 分泌量检测 本方案通过建立脂多糖 （LPS） 刺激巨噬细胞株RAW246.7活化的体外炎症模型来确定酸 奶的抗炎作用。 LPS的诱导， 能导致相关炎症因子如TNF- 、 IL-1 量的变化， 通过测定巨噬细 胞上清液中各种炎症因子的分泌量造模前后、 给酸奶提取物前后的变化来判定酸奶是否具 有抗感染作用。 0026 （1） 主要溶液及配制 1640培养基： 用90ml超纯水溶解13.4g DMEM干粉型培养基， 磁力搅拌使干粉完全溶 解， 加2.23g NaHCO3及3.08g Hepes， 调整pH值至7.27.4， 。

29、加水定容至1000ml， 0.22 m滤膜 过滤除菌后分装， -20保存； 0.25%的胰蛋白酶： 称取胰蛋白酶0.5g， 加入200ml PBS中， 磁力搅拌使其完全溶解， 0.22 m滤膜过滤除菌后分装， -20保存； 酸奶提取物： 取100ml酸奶进行冷冻离心 （10000r/min， 10min） ， 用0.2 m滤膜两遍, 取上清液； 仪器： Sorvall ST16R冷冻离心机 （美国Thermo Fishr Scientific公司） ； 小鼠TNF- ELISA试剂盒 （美国RD公司， 批号： 201207） ； 小鼠IL-1 ELISA试剂盒 （美国RD公司， 批 号： 20。

30、1207。 0027 （2） 细胞培养 源性巨噬细胞株RAW264.7培养于RPMI1640培养基中 （含10%新生牛血清、 100 g/ml链 霉素、 100 /ml青霉素） 。 培养条件为37， 二氧化碳浓度为5%， 连续培养； 细胞用0.25%的胰蛋白酶消化， 在镜下观察变圆后加入冷的培养基停止消化， 反复吹 打后离心取沉淀用培养基重悬， 接种于培养皿， 接种初始密度2105/ml， 培养至80%融合后 用于实验， 实验前无血清12小时处理使细胞同步化； 酸奶提取物按不同浓度加入， 预先孵育2h， 溶剂对照为DMSO， 后加入200ng/ml的LPS （终浓度） 刺激不同时间， 分别取上。

31、清液培养， 细胞用于不同指标检测。 0028 （3） MTT比色法检测 原理： MTT商名为噻唑蓝， 为淡黄色， 它可以被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原成 难溶性的蓝紫色结晶紫物甲瓒并沉积在细胞体内， 但在死细胞内MTT不能还原为蓝紫色结 晶物。 该结晶可被二甲基亚砜 （DMSO） 或酸化异丙醇等溶解后在560-610nm处有一个较宽的 最大的吸收峰， 用酶标仪可定量测定570nm处的光吸收。 由于甲瓒的生成量与线粒体琥珀酸 脱氢酶活性呈正相关， 可用光吸收度的大小反映脱氢酶活性， 从而间接反映活细胞的数量， 活细胞越多， 紫色产物越多， 则光吸收 （OD值） 越高。 0029 方法： 用9。

32、6孔板培养细胞， 按照实验分组加入不同浓度的酸奶提取物 （0.8， 4,20, 40,80 M） ， 在37、 含5%CO2的培养箱内孵育18h， 加入终浓度为0.5mg/ml的MTT， 孵育4h后， 吸弃上清液， 每孔加入二甲基亚砜 （DMSO） ， 室温振荡10min， 待紫色结晶物充分溶解， 用全自 动酶标仪读取570nm处光密度值， 每组重复5孔。 计算细胞存活率。 细胞存活率= （检测孔的OD 说 明 书 5/8 页 7 CN 107279286 A 7 值/对照孔的OD值） 100%。 0030 （4） 该酸奶对RAW264.7细胞分泌TNF- 量影响的检测 酸奶提取物按不同浓度加。

33、入 （0.8,4,20 M） ， 预先孵育2h， 其它组加入溶剂做对照， 换液 去除酸奶后加入200ng/ml的LPS （终浓度） 刺激18h， 分别取上清培养液， 置于-20保存至检 测。 每个标本做复孔测定。 测定步骤如下： 每孔加入样品0.1ml， 酶标板加上盖， 37反应90分钟； 反应后用甩去酶标板内的液体， 再对着吸水纸拍几下， 不洗； 将准备好的生物素抗TNF- 抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。 37反应60分钟； 每孔加入0.01M PBS 0.35ml洗涤3次， 每次浸泡1分钟左右； 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，（TMB空白显色孔除外） 。 37反应3。

34、0分 钟； 每孔加入0.01 M PBS 0.35ml洗涤5次， 每次浸泡12分钟左右； 按每孔90 l依次加入已在37平衡30分钟的TMB显色液， 37避光反应15分钟； 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液， 此时蓝色转黄色。 用酶标仪在50nm测定OD值。 根据 标准曲线计算相应的浓度。 0031 （5） 细胞上清液IL-1 检测 采用小鼠IL-1 ELISA试剂盒， 严格按照试剂盒说明书操作， 步骤如下： 标准品的稀释与加样： 在酶标包被板上设置标准品孔10孔， 子1、 2孔中分别加标准品 100 l， 然后在第1、 2孔中加标准品稀释液50 l， 混匀； 然后从第1、 2孔中各取10。

35、0 l分别加到 第3、 4孔， 再于第3、 4孔中分别加标准品稀释液50 l， 混匀； 然后在第3、 4孔中各取50 l弃去， 再各取50分别加到第5、 6孔中， 于第5、 6孔中分别加标准品稀释液50 l， 混匀； 从第5、 6孔中 各取50分别加到7、 8孔中， 再于7、 8孔中分别加标准品稀释液50 l， 混匀； 从第7、 8孔中各取 50 l分别加到第9、 10孔中， 再于第9、 10孔中分别加标准品稀释液50 l混匀， 然后在第9、 10 孔中各取50 l弃去。 稀释后各孔加样品量均为50 l， 浓度分别为90ng/L、 60ng/L、 30ng g/L、 15ng/L、 7.5ng。

36、/L； 加样： 分别设置白孔 （不加样品及酶标试剂， 其余各步骤操作相同） 、 待测样品孔。 在 待测样品孔中各加样品稀释液40 l， 然后再分别加待测样品10 l （样品最终稀释度为5倍） 。 加样将样品加于酶标仪板孔底部， 尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀； 温育： 以封板膜封板后置于电热恒温培养箱37 C温育30分钟； 配液： 将30 （48T的20倍） 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 （48T的20倍） 倍稀释后备用； 洗板： 取出酶标板， 小心揭去封板膜， 弃去液体， 甩干， 每孔加满洗板液， 静置30秒后 弃去， 如此重复5次， 拍干； 加酶： 每孔加入酶标试剂50 l， 空白孔除外； 温。

37、育： 以封板膜封板后置于电热恒温培养箱37 C温育30分钟； 洗板： 取出酶标板， 小心揭去封板膜， 弃去液体， 甩干， 每孔加满洗板液， 静置30秒后 弃去， 如此重复5次， 拍干； 显色： 每孔先加入50 l显色剂A， 再加入50 l显色剂B， 轻轻震荡混匀， 37 C避光显色 15分钟； 终止： 每孔加终止液50 l终止显色反应。 以空白孔调零， 450nm波长依序测定各孔吸 说 明 书 6/8 页 8 CN 107279286 A 8 光度。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 0032 计算： 根据标准品的浓度及对应的OD值， 计算出标准曲线的直线回归方程， 在根据 样品的OD值，。

38、 在回归方程上计算出对应的样品浓度， 最终浓度为实际浓度乘以稀释倍数。 0033 二、 具体实施例 实施例1 一种促进伤口愈合酸奶的制备方法， 包括以下步骤： （1） 复原乳的制作： 将奶粉与65的温水按质量比15： 100的比例混合后， 充分搅拌溶 解， 进行巴氏灭菌， 得到复原乳； （2） 混合浆汁的制备： 将西红柿汁、 菠菜汁、 艾叶汁、 黑豆浆汁和蜂蜜水按质量比1： 1： 1： 1： 1混合形成混合浆汁， 充分搅拌均匀； 其中 西红柿汁的制备过程为选取新鲜西红柿洗净切块， 用榨汁机榨汁3分钟， 经8层纱布过 滤后获得西红柿汁； 菠菜汁的制备过程为选取新鲜的菠菜洗净切碎， 用榨汁机榨汁3。

39、分钟， 经8层纱布过滤后获得菠菜汁； 艾叶汁的制备过程为选取新鲜的艾叶洗净， 用榨汁机榨汁3 分钟， 经8层纱布过滤获得艾叶汁； 黑豆浆的制备过程为选择颗粒饱满且无杂质的黑豆， 用 浓度0.5wt的NaHCO3溶液20浸泡1012 h后， 将黑豆用温度为80、 浓度为0.5wt的 NaHCO3溶液漂烫10min， 迅速冷却， 脱去种皮， 按黑豆与水的质量比为1： 3的比例， 磨浆得黑 豆浆 （以使黑豆组织细胞破裂、 蛋白质等营养物质溶于水中， 黑豆纤维沉淀） ， 再将黑豆浆煮 沸5分钟， 最后将黑豆浆用8层纱布过滤； 蜂蜜水的制备过程为将品质良好的蜂蜜取50mL加 150mL的温开水化开； （。

40、3） 混合液制备： 将复原乳与混合浆汁按体积比3： 1比例充分混合均匀后， 再加入复原 乳质量67的白砂糖， 搅拌均匀得到混合液； （4） 均质杀菌： 将混合液加入到高压均质机中， 控制混合液温度为70， 均质压力为 20Mpa； 将均质过的混合液于92高温杀菌， 保持5min， 得到混合发酵原料； （5） 功能性发酵剂的制备： 分别将保藏于-40冰箱中的干酪乳杆菌XS1和植物乳杆菌 RUB1菌种， 放于室温解冻， 按质量体积比1%的接种量加入灭菌后的MRS液体培养基中， 置于 37培养箱中静置培养8 h， 得到中间发酵剂； 再吸取中间发酵剂以质量体积比2%的接种量 加入灭菌后的MRS 液体培。

41、养基中， 置于37培养箱中静置培养8 h， 即分别得到干酪乳杆菌 XS1发酵剂和植物乳杆菌RUB1发酵剂； （6） 接种： 在步骤 （4） 得到的混合发酵原料中按质量比0.105%的接种量加入酸奶发酵剂 菌粉 （由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按质量比1： 1的比例混合而成） ， 然后按质量体积比 1.5%的接种量加入干酪乳杆菌XS1以及质量体积比1.5%的接种量加入植物乳杆菌RUB1发酵 剂， 搅拌5 min后， 装入经高压蒸汽灭菌后的瓶中封口； （7） 发酵： 在42的恒温培养箱中静置发酵4.5h， 停止发酵后 ， 于05下冷藏， 即得 到促进伤口愈合的酸奶。 后熟的目的以防止过酸， 促进芳香。

42、物质的产生。 0034 实施例2 同上述实施例1， 其区别在于： 步骤 （1） 中将奶粉与60的温水混合后； 步骤 （4） 中控制混合液温度为65， 均质压力为15Mpa； 将均质过的混合液于9095高 温杀菌， 保持5min； 说 明 书 7/8 页 9 CN 107279286 A 9 步骤 （6） 中混合发酵原料中按质量比0.1%的接种量加入酸奶发酵剂菌粉， 然后按质量 体积比1%的接种量加入干酪乳杆菌XS1以及质量体积比1%的接种量加入植物乳杆菌RUB1发 酵剂； 步骤 （7） 中： 在恒温培养箱中静置发酵4h。 0035 实施例3 同上述实施例1， 其区别在于： 步骤 （1） 中将奶。

43、粉与70的温水混合后； 步骤 （4） 中控制混合液温度为75， 均质压力为25Mpa； 将均质过的混合液于95高温 杀菌， 保持5min； 步骤 （6） 中混合发酵原料中按质量比0.11%的接种量加入酸奶发酵剂菌粉， 然后按质量 体积比2%的接种量加入干酪乳杆菌XS1以及质量体积比2%的接种量加入植物乳杆菌RUB1发 酵剂； 步骤 （7） 中在恒温培养箱中静置发酵5h。 0036 当然， 以上述说不是对本发明的限制， 本发明也并不限于上述举例。 本技术领域的 技术人员在本发明的实质范围内， 做出的变化、 改型、 添加或替换， 也应属于本发明的保护 范围。 说 明 书 8/8 页 10 CN 107279286 A 10 。