本申请是申请日为2010年11月8日的中国专利申请201080052281.5 “方法”的分案申请。
相关申请的引用
引用到以下相关申请案：US 2002-0009518、US 2004-0091574、WO 2004/064537、WO 2004/064987、WO 2005/066347、WO 2005/066351、2006 年2月2日提交的美国申请系列号60/764,430、WO 2006/008508、WO 2008/090395、US 2008-0063783、WO 2009/024862和PCT/IB2009/054535。这些申请案中的每一个和这些申请案中的每一个中引证的每篇文献(“申请引证文献”)以及申请引证文献中引用或引证的每篇文献——无论是在文本中还是在这些申请案的整个申请过程中——以及在这个申请过程中所提出的所有支持专利性的论据，都以引用方式并入本文。本文本中还引证到各种文献(“本文引证文献”)。每一篇本文引证文献以及本文引证文献中引证或引用的每篇文献，都引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及生产乳粉的方法、经酶处理的乳粉以及酶在处理乳粉以提供新的意想不到的技术优势中的用途。
背景技术
乳粉(本文中也称“奶粉”)是通过对乳进行干燥制得人造乳制品。干燥的主要目的是延长其货架期和避免需要冷藏，因为水分含量低。乳粉和粉末乳制品可包括全脂乳粉、脱脂乳粉、酪乳粉、干乳清制品和干乳制品混合物。
通常，乳粉是通过将脱脂乳、全脂乳、酪乳或乳清进行喷雾干燥制得的。首先将巴氏灭菌乳在蒸发器中浓缩至大约50％乳固形物。将所得的浓缩乳喷雾到加热室中，水分在其中几乎瞬间蒸发，留下乳固形物粉末微粒。将粉末微粒从空气流中分离出来，回收在干燥器底部，同时湿空气被排出蒸发器。
或者，乳也可通过转鼓干燥法(也称滚筒干燥)进行干燥。使乳以薄膜施加到加热转鼓(通常通过蒸汽加热)的表面。将蒸发的水的水排掉，留下干燥的乳固形物，其在转鼓上形成薄层，然后将该薄层刮下。以这种方式制得的乳粉往往有种“煮熟”味，这是由于过度暴露于热而造成的焦糖化所致。
另一种用来生产乳粉的方法是冷冻干燥，其与转鼓干燥相比能保留乳中的许多营养物。但是，这个方法的费用通常比转鼓干燥或喷雾干燥要高。
乳粉制品及其制备方法在“Milk and Dairy Products”，R.Jost，publ. Wiley-VCH，Weinheim，2007中有概括的描述，该文献以引用方式并入了本文。
WO 2006/066590描述了采用磷脂酶特别是磷脂酶A生产乳粉的方法。但是，这个文献没有公开或提示到采用这种酶生产乳粉可防止该方法中所使用设备的污染。
已知脂质酰基转移酶在食品应用中是有利的。已发现脂质酰基转移酶在食品中具有显著的酰基转移酶活性。这个活性在制作食品的方法中具有出乎意料的有益应用。
例如，WO 2004/064537公开了采用脂质酰基转移酶原位生产乳化剂的方法及相关的优点。
WO 2008/090395叙述了在(异源)宿主细胞中表达脂质酰基转移酶，该专利以引用方式并入本文。
WO 2009/024862描述了采用脂质酰基转移酶制造UHT乳的方法及该方法制得的乳。
乳的主要组分是水、脂肪、蛋白质、乳糖和矿物质(盐)。乳还含有少量的其他物质，如色素、酶、维生素、磷脂(具有类似脂肪的性质的物质)、甾醇和气体。
乳的许多脂质共同形成“乳脂肪”，其具有非常复杂的组成和结构，比大多数其他天然脂肪还要复杂。通常，乳脂肪由甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯、脂肪酸、甾醇、类胡萝卜素和维生素(A、D、E和K)组成。其他成分包括磷脂、脂蛋白、甘油、脑苷脂、蛋白质、核酸、酶、金属和水。
磷脂是表面活性最高的一类物质，因为它们是双极性的。由于分子尺寸相对较大，它们趋于形成片状双层。通常可看到乳的磷脂与蛋白质紧密结合，特别是当它位于乳脂肪小球的膜中时。乳中的磷脂的主要组分包括卵磷脂，其具有中等亲水性的表面活性。因此，卵磷脂可视为悬浮剂和分散剂或者视为O/W乳液及W/O乳液的乳化剂。
磷脂占天然乳脂肪的0.8-1.0％。乳中的磷脂/卵磷脂的主要类别是磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。
甾醇高度不溶于水中，且显示极低的表面活性。它们容易与磷脂缔合。从乳的营养价值考虑，胆甾醇可认为是乳中的不需要的成分。胆固醇占天然乳脂肪的0.3-0.4％。
附图简要说明
图1显示突变的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，突变为Asn80Asp(值得注意的是，氨基酸80 在该成熟序列中)(SEQ ID 16)；
图2显示来自嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)；
图3显示来自数据库版本6的pfam00657共有序列(SEQ ID No.2)；
图4显示从嗜水气单胞菌(P10480；GI：121051)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.3)；
图5显示从杀鲑气单胞菌(AAG098404；GI：9964017)获得的氨基酸序列 (SEQ ID No.4)；
图6显示从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)(Genbank登录号NP_631558)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.5)；
图7显示从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)(Genbank登录号CAC42140)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.6)；
图8显示从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Genbank登录号 P41734)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.7)；
图9显示从劳尔氏菌属(Ralstonia)(Genbank登录号AL646052)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.8)；
图10显示SEQ ID No.9。Scoe1 NCBI蛋白质登陆代码CAB39707.1 GI：4539178保守假想蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图11显示SEQ ID No.10所示的氨基酸。Scoe2 NCBI蛋白质登陆代码 CAC01477.1 GI：9716139保守假想蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图12显示氨基酸序列(SEQ ID No.11)Scoe3 NCBI蛋白质登陆代码 CAB88833.1 GI：7635996推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图13显示氨基酸序列(SEQ ID No.12)Scoe4 NCBI蛋白质登陆代码 CAB89450.1 GI：7672261推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图14显示氨基酸序列(SEQ ID No.13)Scoe5 NCBI蛋白质登陆代码 CAB62724.1 GI：6562793推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图15显示氨基酸序列(SEQ ID No.14)Srim1 NCBI蛋白质登陆代码 AAK84028.1 GI：15082088GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)]；
图16显示来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida)(ATCC#14174)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 15)；
图17显示SEQ ID No.19。Scoe1 NCBI蛋白质登陆代码CAB39707.1 GI：4539178保守假想蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图18显示用于嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶基因的诱变的融合构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.25)。下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽；
图19显示来自链霉菌属(Streptomyces)的脂质酰基转移酶的多肽序列 (SEQ ID No.26)；
图20显示来自喜热裂孢菌属(Thermobifida)的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.27)；
图21显示来自喜热裂孢菌属(Thermobifida)的脂质酰基转移酶的多肽序列(SEQ ID No.28)；
图22显示来自有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)的脂质酰基转移酶的多肽GDSx 300氨基酸(SEQ ID No.29)；
图23显示来自食芳烃新鞘氨醇菌(Novosphingobium aromaticivorans)的脂质酰基转移酶的多肽GDSx 284氨基酸(SEQ ID No.30)；
图24显示来自天蓝色链霉菌的脂质酰基转移酶的多肽GDSx 269氨基酸(SEQ ID No.31)；
图25显示来自除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)的脂质酰基转移酶的多肽\GDSx 269氨基酸(SEQ ID No.32)；
图26显示来自链霉菌属的脂质酰基转移酶的多肽(SEQ ID No.33)；
图27显示从嗜水气单胞菌(P10480；GI：121051)获得的氨基酸序列(SEQ ID No.34)(值得注意的是，这是成熟序列)；
图28显示杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列 (SEQ ID No.35)(值得注意的是，这是成熟序列)；
图29显示来自热糖链球菌(Streptomyces thermosacchari)的核苷酸序列 (SEQ ID No.36)；
图30显示来自热糖链球菌(Streptomyces thermosacchari)的氨基酸序列 (SEQ ID No.37)；
图31显示来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的氨基酸序列(SEQ ID No.38)/GDSx 548氨基酸；
图32显示来自褐色嗜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No.39)；
图33显示来自褐色嗜热裂孢菌的氨基酸序列(SEQ ID No.40)/GDSx；
图34显示来自有效棒杆菌的氨基酸序列(SEQ ID No.41)/GDSx 300氨基酸；
图35显示来自有效棒杆菌的核苷酸序列(SEQ ID No.42)；
图36显示来自天蓝色链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No.43)/GDSx 268 氨基酸；
图37显示来自天蓝色链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.44)；
图38显示来自除虫链霉菌的氨基酸序列(SEQ ID No.45)；
图39显示来自除虫链霉菌的核苷酸序列(SEQ ID No.46)；
图40显示来自褐色嗜热裂孢菌的氨基酸序列(SEQ ID No.47)/GDSx；
图41显示来自褐色嗜热裂孢菌的核苷酸序列(SEQ ID No.48)/GDSx；
图42显示L131与来自除虫链霉菌和褐色嗜热裂孢菌的同源物的比对，阐明了GDSx基序(在L131和除虫链霉菌和褐色嗜热裂孢菌中为 GDSY)、GANDY框(GGNDA或GGNDL)和HPT块(被认为是保守催化性组氨酸)的保守性。对这三个保守块进行了突出显示；
图43显示SEQ ID No 17，其是来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列；
图44显示SEQ ID No 18，其是来自近平滑假丝酵母的脂质酰基转移酶的氨基酸序列；
图45显示在活性位点中具有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状显示图 (ribbon representation)。该图是用Deep View Swiss-PDB浏览器作出的；
图46显示1IVN.PDB晶体结构-用Deep View Swiss-PDB浏览器作出的侧视图，活性位点中有甘油，在活性位点甘油以内的残基以黑色表示；
图47显示1IVN.PDB晶体结构-用Deep View Swiss-PDB浏览器作出的顶视图，活性位点中有甘油，在活性位点甘油以内的残基以黑色表示；
图48显示比对1；
图49显示比对2；
图50和51显示1IVN与P10480的比对(P10480是嗜水气单胞菌酶的数据库序列)，这个比对是从PFAM数据库获得并用于建模过程；及
图52显示比对，其中P10480是嗜水气单胞菌的数据库序列。这个序列用于模型构建和位点选择(注意，示出了完整蛋白(SEQ ID No.25)，成熟蛋白(等同于SEQ ID No.34)在残基19处开始。A.sal是杀鲑气单胞菌 (SEQ ID No.4)GDSX脂肪酶，A.hyd是嗜水气单胞菌(SEQ ID No.34) GDSX脂肪酶；共有序列在所列的序列之间有差异的位置处含有*)；
图53显示实例1中使用的基因构建体；
图54显示实例1中使用的经密码子优化的基因构建体(no.052907)；
图55显示含有LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入片段的序列，-35框和-10框以下划线表示；
图56显示在1％甘油三丁酸酯琼脂上在37℃下生长48小时后的 BML780-KLM3’CAP50(包含SEQ ID No.16-上菌落)和BML780(空宿主菌株-下菌落)；
图57显示来自杀鲑气单胞菌的核苷酸序列(SEQ ID No.49)，包括信号序列(preLAT-位置1至87)；
图58显示从嗜水气单胞菌获得的编码本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.50)；
图59显示从杀鲑气单胞菌获得的编码本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.51)；
图60显示从天蓝色链霉菌A3(2)(Genbank登录号 NC_003888.1：8327480..8328367)获得的编码本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.52)；
图61显示从天蓝色链霉菌A3(2)(Genbank登录号 AL939131.1：265480..266367)获得的编码本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.53)；
图62显示从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Genbank登录号 Z75034)获得的编码本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.54)；
图63显示从罗尔斯顿菌属(Ralstonia)获得的编码本发明脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.55)；
图64显示SEQ ID No.56核苷酸序列，其编码NCBI蛋白质登录代码 CAB39707.1 GI：4539178保守假想蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图65显示SEQ ID No.57核苷酸序列，其编码Scoe2 NCBI蛋白质登陆代码CAC01477.1 GI：9716139保守假想蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图66显示SEQ ID No.58核苷酸序列，其编码Scoe3 NCBI蛋白质登陆代码CAB88833.1 GI：7635996推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图67显示SEQ ID No.59核苷酸序列，其编码Scoe4 NCBI蛋白质登陆代码CAB89450.1 GI：7672261推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图68显示SEQ ID No.60核苷酸序列，其编码Scoe5 NCBI蛋白质登陆代码CAB62724.1 GI：6562793推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]；
图69显示SEQ ID No.61核苷酸序列，其编码Sriml NCBI蛋白质登陆代码AAK84028.1 GI：15082088 GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)]；
图70显示编码来自嗜水气单胞菌(ATCC#7965)的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID No.62)；
图71显示编码来自杀鲑气单胞菌Salmonicida)(ATCC#14174)的脂质酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No.15)；
图72显示编码来自嗜水气单胞菌的酶的核苷酸序列(SEQ ID No.24)，包括木聚糖酶信号肽；
图73显示突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，突变为Asn80Asp(值得注意的是，氨基酸80是在成熟序列中)-本文以SEQ ID No.16显示，在进行翻译后修饰之后以SEQ ID No.68显示- SEQ ID No.68的氨基酸残基235和236在翻译后修饰之后不以共价连接。所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥保持在一起。SEQ ID No.68中的氨基酸236对应于本文所示的SEQ ID No.16中的氨基酸残基号274；
图74显示从标准的未经处理的全脂乳制备的乳粉；
图75显示从经KLM3酶(KTP08015，1300TIPU/g乳，对应于12.4mg 酶/g乳)溶液处理的标准全脂乳制备的乳粉；该酶的活性(以TIPU单位表示)如下所述测量；
图76示出用来进行实例3的润湿性试验的装置；
图77显示编码来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的核苷酸序列(SEQ ID NO.120)；
图78显示突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，突变为Asn80Asp(值得注意的是，氨基酸80是在成熟序列中)-本文以SEQ ID No.16显示，在进行翻译后修饰之后以SEQ ID No.121显示- SEQ ID No.121的氨基酸残基235和236在翻译后修饰之后不共价连接；所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥保持在一起；SEQ ID No.121中的氨基酸236对应于本文所示的SEQ ID No.16中的氨基酸残基号275；
图79显示突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，突变为Asn80Asp(值得注意的是，氨基酸80是在成熟序列中)-本文以SEQ ID No.16显示，在进行翻译后修饰之后以SEQ ID No.122显示- SEQ ID No.122的氨基酸残基235和236在翻译后修饰之后不共价连接；所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥保持在一起；SEQ ID No.122中的氨基酸236对应于本文所示的SEQ ID No.16中的氨基酸残基号276；及
图80显示突变的杀鲑气单胞菌成熟脂质酰基转移酶(GCAT)的氨基酸序列，突变为Asn80Asp(值得注意的是，氨基酸80是在成熟序列中)-本文以SEQ ID No.16显示，在进行翻译后修饰之后以SEQ ID No.123显示- SEQ ID No.123的氨基酸残基235和236在翻译后修饰之后不共价连接；所形成的两个肽通过一个或多个S-S桥保持在一起；SEQ ID No.123中的氨基酸236对应于本文所示的SEQ ID No.16中的氨基酸残基号277。
发明内容
本发明的各方面在权利要求中及在以下说明中给出。
出乎意料地发现，在乳粉的生产过程中将乳或其级分(fraction)暴露于脂质酰基转移酶会导致乳粉的流动性和复水性质改进，还导致乳粉的游离脂肪酸含量(与在制造过程中用磷脂酶处理的乳粉相比)和胆固醇含量减低。
本发明的第一方面提供生产乳粉的方法，所述方法包括：
(a)使乳或其级分与脂质酰基转移酶接触；和
(b)将经酶处理的乳干燥而生产出乳粉。
本发明的第二个方面提供通过本发明方法所获得的或者通过本发明方法可获得的乳粉。
本发明的第三个方面提供通过将本发明的乳粉复水而生产的乳制品。
本发明的第四个方面提供脂质酰基转移酶在制造乳粉以改进乳粉的复水性质中的用途。在一个方面，乳粉的这种复水性质改进包括润湿性改进和 /或润湿时间减少。
本发明的第五个方面提供脂质酰基转移酶在制造乳粉以改进乳粉的可感知感官差异中的用途。在一个方面，术语“可感知感官差异”包括气味和 /或味道改进，例如煮熟味道和/或气味减少，和/或哈喇味道和/或气味减少。
本发明的第六个方面提供脂质酰基转移酶在制造乳粉以减少乳粉的胆固醇含量中的用途。
本发明的第七个方面提供脂质酰基转移酶在制造乳粉以减少乳粉的游离脂肪酸含量中的用途，所述减少是与在制造过程中用磷脂酶处理的乳粉相比而言。
胆固醇的减少可用薄层色谱法(TLC)和/或气液色谱法(GLC)测量。
本发明的第八个方面提供脂质酰基转移酶在制造乳粉以改进乳粉的流动性中的用途。
本发明的第九个方面提供脂质酰基转移酶在制造乳粉以减少乳粉制造中对所使用的设备的污染中的用途。
具体实施方式
如上所述，在一个方面，本发明包括生产乳粉的方法，该方法包括：(a) 使乳或其级分与脂质酰基转移酶接触；和(b)将经酶处理的乳干燥而生产出乳粉。
乳
本文所用的术语“乳”可包括动物来源或植物来源的乳，并包括全脂乳、脱脂乳和半脱脂乳。
可以使用来自动物来源如水牛、(传统)母牛、绵羊、山羊等的乳，既可单独使用，也可组合使用。也可使用植物乳如大豆乳，可以单独使用，也可与动物乳组合使用。当将植物乳与动物乳组合使用时，该组合通常包含低百分比的植物乳，比如说低于15％、或低于20％或低于25％v/v。术语“乳”优选不包括干酪用乳(cheese milk)和乳酪(cream)。
本文所用的术语“基本上包含”当指产品或组合物时，优选意指该产品或组合物可包含其他的产品或组合物，但其他的产品或组合物的最大浓度优选仅为10％，如5％，如3％，如2％或1％，或者0.5％或0.1％。
对于(例如)乳和/或乳酪的酶修饰而言，可优选使用(例如)低于约 30℃、合适地(例如)低于20℃、合适地(例如)低于10℃的温度。可使用1-30℃之间、例如3-20℃之间、如1-10℃之间的合适温度。
温育
根据本发明，使乳与脂质酰基转移酶接触，使得该酶与该乳一起温育。合适的脂质酰基转移酶在本文中有更详细的描述。
合适地，在约0℃至约70℃之间的温度下使脂质酰基转移酶与乳接触并一起温育。在一个实施例中，在约20℃至约60℃之间、更优选约30℃至约50℃之间、还更优选约35℃至约45℃之间、最优选约40℃的温度下使脂质酰基转移酶与乳接触并一起温育。在另一个实施例中，在约0℃至约20℃之间、更优选约5℃至约15℃之间、还更优选约5℃至约10℃之间的温度下使脂质酰基转移酶与乳接触并一起温育。
优选地，按以下浓度使脂质酰基转移酶与乳接触并一起温育：约0.01 至约1毫克酶/公斤乳、更优选约0.01至约0.05毫克酶/公斤乳、甚至更优选约0.01至约0.2毫克酶/公斤乳、还更优选约0.01至约0.1毫克酶/公斤乳、再更优选约0.01至约0.05毫克酶/公斤乳、最优选约0.05毫克酶/公斤乳。
优选地，温育时间要能有效确保有至少10％转移酶活性、更优选至少 15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或70％转移酶活性。
转移酶活性通过本文指出的转移酶测定法测量。
合适地，温育时间可为1分钟直至36小时、优选2分钟直至24小时、更优选5分钟直至18小时、甚至优选10分钟直至12小时、还更优选20分钟直至8小时。
在一个实施例中，温育时间可为约20分钟至约2小时、优选约30分钟至约1小时、更优选约35分钟至约45分钟。
在另一个实施例中，温育时间可为约2小时至约36小时、优选约4小时至约24小时。
优选地，温度和温育时间的组合要能有效确保有至少5％转移酶活性、优选至少10％转移酶活性、优选至少15％、20％、25％、26％、28％、 30％、40％、50％、60％或75％转移酶活性。
合适地，所述方法还包括将酶除去和/或使酶变性的步骤。
合适地，本发明所用的酶可以是固定化酶。
反应可在任何合适的容器中进行，容器的非限制性实例包括连续流反应器。
干燥
用本文所述的酰基转移酶处理后，将经处理的乳干燥以生产出乳粉。
在一个实施例中，通过喷雾干燥将经处理的乳干燥以生产出乳粉。合适的喷雾干燥条件在“Milk and Dairy Products”，R.Jost，publ.Wiley-VCH， Weinheim，2007中有概括的描述，该文献以引用方式并入了本文。
在这个实施例中，合适地，将经酶处理的乳输送到处于约20℃至约 95℃、优选约50℃至约95℃、更优选约60℃至约80℃的温度下的喷雾干燥机中。在一个另选的实施例中，合适地，将经酶处理的乳输送到处于35℃至45℃、优选约40℃的温度下的喷雾干燥机中。
在这个实施例中，喷雾干燥机的出口空气温度合适地为约50℃至约 150℃、优选约70℃至约130℃、更优选约90℃至约110℃、最优选约 100℃。
在这个实施例中，喷雾干燥机的产品出口温度合适地为约20℃至约 80℃、优选约30℃至约70℃、更优选约35℃至约45℃、最优选约40℃。
在另一个实施例中，将经酶处理的乳通过滚筒干燥(也称转鼓干燥) 进行干燥以生产出乳粉。合适的滚筒干燥条件在“Milk and Dairy Products”， R.Jost，publ.Wiley-VCH，Weinheim，2007中有概括的描述，该文献以引用方式并入了本文。
在这个实施例中，转鼓的温度合适地为约90℃至约150℃、更优选约 100℃至约130℃。
优点
本发明带来的一个出乎意料的优点是乳粉的复水性质大为改进。在一个方面，乳粉的这种复水性质改进包括润湿性改进和/或润湿时间减少。润湿性可按照IDF方法87：1979进行测量。
本发明带来的又一个优点是乳粉的可感知感官差异的改进。合适地，乳粉的可感知感官差异可用下文说明的“三角试验”测量。在一个方面，“可感知感官差异”包括气味和/或味道改进，例如煮熟味道和/或气味减少，和/或哈喇味道和/或气味减少。
本发明的又一个优点可以是，与未经酶处理的乳粉相比和/或与制造过程中用磷脂酶(特别是分类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1或者分类为EC.3.1.1.4的磷脂酶A2)(而不是本文所述的脂质酰基转移酶)处理的乳粉相比，当使用按照本发明处理的乳粉时，对粉加工设备的(例如设备管道和 /或不锈钢表面的)污染减少。
本发明的又一个优点可以是，与制造过程中用磷脂酶(特别是分类为 E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1或者分类为EC.3.1.1.4的磷脂酶A2)(而不是本文所述的脂质酰基转移酶)处理的乳粉相比，按照本发明处理的乳粉的游离脂肪酸减少。
本发明的又一个优点是乳粉的胆固醇含量减少，这可具有重大的健康好处。
本发明的又一个优点是乳粉的流动性的改进。
合适地，乳粉的复水性质的改进和/或可感知感官差异的改进和/或气味和/或味道的改进和/或胆固醇含量的减少和/或流动性的改进和/或其制造中使用的设备的污染的减少，意指当将经酶处理的乳(用本发明的酶处理)与未经酶处理的乳粉相比和/或与用磷脂酶(特别是分类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1或者分类为EC.3.1.1.4的磷脂酶A2)处理的乳粉相比时的改进。
合适地，乳粉的复水性质的改进和/或可感知感官差异的改进和/或气味和/或味道的改进和/或胆固醇含量的减少和/或流动性的改进和/或其制造中使用的设备的污染的减少，可意指当将经酶处理的乳(用本发明的酶处理) 与用以下磷脂酶之一者或多者处理的乳粉相比时的改进：来自尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum)的磷脂酶A1(Lipopan FTM)和/或来自异孢镰刀菌 (Fusarium heterosporum)的磷脂酶和/或来自Fusarium venenatum的磷脂酶 A1(YieldMaxTM)和/或来自黑曲霉(Aspergillus niger)的磷脂酶和/或来自紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)的磷脂酶A2和/或来自猪胰腺的磷脂酶A2 和/或来自波氏块菌(Tuber borchii)的磷脂酶A2。
宿主细胞
宿主生物可以是原核生物或真核生物。
在本发明的一个实施例中，本发明的脂质酰基转移酶在宿主细胞中表达，例如细菌细胞，如芽孢杆菌属(Bacillus spp)、例如地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)宿主细胞。
或者，宿主细胞可以例如是真菌、酵母或植物。
已发现与其他生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相比，使用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主细胞可导致脂质酰基转移酶的表达提高。
已将来自杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂质酰基转移酶插入到多种常规的表达载体中，这些表达载体被设计成分别对于在枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、多型汉森酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)和塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)中表达而言是最佳的。但是，在多型汉森酵母、粟酒裂殖酵母和塔宾曲霉中仅检测到极低的水平。表达水平低于1μg/ml，未能选择出产生了足够的蛋白质以便启动商业生产的细胞(结果未显示)。相反，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)能够产生对于经济上可行的生产而言有吸引力的蛋白质水平。
具体而言，已发现在地衣芽孢杆菌中的表达比在aprE启动子控制下在枯草芽孢杆菌中的表达高大约100倍，或者比在A4启动子控制下和融合到纤维素在变铅青链霉菌(S.lividans)中的表达高大约100倍(结果未在本文中显示)。
宿主细胞可以是枯草芽孢杆菌之外的任何芽孢杆菌细胞。优选地，所述芽孢杆菌宿主细胞来自以下种类之一：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)；解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)；环状芽孢杆菌(B.circulans)；克劳氏芽孢杆菌(B. clausii)；凝结芽孢杆菌(B.coagulans)；坚强芽孢杆菌(B.firmus)；B.lautus；缓慢芽孢杆菌(B.lentus)；巨大芽孢杆菌(B.megaterium)；短小芽孢杆菌(B. pumilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)。
本发明相关的术语“宿主细胞”包括任何这样的细胞，其包含编码本文所定义的脂质酰基转移酶或本文所定义的表达载体的核苷酸序列，且被用于具有本文所定义的特定性质的脂质酰基转移酶的重组生产。
合适地，宿主细胞可以是缺乏蛋白酶或没有蛋白酶的细胞株和/或缺乏α-淀粉酶或没有α-淀粉酶的细胞株。
本文所用的术语“异源”意指衍自一种另外的遗传来源或物种的序列。异源序列是非宿主序列、经修饰的序列、来自另一不同的宿主细胞株的序列或者来自该宿主细胞的另一不同染色体位置的同源序列。
“同源”序列是在相同的遗传来源或物种中找到的序列，也即它天然地存在于宿主细胞的相关物种之中。
本文所用的术语“重组脂质酰基转移酶”意指该脂质酰基转移酶是藉遗传重组法生产的。例如，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列已被插入到克隆载体中，导致产生出以异源脂质酰基转移酶的存在为特征的地衣芽孢杆菌。
调节序列
在一些应用中，供在本发明方法和/或用途中使用的脂质酰基转移酶序列，可通过将编码该脂质酰基转移酶序列的核苷酸序列有效连接到能够使该核苷酸序列得以表达(如被所选定的宿主细胞(如地衣芽孢杆菌细胞)表达)的调节序列来获得。
举例说，可使用包含有效连接到这种调节序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“有效连接”是指一种“邻接”，此时，其中所描述的各组分处于使得它们能以其预期的方式发挥功能的关系。“有效连接”到编码序列的调节序列是以这样的方式被连接，即在该方式下，编码序列的表达在与控制序列相容的条件下得以实现。
术语“调节序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。
术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码具有本文所定义特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达，也可通过选择自然界中编码该酶的核苷酸序列的调节区(例如启动子)、非该核苷酸序列的调节区的分泌前导区和终止子区来实现。
合适地，可将本发明的核苷酸序列有效连接到至少一个启动子。
合适地，可将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列有效连接到编码终止子序列的核苷酸序列。供在本发明的载体、宿主细胞、方法和/或用途之任一者中使用的合适终止子序列的实例包括：α-淀粉酶终止子序列(例如， CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTTCATA AA-SEQ ID No.64)、碱性蛋白酶终止子序列(例如， CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCAATAAGCGGGCGAATCTT ACATAAAAATA-SEQ ID No.65)、谷氨酸特异性终止子序列(例如， ACGGCCGTTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTT CGTGTATTATTGT-SEQ ID No.66)、果聚糖酶终止子序列(例如， TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCA TCGTTT-SEQ ID No.67)和枯草杆菌蛋白酶E终止子序列(例如， GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGCTTCTTTTTAC TATTATTG-SEQ ID No.119)。合适地，可将编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列有效连接到α-淀粉酶终止子，如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶终止子。
启动子
要按照本发明使用的启动子序列可以与编码脂质酰基转移酶的序列异源或同源。
启动子序列可以是任何能够指导脂质酰基转移酶在所选择的宿主细胞中的表达的启动子序列。
合适地，启动子序列与芽孢杆菌(例如地衣芽孢杆菌)同源。优选地，启动子序列与所选择的宿主细胞同源。
合适地，启动子序列可与宿主细胞同源。“与宿主细胞同源”意指起源于该宿主生物内；即在宿主生物中天然存在的启动子序列。
合适地，启动子序列可选自编码以下启动子的核苷酸序列：α-淀粉酶启动子、蛋白酶启动子、枯草杆菌蛋白酶启动子、谷氨酸特异性蛋白酶启动子和果聚糖蔗糖酶启动子。
合适地，启动子序列可以是编码以下启动子的核苷酸序列：LAT(例如来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子，也称AmyL)、AprL(例如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg启动子)、EndoGluC(例如来自地衣芽孢杆菌的谷氨酸特异性启动子)、AmyQ(例如来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子)和 SacB(例如枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶启动子)。
适合在本发明方法中指导核酸序列的转录的启动子的其他实例包括：缓慢芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子(aprH)；枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子(amyE)；嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因的启动子 (amyM)；地衣芽孢杆菌青霉素酶基因的启动子(penP)；枯草芽孢杆菌xylA 和xylB基因的启动子；和/或苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Tenebrionis)CryIIIA基因的启动子。
在一个优选的实施例中，启动子序列是α-淀粉酶启动子(如地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子)。优选地，启动子序列包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的-35至-10序列-参见图53和55。
“-35至-10序列”描述的是相对于转录起始位点的位置。“-35”和“- 10”都是框(box)，即多个核苷酸，每个框包含6个核苷酸，且这些框被17 个核苷酸隔开。这17个核苷酸通常称为“间隔区”。这在图55中示出，其中-35框和-10框以下划线表示。为避免疑问，本文中用到“-35至-10序列”时是指从-35框的起始到-10框的末端的序列，即包括-35框、17个核苷酸长的间隔区和-10框。
信号肽
取决于所使用的序列和/或载体，由宿主细胞通过表达编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列而产生的脂质酰基转移酶可被分泌出来或者可包含在细胞内。
信号序列可用来指导编码序列分泌穿过特定的细胞膜。信号序列对于脂质酰基转移酶编码序列而言可以是天然的或外来的。例如，信号肽编码序列可获自芽孢杆菌(优选地衣芽孢杆菌)的淀粉酶或蛋白酶基因。
合适的信号肽编码序列可获自以下基因之一者或多者：产麦芽糖α-淀粉酶基因、枯草杆菌蛋白酶基因、β-内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、prsA 基因和/或酰基转移酶基因。
优选地，信号肽是以下各种酶的信号肽：地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、气单胞菌属(Aeromonas)酰基转移酶(例如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No. 21)、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(例如，mrskklwisllfaltliftmafsnmsaqa- SEQ ID No.22)或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(例如， mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No.23)。合适地，信号肽是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽。
但是，可使用任何能够将被表达的脂质酰基转移酶引导到所选择的芽孢杆菌宿主细胞(优选地衣芽孢杆菌宿主细胞)的分泌途径中的信号肽编码序列。
在本发明的一些实施例中，可将编码信号肽的核苷酸序列有效连接到编码所选择的脂质酰基转移酶的核苷酸序列。
所选择的脂质酰基转移酶可在本文所定义的宿主细胞中表达成融合蛋白。
表达载体
术语“表达载体”意指能够在体内或体外进行表达的构建体 (construct)。
优选地，将表达载体掺入到该生物(如地衣芽孢杆菌宿主)的基因组中。术语“掺入”优选涵盖稳定掺入基因组中。
编码本文所定义的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可存在于载体中，其中该核苷酸序列有效连接到调节序列，使得调节序列能够使该核苷酸序列被合适的宿主生物(如地衣芽孢杆菌)表达，即该载体是表达载体。
可将本发明的载体转化到如上所述的合适宿主细胞中，以使具有本文所定义的脂质酰基转移酶活性的多肽得以表达。
载体(例如质粒、黏粒、病毒或噬菌体载体)的选择通常将取决于其要被引入的宿主细胞。本发明可覆盖起到等同的功能且本领域已经知道的或开始知道的其他形式的表达载体。
一旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可复制并独立于宿主细胞的基因组发挥功能，或者可整合到该基因组本身中。
载体可含有一种或多种选择性标志物基因，如赋予抗生素抗性的基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，可通过共转化来完成选择(如WO 91/17243中所描述)。
载体可在体外(例如)用于产生RNA，或者用来转染或转化宿主细胞。
载体可另外包含使得该载体能在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这种序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、 pAMB1和pIJ702的复制起点。
脂质酰基转移酶
编码供在本发明方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列，可编码天然脂质酰基转移酶或者变体脂质酰基转移酶。
供在本发明方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是天然脂质酰基转移酶或者变体脂质酰基转移酶。
例如，编码供在本发明中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列，可以是如WO 2004/064537、WO 2004/064987、WO 2005/066347、WO 2006/008508、WO 2009/024862或PCT/IB2009/054535中描述的核苷酸序列。这些文献以引用方式并入本文。
本文所用的术语“脂质酰基转移酶”优选意指具有酰基转移酶活性的酶(通常分类为E.C.2.3.1.x，例如2.3.1.43)，故该酶能够将酰基基团从脂质转移到一个或多个受体底物，如以下之一者或多者：甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚单位、糖醇(如抗坏血酸和/或甘油)，优选甘油和/或甾醇，如胆固醇。
优选地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是能够将酰基基团从磷脂(如本文中所定义)转移到糖醇(如抗坏血酸和/或甘油)和/或甾醇、优选甘油或甾醇、最优选甾醇(例如胆固醇)的脂质酰基转移酶。
对于一些方面，本发明的“酰基受体”可以是任何包含羟基基团(-OH) 的化合物，例如多元醇，包括甘油；甾醇；甾烷醇；碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白质或其亚单位，如氨基酸、蛋白质水解物和肽(部分水解的蛋白质)；以及它们的混合物和衍生物。优选地，本发明的“酰基受体”不是水。优选地，本发明的“酰基受体”是糖醇，如多元醇，最优选甘油。就本发明的目的而言，抗坏血酸也认为是糖醇。
酰基受体优选不是单甘油酯。
酰基受体优选不是二甘油酯。
在一个方面，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是可以及能够将酰基基团从脂质转移到甘油、另外还能够将酰基基团从脂质转移到以下物质之一者或多者的脂质酰基转移酶：碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚单位、甾醇和/或甾烷醇，优选它能够转移到糖醇，如抗坏血酸和/或甘油，最优选甾醇如胆固醇和/或植物甾醇/甾烷醇。
在一些方面，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是能够酯化至少约10％、更优选至少约20％、30％、40％、50％、 60％或70％的酰基受体的脂质酰基转移酶。
在优选的方面，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是能够酯化起始乳中存在的胆固醇的至少约10％、更优选至少约20％、30％、40％、50％、60％或70％的脂质酰基转移酶。
优选地，脂质酰基转移酶所作用的脂质底物是以下脂质之一者或多者：磷脂，如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺。
这种脂质底物在本文中可称为“脂质酰基供体”。本文所用的术语卵磷脂涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。
对于一些方面，优选地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是不能够或者基本上不能够作用于三甘油酯和/或1-单甘油酯和/或2-单甘油酯的脂质酰基转移酶。
对于一些方面，优选地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是不显示三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)或不显示显著的三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)的脂质酰基转移酶。
基于甘油三丁酸酯的三酰基甘油脂肪酶活性，按照Food Chemical Codex，第4版，National Academy Press，1996，第803页进行测量，修改之处在于将样品溶解于去离子水中而不是甘氨酸缓冲液中，且恒pH调定点为 5.5而不是7。这篇参考文献以引用方式并入本文。1脂肪酶单位(LIPU)定义为在这些测定条件下每分钟可释放1μmol丁酸的酶量。
供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是基本上不能够作用于三甘油酯的脂质酰基转移酶，其LIPU可为小于5/公斤乳，更优选LIPU为小于0.25/公斤乳，最优选LIPU为小于0.05/公斤乳。
合适地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是可显示以下磷脂酶活性之一者或多者的脂质酰基转移酶：磷脂酶A2 活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。脂质酰基转移酶还可具有磷脂酶B活性(E.C 3.1.1.5)。
合适地，对于一些方面，脂质酰基转移酶可能够将酰基基团从磷脂转移到糖醇，优选甘油和/或抗坏血酸。
合适地，对于一些方面，脂质酰基转移酶可能够将酰基基团从磷脂转移到甾烷醇和/或甾醇，优选胆固醇。
对于一些方面，优选地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶编码这样的脂质酰基转移酶，其能够将酰基基团从磷脂转移到甾醇和/或甾烷醇以形成至少甾醇酯和/或甾烷醇酯。
脂质酰基转移酶可能够将酰基基团从脂质转移到多元醇如甘油和/或甾醇如胆固醇或植物甾醇/甾烷醇。因此，在一个实施例中，本发明的“酰基受体”可以是甘油和/或胆固醇或植物甾醇/甾烷醇。
在一些方面，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可包含GDSx基序和/或GANDY基序。
优选地，脂质酰基转移酶被表征为具有酰基转移酶活性且包含氨基酸序列基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基之一者或多者：L、A、 V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
合适地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或者脂质酰基转移酶，可以是可获自、优选已获自来源于以下科属之一者或多者的生物：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属 (Streptomyces)、酵母菌属(Saccharomyces)、乳酸球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属 (Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌科(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属 (Xanthomonas)和假丝酵母属(Candida)。优选地，脂质酰基转移酶可获自、优选已获自气单胞菌属生物。
在本发明的一些方面，编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码这样的脂质酰基转移酶，其在与SEQ ID No.34所示的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80对应的位置处包含天冬氨酸残基。
在本发明的一些方面，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，是在与SEQ ID No.34所示的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂质酰基转移酶的氨基酸序列中的N-80对应的位置处包含天冬氨酸残基的脂质酰基转移酶。
除此之外或者作为另外一种选择，编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码这样的脂质酰基转移酶，其可包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或者与该氨基酸序列有75％或更高的同源性的氨基酸序列。合适地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码这样的脂质酰基转移酶，其可包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列。
除此之外或者作为另外一种选择，编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码这样的脂质酰基转移酶，其可包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或者与该氨基酸序列有75％或更高的同源性的氨基酸序列。合适地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码这样的脂质酰基转移酶，其可包含SEQ ID No.68所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶具有SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列，或者具有与前述氨基酸序列有至少75％同一性、优选至少80％、优选至少 85％、优选至少95％、优选至少98％同一性的氨基酸序列。
优选地，脂质酰基转移酶可用以下标准来表征：
该酶具有酰基转移酶活性，该活性可定义为酯转移活性，通过该活性，脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分被转移到酰基受体，优选甘油或胆固醇，以形成新的酯；及
该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基之一者或多者：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
优选地，GDSX基序的X为L或Y。更优选地，GDSX基序的X为 L。因此，优选地，本发明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四个保守氨基酸组成。优选地，该基序内的丝氨酸是脂质酰基转移酶的催化性丝氨酸。合适地，GDSX基序的丝氨酸可处在与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)脂质酰基转移酶中的Ser-16对应的位置，这在Brumlik&Buckley(Journal of Bacteriology，1996年4月，第178卷第7 期第2060-2064页)中有说明。
为确定蛋白质是否具有本发明的GDSX基序，优选按照WO 2004/064537或WO 2004/064987(以引用方式并入本文)中教导的程序将该序列与pfam数据库的隐马尔可夫模型图(HMM profiles)进行比较。
优选地，可使用Pfam00657共有序列将脂质酰基转移酶进行比对(完整的说明参见WO 2004/064537或WO 2004/064987)。
优选地，与pfam00657结构域家族的隐马尔可夫模型图(HMM profiles) 阳性匹配则表示存在本发明的GDSL或GDSX结构域。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，供在本发明的方法或用途中使用的脂质酰基转移酶可具有以下各块(block)中的至少一者、优选超过一者、优选超过两者：GDSx块、GANDY块、HPT块。合适地，脂质酰基转移酶可具有GDSx块和GANDY块。或者，该酶可具有GDSx块和 HPT块。优选地，该酶包含至少GDSx块。更多细节参见WO 2004/064537 或WO 2004/064987。
优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA、GGNDL，最优选GANDY。
优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，供在本发明的方法或用途中使用的该酶与参考嗜水气单胞菌(A.hydrophilia)多肽序列(即SEQ ID No.1)相比具有以下氨基酸残基中的至少一个、优选超过一个、优选超过两个、优选超过三个、优选超过四个、优选超过五个、优选超过六个、优选超过七个、优选超过八个、优选超过九个、优选超过十个、优选超过十一个、优选超过十二个、优选超过十三个、优选超过十四个：28His、29His、 30His、31His、32Gly、33Asp、34Ser、35His、130His、131Gly、132His、 133Asn、134Asp、135His、309His。
pfam00657 GDSX结构域是将具有这个结构域的蛋白质与其他酶区分开来的独特标志。
pfam00657共有序列在图3中表示为SEQ ID No.2。这是从pfam家族 00657数据库版本6(在本文中也可称为pfam00657.6)的鉴定得到的。
可通过使用pfam数据库的进一步的版本对共有序列进行更新(例如参见WO 2004/064537或WO 2004/064987)。
在一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是可用以下标准表征的脂质酰基转移酶：
(i)该酶具有酰基转移酶活性，该活性可定义为酯转移活性，藉该活性，脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分被转移到酰基受体，优选甘油或胆固醇，以形成新的酯，优选分别为单甘油酯或胆固醇酯；
(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基之一者或多者：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S；
(iii)该酶包含His-309或者在与图2和4(SEQ ID No.1或SEQ ID No. 3)所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中的His-309对应的位置处包含组氨酸残基。
优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。
在SEQ ID No.3或SEQ ID No.1中，前18个氨基酸残基构成信号序列。该全长序列(即该包括该信号序列的蛋白质)的His-309等于该蛋白质的成熟部分(即不含该信号序列的序列)的His-291。
在一个实施例中，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其包含以下催化性三联体：Ser-34、 Asp-306和His-309，或者在与图4(SEQ ID No.3)或图2(SEQ ID No.1)所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中的Ser-34、Asp-306和His-309对应的位置处分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在 SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的序列中，前18个氨基酸残基构成信号序列。该全长序列(即该包括该信号序列的蛋白质)的Ser-34、Asp-306和 His-309等于该蛋白质的成熟部分(即不含该信号序列的序列)的Ser-16、 Asp-288和His-291。在pfam00657共有序列中，如图3(SEQ ID No.2)中所给出，活性位点残基与Ser-7、Asp-345和His-348相对应。
在一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是可用以下准则表征的脂质酰基转移酶：
该酶具有酰基转移酶活性，该活性可定义为酯转移活性，藉该活性，第一脂质酰基供体的原始酯键的酰基部分被转移到酰基受体以形成新的酯；及
该酶包含至少Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134和His-309，或者在分别与SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示的嗜水气单胞菌脂质酰基转移酶中的Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-306和 His-309对应的位置处包含甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸残基。
合适地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可由以下核苷酸序列之一者编码：
(a)SEQ ID No.36所示的核苷酸序列(参见图29)；
(b)SEQ ID No.38所示的核苷酸序列(参见图31)；
(c)SEQ ID No.39所示的核苷酸序列(参见图32)；
(d)SEQ ID No.42所示的核苷酸序列(参见图35)；
(e)SEQ ID No.44所示的核苷酸序列(参见图37)；
(f)SEQ ID No.46所示的核苷酸序列(参见图39)；
(g)SEQ ID No.48所示的核苷酸序列(参见图41)；
(h)SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(参见图57)；
(i)SEQ ID No.50所示的核苷酸序列(参见图58)；
(j)SEQ ID No.51所示的核苷酸序列(参见图59)；
(k)SEQ ID No.52所示的核苷酸序列(参见图60)；
(l)SEQ ID No.53所示的核苷酸序列(参见图61)；
(m)SEQ ID No.54所示的核苷酸序列(参见图62)；
(n)SEQ ID No.55所示的核苷酸序列(参见图63)；
(o)SEQ ID No.56所示的核苷酸序列(参见图64)；
(p)SEQ ID No.57所示的核苷酸序列(参见图65)；
(q)SEQ ID No.58所示的核苷酸序列(参见图66)；
(r)SEQ ID No.59所示的核苷酸序列(参见图67)；
(s)SEQ ID No.60所示的核苷酸序列(参见图68)；
(t)SEQ ID No.61所示的核苷酸序列(参见图69)；
(u)SEQ ID No.62所示的核苷酸序列(参见图70)；
(v)SEQ ID No.63所示的核苷酸序列(参见图71)；
(w)或者
与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、SEQ ID No.49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、SEQ ID No.58、SEQ ID No. 59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63所示的序列之任一者有70％或更高、优选75％或更高的同一性的核苷酸序列。
合适地，该核苷酸序列可与SEQ ID No.36、SEQ ID No.38、SEQ ID No.39、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、SEQ ID No.46、SEQ ID No.48、 SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.52、SEQ ID No.53、SEQ ID No.54、SEQ ID No.55、SEQ ID No.56、SEQ ID No.57、 SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.60、SEQ ID No.61、SEQ ID No.62或SEQ ID No.63所示的序列之任一者有80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的同一性。
在一个实施例中，编码供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列，是与SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ ID No.63所示的序列之任一者有70％或更高、优选75％或更高的同一性的核苷酸序列。合适地，该核苷酸序列与 SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62和SEQ ID No.63所示的序列之任一者有80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的同一性。
在一个实施例中，编码供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列，是与SEQ ID No.49所示的序列有70％或更高、75％或更高、80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更多的同一性的核苷酸序列。
合适地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是包含以下氨基酸序列之一者或多者的脂质酰基转移酶：
(i)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列
(ii)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列
(iii)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列
(iv)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列
(v)SEQ ID No.7所示的氨基酸序列
(vi)SEQ ID No.8所示的氨基酸序列
(vii)SEQ ID No.9所示的氨基酸序列
(viii)SEQ ID No.10所示的氨基酸序列
(ix)SEQ ID No.11所示的氨基酸序列
(x)SEQ ID No.12所示的氨基酸序列
(xi)SEQ ID No.13所示的氨基酸序列
(xii)SEQ ID No.14所示的氨基酸序列
(xiii)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列
(xiv)SEQ ID No.15所示的氨基酸序列
(xv)SEQ ID No.16所示的氨基酸序列
(xvi)SEQ ID No.17所示的氨基酸序列
(xvii)SEQ ID No.18所示的氨基酸序列
(xviii)SEQ ID No.34所示的氨基酸序列
(xix)SEQ ID No.35所示的氨基酸序列
(xx)SEQ ID No.68所示的氨基酸序列
(xxi)SEQ ID No.121所示的氨基酸序列
(xxii)SEQ ID No.122所示的氨基酸序列
(xxiii)SEQ ID No.123所示的氨基酸序列，或者
与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14或SEQ ID No.15、 SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.68、SEQ ID No.121、SEQ ID No.122或SEQ ID No. 123所示的序列之任一者有75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多的同一性的氨基酸序列。
合适地，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是这样的脂质酰基转移酶，其包含SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或 SEQ ID No.1或SEQ ID No.15或SEQ ID No.16或SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.68、SEQ ID No.121、SEQ ID No.122或SEQ ID No. 123所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列或SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或SEQ ID No.34 所示的氨基酸序列或SEQ ID No.35所示的氨基酸序列或SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或SEQ ID No.121所示的氨基酸序列或SEQ ID No.122所示的氨基酸序列或SEQ ID No.123所示的氨基酸序列有75％或更高、优选 80％或更高、优选85％或更高、优选90％或更高、优选95％或更高的同一性。
合适地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是包含这样的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，该氨基酸序列与SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、 SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.34或SEQ ID No. 35、SEQ ID No.68、SEQ ID No.121、SEQ ID No.122或SEQ ID No.123所示的序列之任一者有80％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的同一性。
合适地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含以下氨基酸序列之一者或多者的脂质酰基转移酶：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基1-100所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基101-200所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基201-300所示的氨基酸序列；或者
(d)与以上(a)-(c)中定义的氨基酸序列之任一者有75％或更高、优选 85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的同一性的氨基酸序列。
合适地，供在本发明的方法和用途中使用的脂质酰基转移酶可包含以下氨基酸序列之一者或多者：
(a)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；
(d)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；
(e)SEQ ID No.3或SEQ ID No.1的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或者
(f)与以上(a)-(e)中定义的氨基酸序列之任一者有75％或更高、优选 85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高的同一性的氨基酸序列。
在一个方面，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其可为EP 1 275 711中说明的来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的脂质酰基转移酶。因此，在一个方面，供在本发明的方法和用途中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No. 17或SEQ ID No.18所示的氨基酸序列之一者的脂质酰基转移酶。
非常优选的是，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其可为包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或者与SEQ ID No.16有75％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高、甚至更优选98％或更高或甚至更优选99％或更高的同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。这个酶可被认为是变体酶。
在一个方面，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其可为卵磷脂：胆固醇酰基转移酶(LCAT) 或其变体(例如通过分子进化产生的变体)。
合适的LCAT是本领域知道的，且可以是可获自例如以下生物之一者或多者：哺乳动物、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥和水稻)、线虫、真菌和酵母。
在一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其可以是可获自、优选已获自含有 pPet12aAhydro和pPet12aASalmo的大肠杆菌菌株TOP 10，所述菌株由 Danisco A/S公司(Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，丹麦)按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》于2003年12月22 日保藏在National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria(NCIMB) (23St.Machar Street，阿伯丁，苏格兰，英国)，登录号分别为NCIMB 41204和NCIMB 41205。
供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是磷脂甘油酰基转移酶。磷脂甘油酰基转移酶包括从气单胞菌属(Aeromonas spp.)、优选嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌、最优选杀鲑气单胞菌或其变体分离的那些磷脂甘油酰基转移酶。
最优选的供在本发明中使用的脂质酰基转移酶由SEQ ID No.1、3、 4、15、16、34和35编码。技术人员会认识到，优选的是该酰基转移酶的信号肽在该转移酶表达过程中已被切除。SEQ ID No.1、3、4和15的信号肽是氨基酸1-18。因此，最优选的区域，对于SEQ ID No.1和SEQ ID No. 3(嗜水气单胞菌)而言是氨基酸19-335，对于SEQ ID No.4和SEQ ID No. 15(杀鲑气单胞菌)而言是氨基酸19-336。当用来确定氨基酸序列的同源性或同一性时，优选的是本文所述的比对采用成熟序列进行。
在一个实施例中，合适地，供在本发明中使用的脂质酰基转移酶包含 SEQ ID No.16所示的氨基酸序列(或由该氨基酸序列组成)或者包含与 SEQ ID No.16有至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的氨基酸序列(或由该氨基酸序列组成)。
在一个实施例中，合适地，供在本发明中使用的脂质酰基转移酶由这样的核苷酸序列编码，其包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(或由该核苷酸序列组成)或者包含与SEQ ID No.49有至少70％、至少75％、至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％同一性的核苷酸序列(或由该核苷酸序列组成)。
因此，最优选的用于确定同源性(同一性)的区域，对于SEQ ID No. 1和3(嗜水气单胞菌)而言是氨基酸19-335，对于SEQ ID No.4、15(杀鲑气单胞菌)而言是氨基酸19-336。SEQ ID No.34和35是分别来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶的成熟蛋白质序列，其可能进行或没有进行进一步的翻译后修饰。
供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是也可从喜热裂孢菌属(Thermobifida)分离、优选从褐色喜热裂孢菌(T.fusca)分离、最优选由SEQ ID No.28编码的脂质酰基转移酶。
供按照本发明和/或在本发明方法使用的合适脂质酰基转移酶，可包含以下氨基酸序列之任一者和/或由以下核苷酸序列编码：
a)编码这样的多肽的核酸，该多肽显示脂质酰基转移酶活性，且与 SEQ ID No.16所示的多肽序列或与SEQ ID no.68所示的多肽或与 SEQ ID no.121所示的多肽或与SEQ ID no.122所示的多肽或与SEQ ID no.123所示的多肽有至少70％同一性(优选至少80％、更优选至少90％同一性)；
b)这样的(分离了的)多肽，其包含SEQ ID No.16或SEQ ID No.68 所示的氨基酸序列(或由该氨基酸序列组成)或者包含与SEQ ID No.16、SEQ ID No.68、SEQ ID No.121、SEQ ID No.122或SEQ ID No.123有至少70％同一性(优选至少80％同一性、更优选至少 90％同一性)的氨基酸序列(或由该氨基酸序列组成)；
c)编码脂质酰基转移酶的核酸，该核酸包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(或由该核苷酸序列组成)或者包含与SEQ ID No.49所示的核苷酸序列有至少70％同一性(优选至少80％、更优选至少 90％同一性)的核苷酸序列(或由该核苷酸序列组成)；
d)这样的核酸，其在中等或高严格性条件下与包含SEQ ID No.49所示的核苷酸序列的核酸探针杂交，且编码显示脂质酰基转移酶活性的多肽；
e)这样的核酸，其为a)、c)或d)中所指示的核酸序列的片段；或者
f)这样的多肽，其为b)中所指示的多肽的片段。
供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是也可从链霉菌属(Streptomyces)分离、优选从艾弗链霉菌(S.avermitis)分离、最优选由SEQ ID No.32编码的脂质酰基转移酶。来自链霉菌属的供在本发明中使用的其他可能的酶包括由SEQ ID No 5、6、9、10、11、12、13、 14、31和33编码的那些酶。
供在本发明中使用的酶也可从棒杆菌属(Corynebacterium)分离，优选从有效棒杆菌(C.efficiens)分离，最优选由SEQ ID No.29编码。
合适地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的氨基酸序列之任一者或者与所述氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、 90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或者可由SEQ ID No.36、39、42、44、46或48所示的核苷酸序列之任一者或者与所述核苷酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％或98％同一性的核苷酸序列编码。
在一个实施例中，编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列选自：
a)包含SEQ ID No.36所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遗传密码的简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其包含SEQ ID No.37所示的氨基酸序列或者与该氨基酸序列有至少60％同一性的氨基酸序列。
在又一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的氨基酸序列之任一者或者与所述氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶，或者可由SEQ ID No.39、42、44、46或48所示的核苷酸序列之任一者或者与所述核苷酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、 96％、97％或98％同一性的核苷酸序列编码。
在又一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No.38、40、41、45或47所示的氨基酸序列之任一者或者对于本文所述的用途而言与所述氨基酸序列有至少 70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在又一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No.38、40或47所示的氨基酸序列之任一者或者对于本文所述的用途而言与所述氨基酸序列有至少70％、75％、 80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
更优选地，在一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No.47所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施例中，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No.43或44所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在另一个实施例中，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶，可以是包含SEQ ID No.41所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂质酰基转移酶。
在一个实施例中，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可由选自以下的核酸编码：
a)包含SEQ ID No.36所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遗传密码的简并性而与SEQ ID No.36的核苷酸序列相关的核酸；和
c)包含与SEQ ID No.36所示的核苷酸序列有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一个实施例中，本发明的脂质酰基转移酶可以是可获自、优选已获自链霉菌属菌株L130或L131的脂质酰基转移酶，所述菌株由Danisco A/S 公司(Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，丹麦)按照《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》于2004年6月23日保藏在National Collection of Industrial，Marine and Food Bacteria(NCIMB)(23St.Machar Street，阿伯丁，苏格兰，英国)，登录号分别为NCIMB 41226和NCIMB 41227。
编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的合适核苷酸序列，可对编码脂质酰基转移酶(SEQ ID No.16)的多核苷酸进行编码；或者可对编码脂质酰基转移酶(SEQ ID No.16)的氨基酸序列进行编码。
供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的合适脂质酰基转移酶，可以是可用Align X(VectorNTI的Clustal W双序列比对算法)采用默认设置通过与L131(SEQ ID No.37)比对进行鉴定的氨基酸序列。
L13l与来自除虫链霉菌(S.avermitilis)和褐色喜热裂孢菌(T.fusca)的同源物的比对，揭示了GDSx基序(L131和除虫链霉菌和褐色喜热裂孢菌中的GDSY)、GANDY框(为GGNDA或GGNDL)和HPT块(认为是保守的催化性组氨酸)的保守性。这三个保守块突出地显示在图42中。
当与pfam Pfam00657共有序列(如WO 2004/064987中描述)和/或本文所公开的L131序列(SEQ ID No 37)比对时，有可能鉴定到三个保守区域即GDSx块、GANDY块和HTP块(更多细节参见WO 2004/064987)。
当与pfam Pfam00657共有序列(如WO 2004/064987中描述)和/或本文所公开的L131序列(SEQ ID No 37)比对时
i)供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是具有GDSx基序、更优选为选自GDSL或GDSY基序的GDSx 基序的脂质酰基转移酶。
和/或
ii)供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是具有GANDY块、更优选为包含氨基GGNDx(更优选为 GGNDA或GGNDL)的GANDY块的脂质酰基转移酶。
和/或
iii)供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是优选地具有HTP块的脂质酰基转移酶。
及优选地
iv)供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是优选地具有GDSx或GDSY基序和GANDY块和HTP块(保守组氨酸)的脂质酰基转移酶，所述GANDY块包含氨基GGNDx，优选GGNDA或GGNDL。
本文所用的脂质酰基转移酶可称为甘油磷脂胆固醇酰基转移酶。换句话说，供在本发明中使用的脂质酰基转移酶优选地具有“水解”磷脂并同时用水解产生的游离脂肪酸酯化胆固醇的能力，这事实上是转移酶反应(即相互酯化和/或酯交换反应)。
“水解”的程度可描述为磷脂酰胆碱(PC)和/或磷脂酰乙醇胺(PE)分别转化成溶血磷脂酰胆碱或溶血磷脂酰乙醇胺的比例。通过将磷脂酰胆碱酶促水解成溶血磷脂酰胆碱，磷脂分子的亲水部分(极性首基)和疏水部分(脂肪酸链)之间的比例被改变。通过除去一个脂肪酸(饱和和/或不饱和脂肪酸)，疏水部分减少，从而使整个分子更具亲水性。此外，立体分子构象可被改变，这可影响处于分散状态的分子所形成的相结构(例如胶粒形成 (micellation))，以及与其他分子(如乳蛋白质)的相互作用。
溶血卵磷脂产品已知具有改进的乳化性质。相互酯化和/或酯交换的程度高，则在比较乳化试验中有可能获得较小的平均小油滴尺寸。
脂质酰基转移酶的功能是，胆固醇和磷脂将被变成胆固醇酯和溶血磷脂，从而使两个所产生的组分对于O/W乳液具有表面活性性质。因此，最终产物将不含胆固醇或者所含的胆固醇显著减少，并具有改进的乳液稳定性。
本发明的酶优选不是磷脂酶，如分类为E.C.3.1.1.32的磷脂酶A1或者分类为E.C.3.1.1.4的磷脂酶A2。
变体脂质酰基转移酶
在一个优选的实施例中，编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可编码属变体脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶。
可以使用对磷脂的活性提高的变体，例如对磷脂的水解活性提高和/或转移酶活性提高，优选对磷脂的转移酶活性提高。
优选地，通过对如上定义的脂质酰基转移酶进行一个或多个氨基酸修饰来制备变体脂质酰基转移酶。
合适地，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是可为变体脂质酰基转移酶的脂质酰基转移酶，在这个情况中，该酶的特征可在于该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X为以下氨基酸残基之一者或多者：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中该变体酶与亲本序列相比在组2或组4或组6或组7中定义(如WO 2005/066347 及下文中所定义)的氨基酸残基之任一者或多者处包含一个或多个氨基酸修饰。
例如，变体脂质酰基转移酶的特征可在于，该酶包含氨基酸序列基序 GDSX，其中X为以下氨基酸残基之一者或多者：L、A、V、I、F、Y、 H、Q、T、N、M或S，且其中该变体酶与亲本序列相比在组2或组4或组 6或组7中详示(如WO 2005/066347及下文中所定义)的氨基酸残基之任一者或多者处包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸残基是通过将所述亲本序列与本文所定义的P10480的结构模型进行结构比对鉴定的，该结构模型优选是通过将P10480晶体结构坐标与WO 2005/066347及下文中所定义的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB进行结构比对获得的。
在又一个实施例中，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是这样的变体脂质酰基转移酶，其特征可在于该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X为以下氨基酸残基之一者或多者：L、A、 V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S，且其中该变体酶与亲本序列相比在组 2教导的氨基酸残基之任一者或多者处包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸残基是当将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2-图3)进行比对鉴定的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保WO 2005/066347 及下文中所定义的最佳拟合重叠(best fit overlap)。
合适地，供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶可以是可包含这样的氨基酸序列的变体脂质酰基转移酶，该氨基酸序列如 SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、 SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或 SEQ ID No.35所示，例外的是在组2或组4或组6或组7(如WO 2005/066347及下文中所定义)中定义的氨基酸残基之任一者或多者处有一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸残基是通过与SEQ ID No.34进行序列比对鉴定的。
或者，脂质酰基转移酶可以是包含这样的氨基酸序列的变体脂质酰基转移酶，该氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示，例外的是在组2或组4或组6或组7(如WO 2005/066347及下文中所定义)中定义的氨基酸残基之任一者或多者处有一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸残基是通过将所述亲本序列与本文所定义的P10480的结构模型进行结构比对得以鉴定的，所述结构模型优选是通过将P10480晶体结构坐标与WO 2005/066347及下文中所教导的1IVN.PDB和/或1DEO.PDB进行结构比对获得的。
或者，脂质酰基转移酶可以是包含这样的氨基酸序列的变体脂质酰基转移酶，该氨基酸序列如SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No. 26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33或SEQ ID No.35所示，例外的是在组2教导的氨基酸残基之一者或多者处有一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸残基是当将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No.2)进行比对鉴定的，并根据 P10480的结构模型进行修饰以确保WO 2005/066347及下文中所教导的最佳拟合重叠。
优选地，亲本酶是包含SEQ ID No.34和/或SEQ ID No.15和/或SEQ ID No.35所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列同源的酶。
优选地，脂质酰基转移酶可以是包含这样的氨基酸序列的变体酶，该氨基酸序列如SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示，例外的是在如WO 2005/066347及下文中所定义的组2或组4或组6或组7中定义的氨基酸残基之一者或多者处有一个或多个氨基酸修饰。
其他合适的供在本发明方法/用途中使用的变体脂质酰基转移酶是 PCT/IB2009/054535中描述的那些变体脂质酰基转移酶。
脂质酰基转移酶的三级结构揭示了不寻常和有趣的能让脂质酰基转移酶更成功地进行工程改造的结构。具体而言，脂质酰基转移酶三级结构揭示了穴和谷结构(cave and canyon structure)，构成这些结构的残基在下文中定义。
穴区域中的变更可(例如)改变该酶的底物链长度特异性。
已发现谷中的变更(特别是一些优选的关键修饰)对于例如增强或改变该酶对其底物特异性是重要的。
具体而言，本发明人发现在谷中有多个这样的修饰，它们等级高(rank highly)且产生出具有改进的性质的引人注目的变体-这些修饰可在位置 31、27、85、86、119和120处找到。在一些实施例中，位置31和/或27高度优选。
这些变体脂质酰基转移酶可由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与编码亲本脂质酰基转移酶的核苷酸序列有至少90％同一性并在这样的位置处包含至少一个修饰(合适地，至少两个修饰)，所述位置为在所编码的氨基酸序列中与位于a)该酶的谷区域和/或b)插入位点1和/或c)插入位点 2中的氨基酸对应，其中该酶的谷区域、插入位点1和/或插入位点2定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16或SEQ ID No. 68所示的酶的谷区域、插入位点1或插入位点2对应的区域，如下文所述。
在一个实施例中，优选地，将在位于该谷和/或插入位点1和/或插入位点2中的位置处的修饰与在这样的位置处的至少一个修饰进行组合，所述后一位置为在所编码的氨基酸序列中与位于该谷区域和/或插入位点1和/或插入位点2之外的氨基酸对应。
在一个实施例中，脂质酰基转移酶在这样的位置处包含至少一个修饰 (合适地，至少两个修饰)，所述位置为在所编码的氨基酸序列中与位于位置27、31、85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选地位于位置27、31、85、86、119和/或120，更优选位于位置27和/或31) 处的氨基酸对应，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
在又一个实施例中，变体脂质酰基转移酶在这样的位置处包含至少一个修饰，且还包含至少一个另外的修饰与前述修饰相组合，所述位置在所编码的氨基酸序列中与位于位置27和/或31处的氨基酸对应，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
合适地，该至少一个另外的修饰可以是在以下位置之一者或多者处：位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、 233、33、207、130，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
供在本发明中使用的脂质酰基转移酶氨基酸序列可包含经修饰的主链，使得至少一个修饰(合适地，至少两个修饰)在这样的位置处作出，所述位置为在所编码的氨基酸序列中与位于a)该酶的谷区域和/或b)插入位点 1和/或c)插入位点2中的氨基酸对应，其中该酶的谷区域、插入位点1和/ 或插入位点2定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16或SEQ ID No.68所示的酶的谷区域、插入位点1或插入位点2分别对应的区域。
在一个实施例中，优选地，将在位于该谷和/或插入位点1和/或插入位点2中的位置处的修饰与在这样的位置处的至少一个修饰进行组合，所述后一位置为在所编码的氨基酸序列中与位于该谷区域和/或插入位点1和/或插入位点2之外的氨基酸对应。
优选地，脂质酰基转移酶氨基酸序列主链被修饰，使得至少一个修饰 (合适地，至少两个修饰)在这样的位置处作出，所述位置为在所编码的氨基酸序列中与位于位置27、31、85、86、122、119、120、201、245、 232、235和/或236(优选地位于位置27、31、85、86、119和/或120，更优选位于位置27和/或31)处的氨基酸对应，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
在另外优选的实施例中，脂质酰基转移酶氨基酸序列主链在这样的位置处包含至少一个修饰(合适地，至少两个修饰)，且还包含至少一个另外的修饰与前述修饰相组合，所述位置为在所编码的氨基酸序列中与位于位置 27、31处的氨基酸对应，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
合适地，该至少一个另外的修饰可以是在以下位置之一者或多者处：位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、 233、33、207、130，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
还提供的是供在本发明中使用的经改变的脂质酰基转移酶或变体脂质酰基转移酶，所述经改变的脂质酰基转移酶或变体脂质酰基转移酶包含与本文中以SEQ ID No.16或68所示的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶有至少70％同一性的氨基酸序列，其中紧靠所述经改变的脂质酰基转移酶的催化性三联体的Asp残基的N末端的底物链长度特异性决定区段相对于所述本文中以SEQ ID No.16或68所示的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶而言具有改变了的长度。
优选地，该改变包括所述底物链长度特异性决定区段中的氨基酸插入或缺失，如将所述亲本酶的所述底物链长度特异性决定区段用另一不同的脂质酰基转移酶的底物链长度特异性决定区段置换以产生所述经改变的脂质酰基转移酶。优选地，所述改变增加可被所述脂质酰基转移酶转移的酰基链的长度。
优选地，经改变的脂质酰基转移酶包含与本文中以SEQ ID No.16或 68所示的来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶有至少90％同一性的氨基酸序列。
编码修饰之前的变体脂质酰基转移酶的核苷酸序列，是本文中以SEQ ID No.120、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No. 62、SEQ ID No.63或SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；或者是与本文中以 SEQ ID No.120、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63或SEQ ID No.24所示的核苷酸序列有至少70％同一性(优选地，至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％同一性) 的核苷酸序列；或者是因遗传密码的简并性而与SEQ ID No.120、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No.51、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63、 SEQ ID No.24相关的核苷酸序列；或者是在中等严格性或高严格性条件下与本文中以SEQ ID No.120、SEQ ID No.49、SEQ ID No.50、SEQ ID No. 51、SEQ ID No.62、SEQ ID No.63或SEQ ID No.24所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在一个优选的实施例中，变体脂质酰基转移酶由在中等或高严格性条件下与SEQ ID No.49或SEQ ID No.120或者SEQ ID No.49或SEQ ID No. 120的互补序列的基本上整个长度杂交的核酸(优选分离或重组核酸)序列，其中所编码的多肽包含一个或多个选自以下的氨基酸残基：在位置31 处，为Q、H、N、T、F、Y或C；在位置86，为R、Y、S、V、I、A、 T、M、F、C或L；在位置27处，为R、G、H、K、Y、D、N、V、C、Q、L、E、S或F；在位置85处，为H、R、D、E；在位置119处，为T或 I；在位置120处，为K或E；在位置122处，为S、L、A、F、W、Y、 R、H、M或C；在位置201处，为R；在位置245处，为S；在位置235 处，为A或V；在位置232处，为G或S；在位置236处，为G或E，其中所述位置为SEQ ID No.16的对等氨基酸位置。
变体脂质酰基转移酶可包含这样的前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性，且包含与SEQ ID No.16或68所示的氨基酸序列有至少90％(优选地，至少95％、更优选至少98％、更优选至少99％)同一性的氨基酸序列并在以下位置的一者或多者处包含一个或多个修饰：位置27、31、85、 86、122、119、120、20l、245、232、235和/或236(优选地，位置27、 31、85、86、119和/或120，更优选地，位置27和/或31)。
在一个实施例中，变体脂质酰基转移酶包含这样的前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性且包含与SEQ ID No.16或68所示的氨基酸序列，例外的是在以下位置之一者或多者处有一个或多个修饰：位置27、31、 85、86、122、119、120、201、245、232、235和/或236(优选地，位置 27、31、85、86、119和/或120，更优选地，位置27和/或31)。
在另一个实施例中，脂质酰基转移酶包含这样的前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性且包含与SEQ ID No.16或68所示的氨基酸序列有至少90％(优选地，至少95％、更优选至少98％、更优选至少99％)同一性的氨基酸序列并在位置27和/或31处包含一个或多个修饰，且还包含至少一个另外的修饰与前述修饰相组合，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.6所示的酶的相同位置对应的位置。
合适地，该至少一个另外的修饰可以是在以下位置之一者或多者处：位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、 233、33、207、130，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
在一个优选的实施例中，脂质酰基转移酶包含这样的前肽或多肽，其具有脂质酰基转移酶活性且包含SEQ ID No.16或68所示的氨基酸序列，例外的是在以下位置的一者或多者处有一个或多个修饰：27和/或31，且还包含至少一个另外的修饰与前述修饰相组合。
合适地，该至少一个另外的修饰可以是在以下位置的一者或多者处：位置85、86、122、119、120、201、245、23、81、82、289、227、229、 233、33、207和/或130，其中所述位置编号定义为当基于一级或三级结构进行比对时，与本文以SEQ ID No.16所示的酶的相同位置对应的位置。
脂质酰基转移酶可以是前肽，其会发生进一步的翻译后修饰而成为成熟肽，即具有脂质酰基转移酶活性的多肽。仅举例说，SEQ ID No.68与 SEQ ID No.16相同，例外的是SEQ ID No.68发生了翻译后和/或转录后修饰以去除一些氨基酸，更具体而言38个氨基酸。因此，本文中以SEQ ID No.16所示的多肽在某些场合下(即在一些宿主细胞中)可被认为是前肽，其通过翻译后和/或转录后修饰进一步被加工成为成熟肽。就翻译后和/或转录后修饰而言，精确的修饰(例如切割位点)可随宿主物种而稍有不同。在一些宿主物种中，可能没有翻译后和/或转录后修饰，因此，前肽将等同于成熟肽(即具有脂质酰基转移酶活性的多肽)。不想受理论的约束，但还是认为切割位点可在任一方向上偏移几个残基(例如1、2或3个残基)，这是相比于SEQ ID No.68与SEQ ID No.16比较所示的切割位点得出的。换句话说，不是在(例如)位置235-ATR至位置273(RRSAS)处切割，而是可在(例如)残基232、233、234、235、236、237或238处开始切割。除此之外或者作为另外一种选择，可在(例如)残基270、271、272、273、 274、275或276处终止切割。除此之外或者作为另外一种选择，切割可导致去除约38个氨基酸，在一些实施例中，切割可导致去除30-45个残基，如34-42个残基，如36-40个残基，优选38个残基。
在一些实施例中，为了确定与一级结构的同源性，将脂质酰基转移酶的氨基酸序列与本文以SEQ ID No.16或68一级序列所示的脂质酰基转移酶直接比较，特别是与已知在所有或大多数其序列已知的脂质酰基转移酶中不变的残基组直接比较。在将保守残基进行比对之后(容许必要的插入和缺失以维持比对，即避免通过任意的缺失和插入消除保守残基)，与SEQ ID No.16或68的一级序列中的特定氨基酸对等的残基得到定义。在优选的实施例中，保守残基的比对保守着100％的这种残基。但是，大于75％或少至 50％的保守残基的比对也足以定义对等的残基。在优选的实施例中，催化性丝氨酸和组氨酸残基的保守性得到维持。保守残基用来在其他脂质酰基转移酶中定义SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的相应对等氨基酸残基，所述其他脂质酰基转移酶例如来自其他种类的气单胞菌以及任何其他生物。
为了将亲本脂质酰基转移酶与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68(参考序列)进行比对，可采用诸如双序列比对的序列比对法 (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)。由此，可确定并修饰另选的亲本脂质酰基转移酶多肽中的对等氨基酸，所述对等氨基酸对应于参考SEQ ID No.68或SEQ ID No.16而定义的氨基酸之一者或多者。技术人员会容易认识到，当采用EMBOSS双序列比对时，标准的设置通常就足够。可使用“needle”来鉴定相应的残基，以作出遍及两个序列全长的比对。但是，使用“water”，也有可能找到两个序列之间的最佳相似性区域。
或者，尤其在亲本脂质酰基转移酶与SEQ ID No.16或SEQ ID No.68 共享低的一级序列同源性的情况中，可通过与SEQ ID No.68或SEQ ID No. 16(优选SEQ ID No.68)的结构模型进行结构比对，确定另选的亲本脂质酰基转移酶中与参考SEQ ID No.16或SEQ ID No.68而定义的氨基酸之一者或多者对应的相应氨基酸。
因此，对于其三级结构已通过X射线晶体学测定的脂质酰基转移酶而言，可通过在三级结构的水平上确定同源性来定义对等的残基。在这个情形中，“对等残基”定义为这样的残基，即本文以SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的特定氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标(N 对N，CA对CA，C对C和O对O)在比对后偏差在0.13nm以内，优选 0.1nm以内。比对是在将最佳模型进行取向和定位以使所关注的脂质酰基转移酶的非氢蛋白原子的原子坐标与本文以SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶达到最大重叠而实现的。为本领域习知，最佳的模型是在最高的有效分辨率下，给出最低的实验衍射数据R因子的结晶学模型。在功能上和/或结构上与本文以SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的特定残基类似的对等残基，定义为该脂质酰基转移酶的这样的氨基酸，它们优先呈某种构象，使得它们改变、修饰或调节蛋白质结构，以按确定的和归因于本文以SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的特定残基的方式实现底物特异性(例如底物结合和/或催化)的变化，。此外，它们是该脂质酰基转移酶的这样的残基(在已通过X射线晶体学获得了三级结构的情况中)，即这些残基占据类似位置达到这样的程度，即尽管给定的残基的主链原子在占据同源位置的基础上可能不满足对等标准，但该残基的至少两个侧链原子的原子坐标偏离本文中以SEQ ID No.16或68所示的脂质酰基转移酶的相应侧链原子在0.13nm以内。
本文中以SEQ ID No.68所示的脂质酰基转移酶(其是包含N80D突变的杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶)的三维结构的坐标在PCT/IB2009/054535 中有描述，并可用于在三级结构的水平上确定对等残基。
与结构上类似的大肠杆菌硫酯酶相比得知，在杀鲑气单胞菌的酰基转移酶中在最后的β折叠链和ASP-X-X_HIS基序之间有大的插入。这个插入产生大的洞(cavity)(以下称为“穴(cave)”)，其结合酰基酶中间体的脂族链。调节这个区域的序列和大小，可产生出该酰基酶中间体的脂族链(即被该酶转移的酰基链)的更小或更大的“穴”或洞。因此，这个家族的酶可被加工改造成优先转移不同长度的酰基链。
相对于大肠杆菌硫酯酶(PDB条目1IVN)，在杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶中找到四个插入，它们将两个结构共有的二级结构单元联接在一起。
本文中以SEQ ID No.68所示的脂质酰基转移酶中的这些插入的氨基酸坐标在下表中列出：
表：脂质酰基转移酶中的插入：
插入 残基 插入1 22-36 插入2 74-88 插入3 162-168 插入4 213-281
如PCT/IB2009/054535中详细描述，在脂质酰基转移酶中，有大的表面积可供底物结合，该表面积可被分成两个被Ser 16和His 291隔开的区域，其中Ser 16和His 291连同Asp288一起形成特征性的催化性三联体。这两个区域可被表征为深沟或“谷”-下文称为“谷”-从而导致贯穿分子的封闭的洞或“穴”。
构成该谷的残基在下表中列出。
表：谷残基：
插入1 M23，M27，Y30，L31 区段1 F42，G67，G68 插入2 D80，P81，K82，Q84，V85，I86 区段2a Y117，A119，Y120 插入4 G229，Y230，V231
构成该穴的残基在下表中列出。
表：穴残基：
区段1 D15，S16，L18 区段2 W111，A114，L115，L118 区段3 P156，D157，L158，Q160，N161 区段4 F206，A207，E208，M209，L210 区段5 M285，F286，V290，H291，P292V295
区段3和4分别在插入3和4之前，而区段5紧接在插入4之后。插入 4和5也对导致产生该穴的外围绕物(over enclosure)有贡献，从而该穴与该谷不同之处在于插入1和2构成该谷的内衬，而插入3和4构成覆盖结构。插入3和插入4覆盖该穴。
在一个实施例中，可通过修饰该谷、该穴、插入1、插入2、插入3或插入4之一者或多者中的氨基酸残基，来改变供在本发明中使用的脂质酰基转移酶。
在一个实施例中，可通过修饰该谷、插入1或插入2之一者或多者中的氨基酸残基，来改变供在本发明中使用的脂质酰基转移酶。
在一个实施例中，可通过对构成较大的穴的氨基酸残基作出改变，来改变脂质酰基转移酶的酰基链结合洞的尺寸。这可通过调节以上所讨论的连接二级结构的共有特征的区域的大小来实现。具体而言，可通过改变该酶的最后(第五个)β折叠链和构成催化性三联体的一部分的Asp-X-X-His基序之间的区域中的氨基酸，来改变该穴的大小。
脂质酰基转移酶的底物链长度特异性决定区段，是位于该酶的β5β折叠链和该酶的催化性三联体的Asp残基(Asp残基是Asp-Xaa-Xaa-His基序的一部分)之间的连续氨基酸区域。
杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶和大肠杆菌硫酯酶(在NCBI的Genbank 数据库以登录号1IVN_A；GID：33357066寄存)的三级结构-其各自显示特征性三层α/β/α结构，其中β片层由五个平行链组成-使得可以确定每个脂质酰基转移酶的底物链长度特异性决定区段。
杀鲑气单胞菌脂质酰基转移酶的底物链长度特异性决定区段紧邻该酶的催化性三联体的Asp残基的N末端。但是，底物链长度特异性决定区段的长度可根据该酶的Asp残基和β5β链之间的距离而变。例如，脂质酰基转移酶的各底物链长度特异性决定区段的长度分别为约13个氨基酸、19个氨基酸至约70个氨基酸。由此，取决于脂质酰基转移酶，底物链长度特异性决定区段的长度可在10-70个氨基酸之间，例如长度在10-30个氨基酸之间、30-50个氨基酸之间或者50-70个氨基酸之间。
下表提供脂质酰基转移酶的底物链长度特异性决定区段的示例性序列。
在某些实施例中，底物链长度特异性决定区段的氨基酸序列可以是或不是野生型酶的氨基酸序列。在某些实施例中，该底物链长度特异性决定区段可具有与野生型脂质酰基转移酶的底物链长度特异性决定区段有至少 70％、例如至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
合适地，变体酶可用定点诱变制备。
优选的修饰位于以下位置之一者或多者处：L031、I086、M027、 V085、A119、Y120、W122、E201、F235、W232、A236和/或Q245。
具体而言，关键修饰包括以下修饰之一者或多者：L31Q，H，N，T，F，Y 或C(优选L31Q)；M27R，G，H，K，Y，D，N，V，C，Q，L，E，S或F(优选 M27V)；V85H，R，D或E；I86R，Y，S，V，I，A，T，M，F，C或L(优选I86S 或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S，L或A(优选W122L)； E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S；和/或A236G或E。
在一个实施例中，当在该谷中作出该至少一个修饰时，所述修饰是在以下位置之一者或多者处作出：位置31、27、85、86、119、120。
具体而言，该谷中的关键修饰包括以下修饰之一者或多者：L31Q，H，N， T，F，Y或C(优选L31Q)；M27R，G，H，K，Y，D，N，V，C，Q，L，E，S或F (优选M27V)；V85H，R，D或E；I86R，Y，S，V，I，A，T，M，F，C或L(优选 I86S或A)；A119T或I；Y120K或E，这些修饰可互相组合和/或与另外的修饰组合。
在一个实施例中，优选地，当在插入位点1中作出修饰时，所述修饰在位置31和/或27之一者或多者处作出。合适地，所述修饰可以是L31Q，H， N，T，F，Y或C(优选L31Q)和/或M27R，G，H，K，Y，D，N，V，C，Q，L，E，S 或F(优选M27V)。
在一个实施例中，优选地，当在插入位点2中作出修饰时，所述修饰在位置085、086处作出。合适地，所述修饰可以是V85H，R，D或E和/或 I86R，Y，S，V，I，A，T，M，F，C或L。
在一个实施例中，优选地，当在插入位点4中作出修饰时，所述修饰在位置245处作出。合适地，所述修饰可以是Q245S。
在一个实施例中，优选地，在至少插入位点1中作出修饰。
在另一个实施例中，优选地，在至少插入位点1中作出修饰，同时在插入位点2和/或4中和/或在以下位置之一者或多者处作出另外的修饰与之组合：位置119、120、122、201、77、130、82、120、207、167、227、 215、230、289。
在又一个实施例中，优选地，在至少谷区中作出修饰，同时在插入位点4中和/或在以下位置之一者或多者处作出另外的修饰与之组合：位置 122、201、77、130、82、120、207、167、227、215、230、289。
对于特定的位点，给出优选的修饰：
R130R，V，Q，H，A，D，L，I，K，N，C，Y，G，S，F，T或M；
K82R，N，H，S，L，E，T，M或G；
G121S，R，G，E，K，D，N，V，Q或A；
Y74Y或W；
Y83F或P；
I77T，M，H，Q，S，C，A，E，L，Y，F，R或V；
A207E；
Q167T，H，I，G，L或M；
D227L，C，S，E，F，V，I，T，Y，P，G，R，D，H或A；
N215G；
Y230A，G，V，R，I，T，S，N，H，E，D，Q，K；或者
N289P。
与位置31、27、85、86、119、120、122、201、245、235、232和/或 236处的一个或多个修饰(例如修饰可以是以下之一者或多者：L31Q，H，N， T，F，Y或C(优选L31Q)；M27R，G，H，K，Y，D，N，V，C，Q，L，E，S或F (优选M27V)；V85H，R，D或E；I86R，Y，S，V，I，A，T，M，F，C或L(优选 I86S或A)；A119T或I；Y120K或E；W122S，L或A(优选W122L)； E201R；Q245S；F235A或V；W232G或S和/或A236G或E)相组合的是，合适地，变体脂质酰基转移酶可另外在以下位置之一者或多者处被修饰：位置130、82、121、74、83、77、207、167、227、215、230、289 (例如，该另外的修饰可以是以下之一者或多者：R130R，V，Q，H，A，D，L，I， K，N，C，Y，G，S，F，T或M；K82R，N，H，S，L，E，T，M或G；G121S，R，G，E， K，D，N，V，Q或A；Y74Y或W；Y83F或P；I77T，M，H，Q，S，C，A，E，L，Y， F，R或V；A207E；Q167T，H，I，G，L或M；D227L，C，S，E，F，V，I，T，Y，P， G，R，D，H或A；N215G；Y230A，G，V，R，I，T，S，N，H，E，D，Q，K和/或 N289P)，优选地，变体脂质酰基转移酶可另外在以下位置之一者或多者处被修饰：130、82、77或227。
为避免疑问起见，该脂质酰基转移酶主链当与本文以SEQ ID No.16所示的脂质酰基转移酶进行比对(基于一级或三级结构)时，优选地在位置 80处具有D。因此我们证实了在本文中教导的许多组合中N80D为修饰。如果N80D不被提出为合适的修饰，且亲本主链在位置80处不包含D，则在变体脂质酰基转移酶应掺入另外的N80D修饰，以确保该变体在位置80 处包含D。
当主链或亲本脂质酰基转移酶已经含有N80D修饰，则可在不提及 N80D修饰的情况下表示其他修饰，即例如L31Q、N80D、W122L本来可被表示为L31Q、W122L。
但是，要着重指出的是，N80D修饰是优选的修饰，且优选使用在位置 80处已经具有氨基酸D的主链酶或亲本酶。但是，如果使用在位置80处不含氨基酸D的主链(如(例如)本文以SEQ ID No.1、3、4、15、34或35 所示的脂质酰基转移酶之一者或多者)，则优选地包括另外的N80D修饰。
合适地，通过将亲本序列与SEQ ID No.68或SEQ ID No.16进行比对所鉴定出的位置31处的置换，可以是选自以下的氨基酸残基的置换：Q、 H、Y和F，优选Q。
合适地，变体多肽在以下氨基酸残基位置之任一者或多者处包含一个或多个另外的修饰：27、77、80、82、85、85、86、121、122、130、167、 207、227、230和289，所述位置为通过将亲本序列与SEQ ID No.68进行比对鉴定的。合适地，所述一个或多个另外的修饰之至少一者可以是在以下氨基酸残基位置处：86、122或130，所述位置为通过将亲本序列与SEQ ID No.68进行比对鉴定的。
合适地，变体脂质酰基转移酶包含以下另外的置换之一者或多者：I86 (A，C，F，L，M，S，T，V，R，I或Y)；W122(S，A，F，W，C，H，L，M，R或 Y)；R130(A，C，D，G，H，I，K，L，M，N，Q，T，V，R，F或Y)；或者它们的任何组合。
变体脂质酰基转移酶可包含以下修饰的组合之一者(其中亲本主链已经在位置80处包含氨基酸D，该修饰可在不提及N80D的情况下表示)：
L31Q，N80D，I86S，W122F
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，I86V，W122L
L31Q，N80D，I86I，W122L
L31Q，N80D，I86S，R130R
L31Q，N80D，K82R，I86A
L31Q，N80D，I86S，W122W
L31Q，N80D，I86S，W122Y
M27V，L31Q，NS0D
L31Q，N80D，I86A，W122L
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，I86S，G121S
L31Q，N80D，I86S
L31Q，N80D，K82R，I86S
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130Y
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130V
L31Q，N80D，I86S
L31Q，N80D，I86T，W122L
L31Q，N80D，I86S，W122L
L31Q，N80D，W122L，R130Q
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130R
L31Q，N80D，I86S
L31Q，N80D，G121R
L31Q，N80D，I86A
M27C，L31Q，N80D
M27Q，L31Q，N80D
L31Q，N80D，G121S
L31Q，N80D，I86S，W122R
L31Q，N80D，R130Q
L31Q，N80D，I86S，W122H
L31Q，N80D，I86M，W122L
L31Q，N80D，R130N
L31Q，N80D，I86S，W122L
L31Q，N80D，K82N
L31Q，N80D，I86S，W122M
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，K82H
L31Q，N80D，R130H
L31Q，N80D，R130A
L31Q，N80D，G121S
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130D
L31Q，N80D，I86M
L31Q，Y74Y，N80D
L31Q，N80D，R130L
L31Q，N80D，Y83F
L31Q，N80D，K82S
L31Q，I77T，N80D
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130I
L31Q，N80D，I86S，W122L
L31Q，N80D，I86F，W122L
M27N，L31Q，N80D
L31Q，N80D，Y83P
L31Q，N80D，R130K
L31Q，N80D，K82R，I86S，W122L
L31Q，N80D，K82L
L31Q，N80D，I86S，G121G
L31Q，N80D，I86A，R130Q
M27H，L31Q，N80D
L31Q，N80D，W122L，A207E
L31Q，N80D，W122L，R130L
L31Q，N80D，K82E
L31Q，N80D，G121E
L31Q，N80D，W122L，R130R
L31Q，I77M，N80D
L31Q，N80D，K82T
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，W122H
L31Q，N80D，Q167T
L31Q，I77H，N80D
L31Q，N80D，G121K
L31Q，I77Q，N80D
L31Q，N80D，W122L，R130N
L31Q，N80D，W122L
L31Q，N80D，G121D
L31Q，N80D，R130T
L31Q，N80D，R130T
L31Q，N80D，K82M
L31Q，N80D，Q167H
L31Q，N80D，I86T
L31Q，N80D，Q167I
L31Q，N80D，I86C
L31Q，N80D，Q167G
M27L，L31Q，N80D
L31Q，N80D，I86S，G121R
L31Q，I77S，N80D
L31Q，I77C，N80D
L31Q，N80D，G121N
L31Q，I77A，N80D
L31Q，N80D，R130M
L31Q，N80D，W122F
M27G，L31Q，N80D
L31Q，N80D，K82G
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130K
L31Q，N80D，R130A
L31Q，N80D，I86I
L31Q，I77E，N80D
L31Q，N80D，D227L
L31Q，N80D，V85H，N215G
L31Q，N80D，I86A，W122L，R130N
L31Q，I77R，N80D
L31Q，N80D，I86F
L31Q，N80D，I86Y，W122L
M27K，L31Q，N80D
L31Q，N80D，D227C
L31Q，N80D，R130L
L31Q，N80D，I86C，W122L
L31Q，N80D，Q167L
L31Q，N80D，V85H
L31Q，N80D，Q167M
M27D，L31Q，N80D
L31Q，N80D，I86L
L31Q，N80D，Y230A
L31Q，N80D，W122R
L31Q，N80D，Y230G
L31Q，N80D，D227S
L31Q，N80D，W122L，A207E，N289P
L31Q，N80D，W122Y
L31Q，N80D，I86L，W122L
L31Q，N80D，K82R，I86S，G121S，R130Q
L31Q，Y74W，N80D
L31Q，N80D，R130F
L31Q，N80D，G121V
L31Q，N80D，W122L，R130M
L31Q，N80D，R130V
L31Q，N80D，Y230V
L31Q，N80D，N215G
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130N
L31Q，N80D，Y230R
M27E，L31Q，N80D
L31Q，N80D，Y230I
L31Q，N80D，I86S，W122L，R130S
L31Q，N80D，K82R
L31Q，N80D，D227E
L31Q，N80D，K82R，I86A，G121S
L31Q，N80D，R130G
L31Q，I77V，N80D
L31Q，N80D，G121G
L31Q，N80D，Y230T
L31Q，N80D，K82R，I86S，R130N
L31Q，N80D，D227F
L31Q，N80D，I86A，G121R
L31Q，N80D，I86S，R130N
L31Q，N80D，W122C
L31Q，N80D，Y230S
L31Q，N80D，R130Y
L31Q，N80D，R130C
L31Q，I77L，N80D
A119T，N80D
A199A，N80D
G67A，N80D，V85H
其中所述位置为通过将亲本序列与SEQ ID No.68或SEQ ID No.16进行比对而鉴定的。
合适地，变体脂质酰基转移酶可与亲本脂质酰基转移酶相同，例外的是在位置31处有修饰，且任选地在以下氨基酸残基位置之任一者或多者处有一个或多个另外的修饰：27、77、80、82、85、85、86、121、122、 130、167、207、227、230和289，所述位置为通过将亲本序列与SEQ ID No.68或SEQ ID No.16进行比对鉴定的。
合适地，变体脂质酰基转移酶可与亲本脂质酰基转移酶相同，例外的是在位置31处有修饰，且任选地在以下氨基酸残基位置之任一者或多者处有一个或多个另外的修饰：86、122或130，所述位置为通过将亲本序列与 SEQ ID No.68或SEQ ID No.16进行比对鉴定的。
在一个实施例中，在亲本序列为SEQ ID No.16或SEQ ID No.68的情况中或者在亲本序列由SEQ ID No.49或SEQ ID No.120编码的情况中，变体多肽具有以上详示的修饰之任一者，例外的是位置80处的修饰。为此， SEQ ID No.16、SEQ ID No.68或者SEQ ID No.49或SEQ ID No.120所编码的多肽会已经在位置80处具有天冬氨酸，所述位置是通过将亲本序列与 SEQ ID No.16进行比对鉴定的。
合适地，变体脂质酰基转移酶或者通过本发明方法可获得的变体脂质酰基转移酶可与亲本脂质酰基转移酶有至少75％同一性，合适地，变体脂质酰基转移酶可与亲本脂质酰基转移酶有至少75％或至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少98％同一性。
本发明还涉及具有脂质酰基转移酶活性的变体多肽，其中所述变体与亲本脂质酰基转移酶相比在至少位置31处包含修饰，其中位置31是通过与 SEQ ID No.68或SEQ ID No.16的比对而鉴定的。
在一个实施例中，优选地，变体脂质酰基转移酶具有以下修饰和/或以下修饰是按照本发明的方法作出：
·L31Q，N80D，W122L(在主链酶已经在位置80处具有D的情况下，可表示为L31Q，W122L)；
·M27V，L31Q，N80D(在主链酶已经在位置80处具有D的情况下，可表示为N27V，L31Q)；
·L31Q，N80D，K82R，I86A(在主链酶已经在位置80处具有D的情况下，可表示为L31Q，K82R，I86A)；和/或
·L31Q，N80D，I86S，W122F(在主链酶已经在位置80处具有D的情况下，可表示为L31Q，I86S，W122F)。
改进的性质
供在本发明中使用的变体脂质酰基转移酶与亲本(即主链)脂质酰基转移酶或未经修饰的脂质酰基转移酶相比具有至少一种改进了的性质。
本文所用的术语“改进了的性质”可包括：a)脂质酰基转移酶对底物的特异性改变，例如且仅举例说，i)酶使用某些化合物作为受体的能力改变，例如利用碳水化合物作为受体分子的能力改进，从而改进酶产生碳水化合物酯的能力，或者ii)使用饱和或不饱和脂肪酸作为底物的能力改变，或者iii) 特异性改变，使得变体脂质酰基转移酶优先从脂质底物的Sn1或Sn2位置利用脂肪酸，或者iv)变体酶的底物链长度特异性改变；b)酶的动力学改变；和/或c)变体脂质酰基转移酶进行水解反应的能力降低，同时保持或增强酶进行酰基转移酶反应的能力。
其他的改进的性质可例如涉及pH和/或温度稳定性和/或去污剂稳定性和/或氧化稳定性的改进和/或变化。的确，设想到，可按照本发明制备出在这些特性之一者或多者(pH、温度、蛋白水解稳定性、去污剂稳定性和/或氧化稳定性)中具有不同稳定性程度的酶。
野生型蛋白(例如亲本脂质酰基转移酶)和突变蛋白(例如变体脂质酰基转移酶)的表征通过任何合适的方法完成，并优选基于对所关注的性质的评估。
在一些实施例中，本发明的变体酶当与亲本酶比较时，可具有提高的转移酶活性和相同或较小的水解活性。换句话说，合适地，变体酶与亲本酶相比可具有较高的转移酶活性-水解活性比(例如转移酶：水解活性)。合适地，变体酶可优先将酰基基团从脂质(包括磷脂、半乳糖脂或三酰基甘油)转移到酰基受体，而不是仅仅水解脂质。
合适地，供在本发明中使用的脂质酰基转移酶可以是与亲本酶相比对极性脂质(优选磷脂和/或糖脂)的酶活性增高的变体。优选地，这种变体还对溶血极性脂质具有低活性或不具有活性。对极性脂质(优选磷脂和/或糖脂)的活性增高可以是水解和/或转移酶活性或两者之组合的结果。优选地，对极性脂质的活性增高是转移酶活性的结果。
供在本发明中使用的变体脂质酰基转移酶与亲本酶相比，可对三甘油酯和/或单甘油酯和/或二甘油酯具有降低的活性。
合适地，变体酶可不具有对三甘油酯和/或单甘油酯和/或二甘油酯的活性。
组的定义
氨基酸组1：
氨基酸组1(注意这些是1IVN中的氨基酸-图53和图54)
Gly8，Asp9，Ser10，Leu11，Ser12，Tyr15，Gly44，Asp45，Thr46，Glu69， Leu70，Gly71，Gly72，Asn73，Asp74，Gly75，Leu76，Gln106，Ile107，Arg108， Leu109，Pro110，Tyr113，Phe121，Phe139，Phe140，Met141，Tyr145，Met151，Asp154，His157，Gly155，I1e156，Pro158
将高度保守的基序如GDSx和催化性残基从组1中取消选定(下划线的残基)。为避免疑问，组1定义的是偏离1IVN模型的活性位点中的甘油的中心碳原子在以内的氨基酸残基。
氨基酸组2：
氨基酸组2(注意氨基酸的编号指P10480成熟序列中的氨基酸)
Leu17，Lys22，Met23，Gly40，Asn80，Pro81，Lys82，Asn87，Asn88，Trp111， Val112，Ala114，Tyr117，Leu118，Pro156，Gly159，Gln160，Asn161，Pro162， Ser163，Ala164，Arg165，Ser166，Gln167，Lys168，Val169，Val170，Glu171， Ala172，Tyr179，His180，Asn181，Met209，Leu210，Arg211，Asn215，Lys284， Met285，Gln289和Val290。
组1中的选定残基与组2的比较在表1中示出。
表1
氨基酸组3：
氨基酸组3与组2相同，但指的是杀鲑气单胞菌(SEQ ID No.35)编码序列，即在组3中氨基酸残基编号要高出18，因为这反映了成熟蛋白(SEQ ID No.35)与包含信号序列的蛋白(SEQ ID No.4)相比在氨基酸编号上的差异。
杀鲑气单胞菌GDSX(SEQ ID No.35)和嗜水气单胞菌GDSX(SEQ ID No.34)的成熟蛋白质相差在五个氨基酸。它们是Thr3Ser、LYS182Gln、 Glu309Ala、Thr310Asn和Gly318-，其中首先列出杀鲑气单胞菌残基，最后列出嗜水气单胞菌残基。嗜水气单胞菌蛋白长度仅为317个氨基酸，在位置 318处缺乏残基。杀鲑气单胞菌GDSX与嗜水气单胞菌蛋白相比，对极性脂质(如半乳糖脂底物)的活性相当高。对所有五个氨基酸位置进行了位点扫描。
氨基酸组4：
氨基酸组4是S3，Q182，E309，S310和-318。
氨基酸组5：
F13S，D15N，S18G，S18V，Y30F，D116N，D116E，D157N，Y226F，D228N Y230F。
氨基酸组6：
氨基酸组6是Ser3，Leu17，Lys22，Met23，Gly40，Asn80，Pro81，Lys82， Asn 87，Asn88，Trp111，Val112，Ala114，Tyr117，Leu118，Pro156，Gly159， Gln160，Asn161，Pro162，Ser163，Ala164，Arg165，Ser166，Gln167，Lys168， Val169，Val170，Glu171，Ala172，Tyr179，His180，Asn181，Gln182，Met209， Leu210，Arg211，Asn215，Lys284，Met285，Gln289，Val290，Glu309，Ser310，- 318。
组6中的氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.3)中的氨基酸残基-其他序列主链中的相应氨基酸可通过与P10480和/或1IVN的同源性比对和/或结构比对来确定。
氨基酸组7：
氨基酸组7是Ser3，Leu17，Lys22，Met23，Gly40，Asn80，Pro81，Lys82， Asn 87，Asn88，Trp111，Val112，Ala114，Tyr117，Leu118，Pro156，Gly159， Gln160，Asn161，Pro162，Ser163，Ala164，Arg165，Ser166，Gln167，Lys168， Val169，Val170，Glu171，Ala172，Tyr179，His180，Asn181，Gln182，Met209， Leu210，Arg211，Asn215，Lys284，Met285，Gln289，Val290，Glu309，Ser310，- 318，Y30X(其中X选自A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W)， Y226X(其中X选自A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W)， Y230X(其中X选自A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W)， S18X(其中X选自A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W或Y)，D157X (其中X选自A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y)。
组7中的氨基酸的编号是指P10480(SEQ ID No.3)中的氨基酸残基-其他序列主链中的相应氨基酸可通过与P10480和/或1IVN的同源性比对和/或结构比对来确定。
合适地，变体酶与亲本酶相比包含以下氨基酸修饰之一者或多者：
S3E，A，G，K，M，Y，R，P，N，T或G
E309Q，R或A，优选Q或R
-318Y，H，S或Y，优选Y。
优选地，GDSX基序的X为L。因此，优选地，亲本酶包含氨基酸基序GDSL。
合适地，所述第一亲本脂质酰基转移酶可包含以下氨基酸序列之任一者：SEQ ID No.34、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.1l、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No. 1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33 或SEQ ID No.35。
合适地，所述第二相关脂质酰基转移酶可包含以下氨基酸序列之任一者：SEQ ID No.3、SEQ ID No.34、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No. 1、SEQ ID No.15、SEQ ID No.25、SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33 或SEQ ID No.35。
变体酶与亲本酶相比必须包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施例中，变体酶与亲本酶相比可包含至少2个、优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、优选至少9 个、优选至少10个氨基酸修饰。
本文中当指涉特定氨基酸残基时，编号是通过将变体序列与SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的参考序列进行比对得到的编号。
在一个方面，优选地，变体酶包含以下氨基酸置换中的一者或多者：
S3A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；和/或
L17A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
S18A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，W或Y；和/或
K22A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
M23A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
Y30A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；和/或
G40A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
N80A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
P81A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
K82A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
N87A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
N88A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
W111A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
V112A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；和/或
A114C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
Y117A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；和/或
L118A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
P156A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
D157A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
G159A，C，D，E，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
Q160A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；和/或
N161A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
P162A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
S163A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；和/或
A164C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
R165A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；和/或
S166A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；和/或
Q167A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；和/或
K168A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
V169A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；和/或
V170A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；和/或
E171A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
A172C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
Y179A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；和/或
H180A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
N181A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
Q182A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y、优选K；和/或
M209A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
L210A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
R211A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
N215A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
Y226A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；和/或
Y230A，C，D，E，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；和/或
K284A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
M285A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
Q289A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；和/或
V290A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；和/或
E309A，C，D，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；和/或
S310A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y。
除此之外或者作为另外一种选择，可能有一个或多个C末端突出端。优选地，该另外的C末端突出端由一个或多个脂族氨基酸、优选非极性氨基酸、更优选I、L、V或G所组成。因此，本发明还提供包含以下C末端突出端之一者或多者的变体酶：318I、318L、318V、318G。
优选的变体酶对磷脂(如磷脂酰胆碱(PC))可具有减低的水解活性，还可对磷脂具有提高的转移酶活性。
优选的变体酶对磷脂(如磷脂酰胆碱(PC))可具有提高的转移酶活性，它们还可对磷脂具有提高的水解活性。
对以下残基之一者或多者的修饰可产生出对磷脂具有提高的绝对转移酶活性的变体酶：
S3，D157，S310，E309，Y179，N215，K22，Q289，M23，H180，M209，L210，R211， P81，V112，N80，L82，N88；N87
可提供对磷脂具有改进的转移酶活性的变体酶的特定优选修饰可选自以下之一者或多者：
S3A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；优选N，E，K，R，A， P或M，最优选S3A
D157A，C，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选D157S，R， E，N，G，T，V，Q，K或C
S310A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；优选S310T -318E
E309A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T，V，W或Y；优选E309R，E， L，R或A
Y179A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V或W；优选Y179D，T， E，R，N，V，K，Q或S，更优选E，R，N，V，K或Q
N215A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N215S，L， R或Y
K22A，C，D，E，F，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选K22E，R，C 或A
Q289A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，R，S，T，V，W或Y；优选Q289R，E， G，P或N
M23A，C，D，E，F，G，H，I，K，L N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选M23K，Q，L， G，T或S
H180A，C，D，E，F，G，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选H180Q，R或 K
M209A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选M209Q， S，R，A，N，Y，E，V或L
L210A，C，D，E，F，G，H，I，K，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选L210R，A， V，S，T，I，W或M
R211A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，S，T，V，W或Y；优选R211T
P81A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，Q，R，S，T，V，W或Y；优选P81G
V112A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，W或Y；优选V112C
N80A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N80R，G， N，D，P，T，E，V，A或G
L82A，C，D，E，F，G，H，I，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选L82N，S或E
N88A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N88C
N87A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，M，P，Q，R，S，T，V，W或Y；优选N87M或G
对以下残基之一者或多者的优选修饰可产生出对磷脂具有提高的绝对转移酶活性的变体酶：
S3N，R，A，G
M23K，Q，L，G，T，S
H180R
L82G
Y179E，R，N，V，K或Q
E309R，S，L或A
一个优选的修饰是N80D。当使用参考序列SEQ ID No.35作为主链时尤为如此。因此，参考序列可以是SEQ ID No.16。这个修饰可以与一个或多个另外的修饰相组合。因此，在本发明的一个优选实施例中，编码供在本发明方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可编码这样的脂质酰基转移酶，其包含SEQ ID No.35或者与SEQ ID No.35有75％或更高、优选85％或更高、更优选90％或更高、甚至更优选95％或更高、甚至更优选98％或更高、或者甚至更优选99％或更高的同一性的氨基酸序列。
如上提到，本文中当指涉特定氨基酸残基时，编号是通过将变体序列与SEQ ID No.34或SEQ ID No.35所示的参考序列进行比对得到的编号。
非常优选的是，编码供在本发明的方法和用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可编码这样的脂质，其包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或者SEQ ID No.68所示的氨基酸序列或者与SEQ ID No.16或 SEQ ID No.68有70％或更高、优选75％或更高、优选85％或更高、更优选 90％或更高、甚至更优选95％或更高、甚至更优选98％或更高、或甚至更优选99％或更高的同一性的氨基酸序列。这个酶可认为是变体酶。
在一个优选的实施例中，变体酶包含SEQ ID No.121、SEQ ID No.122 或SEQ ID No.123之一者。
出于本发明的目的，同一性的程度是基于相同的序列元件的数目。本发明氨基酸序列同一性程度可合适地通过本领域知道的计算机程序如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)进行测定。对于双序列比对，所用的分数优选地为 BLOSUM62，空位开放罚分10.0，空位延伸罚分0.1。
合适地，氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少 50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上测定。
合适地，氨基酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
合适地，编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或者供在本发明中使用的脂质酰基转移酶可以是可获自、优选已获自来源于以下科属之一者或多者的生物：气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属 (Saccharomyces)、乳酸球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属 (Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌科(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属 (Aspergillus)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟菌属(Neisseria)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、罗尔斯顿菌属 (Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、假丝酵母属(Candida)、喜热裂孢菌属(Thermobifida)和棒状杆菌属(Corynebacterium)。
合适地，供在本发明中使用的编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列或者脂质酰基转移酶可以是可获自、优选已获自以下生物之一者或多者：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、热糖链球菌(Streptomyces thermosacchari)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium dehalogenans)、芽孢杆菌属(Bacillus sp)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、弧菌科(Vibrionaceae)、苛养木杆菌 (Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毯草黄单胞菌 (Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)和有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)。
在一个方面，优选地，编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列编码这样的本发明脂质酰基转移酶，其可获自、优选已获自或衍生自气单胞菌属(Aeromonas spp.)、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌之一者或多者。
在一个方面，优选地，供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶是这样的脂质酰基转移酶，其可获自、优选已获自或衍自气单胞菌属(Aeromonas spp.)、嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌之一者或多者。
起到本发明的脂质酰基转移酶的作用的酶，可用下文教导的测定法进行常规鉴定。
转移酶活性测定法
优选地，通过乳中的磷脂和/或脂质发生酰基转移而形成的胆固醇酯的摩尔量与原有的胆固醇的量相比，来测量转移酶活性。
将乳与酶或水(作为对照)在40℃下温育30分钟。通过溶剂萃取分离乳脂质，并通过GLC分析分离的脂质。
基于GLC分析，如下计算胆固醇(CHL)、胆固醇酯(CHLE)和游离脂肪酸(FFA)的量：
式中
CHLE(0)＝mol/l胆固醇酯(对照)
CHLE(t)＝mol/l胆固醇酯(酶处理)
FFA(0)＝mol/l游离脂肪酸(c对照)
FFA(t)＝mol/l游离脂肪酸(e酶处理)
GLC分析可按照以下实例5进行。使用这个测定法，本发明的脂质酰基转移酶是那些具有至少5％转移酶活性、优选至少10％转移酶活性、优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或70％转移酶活性的脂质酰基转移酶。
本文所用的术语“转移酶”可与术语“脂质酰基转移酶”互换使用。
合适地，本文所定义的脂质酰基转移酶催化以下反应中的一者或多者：相互酯化、酯交换、醇解、水解。
术语“相互酯化”是指脂质供体和脂质受体之间的酶催化酰基基团转移，其中脂质供体不是游离酰基基团。
本文所用的术语“酯交换”意指酰基基团从脂质供体(非游离脂肪酸)向酰基受体(非水)的酶催化转移。
本文所用的术语“醇解”指通过使酸衍生物与醇ROH反应，使得一个产物与醇的H结合，另一个产物与醇的OR基团结合，从而对酸衍生物的共价键进行酶促切割。
本文所用的术语“醇”指含有羟基基团的烷基化合物。
本文所用的术语“水解”指酰基基团从脂质向水分子的OH基团的酶催化转移。
本文所用的术语“不增加或不大量增加游离脂肪酸”意指优选地，本发明的脂质酰基转移酶具有100％转移酶活性(也即将100％的酰基基团从酰基供体转移到酰基受体上，无水解活性)；但是，该酶可将脂质酰基供体中存在的酰基基团的不到100％转移到酰基受体。在这个情况中，优选地，酰基转移酶活性占总酶活性的至少5％、更优选至少10％、更优选至少 20％、更优选至少30％、更优选至少40％、更优选50％、更优选至少 60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％且更优选至少 98％。％转移酶活性(即转移酶活性占总酶活性的百分比)可按以上给出的“转移酶活性测定法”进行测定。
在本发明的一些方面，本文所用的术语“不大量增加游离脂肪酸”意指用本发明脂质酰基转移酶处理过的食用油中的游离脂肪酸的量小于当使用本发明脂质酰基转移酶以外的酶时食用油中所产生的游离脂肪酸的量，例如与当使用常规的磷脂酶(例如Lecitase UltraTM(Novozymes A/S，丹麦)时所产生的游离脂肪酸的量相比。
本发明的酶可与一种或多种其他合适的食品级酶一起使用。因此，除了本发明的酶之外，还将至少一种另外的酶添加到食品，这也在本发明的范围之内。这种另外的酶包括淀粉降解酶，如内切或外切淀粉酶、普鲁兰酶、脱支酶、半纤维素酶(包括木聚糖酶)、纤维素酶、氧化还原酶(例如过氧化物酶)、酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巯基氧化酶或碳水化合物氧化酶(如氧化麦芽糖的酶，例如己糖氧化酶(HOX)、脂肪酶、磷脂酶、糖脂肪酶、半乳糖脂肪酶和蛋白酶。
在一个实施例中，该酶可以是Dairy HOXTM，其起到氧清除剂的作用以延长干酪的货架期，同时在比萨饼炉中提供棕色对照。因此，在一个方面，本发明涉及能够降低食品(如乳制品，例如干酪)中的美拉德反应的酶的用途(参见WO 02/39828，以引用方式并入本文)，其中该酶优选是在制备本发明食品材料和/或食品的方法中的麦芽糖氧化酶，如碳水化合物氧化酶、葡糖氧化酶和/或氧化酶。
在一个优选的实施例中，将脂质酰基转移酶与具有以下脂肪酶活性之一者或多者的脂肪酶组合使用：糖脂肪酶活性(E.C.3.1.1.26)、三酰基甘油脂肪酶活性(E.C.3.1.1.3)、磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)或磷脂酶A1活性(E.C. 3.1.1.32)。合适的脂肪分解酶是本领域公知的，举例说包括以下脂肪分解酶：F、XTRA和/或ULTRA (Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2(例如来自Biocatalysts的 LIPOMODTM 22L磷脂酶A2、来自Genencor的LIPOMAXTM)、 (Novozymes A/S，丹麦)、YIELDMAXTM(Chr.Hansen，丹麦)、 PANAMORETM(DSM)、WO 03/97835、EP 0 977 869或EP 1 193 314中教导的脂肪酶。本文所定义的脂质酰基转移酶与脂肪酶的这一组合，可在面团或培烤制品或者在精细制品(如蛋糕和糖果)中特别优选。
在一些实施例中，将脂质酰基转移酶与脂肪分解酶组合使用也可以是有利的，所述脂肪分解酶如从小牛、羔羊、小孩的胃制备的凝乳酶液(rennet paste)，或者Palatase A750L(Novo)、Palatase M200L(Novo)、Palatase M1000(Novo)或Piccantase A(DSM)，还有来自DSM(K，KL，L&C)的动物来源的Piccantase，或者Lipomod 187、Lipomod 338(Biocatalysts)。这些脂肪酶常规用于干酪的生产以产生干酪风味。这些脂肪酶还可用于生产酶修饰的食品，例如乳制品(例如干酪)，特别是在所述乳制品由乳脂(butterfat)组成、从乳脂生产或包含乳脂的情况中。脂质酰基转移酶与这些脂肪酶之一者或多者的组合可对乳制品(例如干酪)中的风味具有有利作用。
将脂肪酶与本发明的酶组合使用，在可能需要游离脂肪酸的少许积累的情况中可能特别有利，例如在游离脂肪酸可能影响所需的风味的情况中，或者在制备精细食品时。本领域技术人员会能够将各份脂肪分解酶与本发明的脂质酰基转移酶进行组合以提供所需的水解活性-转移酶活性比，这在食品中会产生优选的技术效果或技术效果组合(如本文“技术效果”一节中所列的那些技术效果)，所述脂肪分解酶例如F、XTRA和/或ULTRA(Novozymes A/S，丹麦)、磷脂酶A2 (例如来自Biocatalysts的LIPOMODTM 22L磷脂酶A2、来自Genencor的 LIPOMAXTM)、(Novozymes A/S，丹麦)、YIELDMAXTM (Chr.Hansen，丹麦)、PANAMORETM(DSM)、WO 03/97835、EP 0 977 869或EP 1 193 314中教导的脂肪酶。
还可有利的是将脂质酰基转移酶与磷脂酶(如磷脂酶A1、磷脂酶 A2、磷脂酶B、磷脂酶C和/或磷脂酶D)组合使用。
该组合使用可以依序进行或同时进行，例如脂质酰基转移酶处理可在另外的酶处理之前进行或者在另外的酶处理过程中进行。或者，另外的酶处理可在脂质酰基转移酶处理之前进行，或者在脂质酰基转移酶处理过程中进行。
在依序酶处理的情况中，在一些实施例中，可能有利的是例如通过热灭活或者通过使用固定化酶来移除所用过了的第一种酶，然后再用第二种酶 (和/或第三种酶等)进行处理。
转录后和翻译后修饰
合适地，本发明的脂质酰基转移酶可由本文教导的核苷酸序列之任一者编码。
取决于所用的宿主细胞，可作出转录后和/或翻译后修饰。设想到，供在本发明方法和/或用途中使用的脂质酰基转移酶涵盖已发生了转录后和/或翻译后修饰的脂质酰基转移酶。
仅以举例方式来说，本文以SEQ ID No.49所示的核苷酸序列(参见图 57)在宿主细胞(例如地衣芽孢杆菌)中的表达会导致转录后和/或翻译后修饰，从而产生本文以SEQ ID No.68所示的氨基酸序列(参见图73)。
SEQ ID No.68与SEQ ID No.16相同(本文中在图1中显示)，例外的是SEQ ID No.68已发生翻译后和/或转录后修饰以去除38个氨基酸。
SEQ ID NO.16也可经转录后和/或翻译后修饰而去除39、40或41个氨基，如SEQ ID NO.121、122和123分别所示。
分离的
在一个方面，脂质酰基转移酶是回收的/分离的脂质酰基转移酶。因此，所产生的脂质酰基转移酶可以处于分离形式。
在另一个方面，编码供在本发明中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以处于分离形式。
术语“分离(的)”意指该序列或蛋白质至少实质上脱离了至少一种在自然界中与其天然结合或者在自然界中存在的其他组分。
纯化的
在一个方面，脂质酰基转移酶可处于纯化形式。
在另一个方面，编码供在本发明中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可以处于纯化形式。
术语“纯化的”意指该序列处于相对纯的状态，例如至少约51％纯，或至少约75％，或至少约80％，或至少约90％纯，或至少约95％纯，或至少约98％纯。
对编码本发明多肽的核苷酸序列进行克隆
编码具有本文所定义的特定性质的多肽或者适合进行修饰的多肽的核苷酸序列，可从任何产生所述多肽的细胞或生物分离。各种用于分离核苷酸序列的方法是本领域公知的。
例如，可使用来自产生该多肽的生物的染色体DNA或信使RNA，来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该多肽的氨基酸序列已知，则可合成出经标记的寡核苷酸探针，并用它从由该生物制备的基因组库鉴定编码多肽的克隆(polypeptide-encoding clones)。或者，可使用含有与另一已知的多肽的基因同源的序列的标记寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
或者，可如下鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，用所得的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将经转化的细菌接种到含有被该多肽抑制的酶的琼脂上，从而让表达该多肽的克隆得以鉴定出来。
在又一个另选方案中，编码该多肽的核苷酸序列可藉已确立的标准方法合成法制备，例如Beucage S.L.等人(1981)Tetrahedron Letters 22，第 1859-1869页所描述的亚磷酰胺方法，或者Matthes等人(1984)EMBO J.3，第801-805页所描述的方法。在亚磷酰胺方法中，寡核苷酸例如在自动 DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接并克隆进适当的载体中。
核苷酸序列可以为混合的基因组和合成起源、混合的合成和cDNA起源或混合的基因组和cDNA起源，根据标准技术通过连接合成、基因组或 cDNA起源的片段制备(视情况而定)。每一连接的片段对应整个核苷酸序列的各个部分。也可使用特异性引物通过聚合酶链反应(PCR)来制备DNA 序列，例如在US 4,683,202或在Saiki R K等人(Science(1988)239，第487- 491页中所描述。
核苷酸序列
本发明还涵盖编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。该核苷酸序列可以来自基因组或者来自合成或者来自重组，无论代表正义链还是反义链都可以是双链或单链。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成 DNA和RNA。优选地，它意指该编码序列的DNA、更优选cDNA。
在一个优选的实施例中，编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸本身不涵盖处于它的自然环境中的天然核苷酸序列，当它与它的也处于其自然环境中的天然结合序列连接时。为便于说明，我们应将这个优选的实施例称为“非天然核苷酸序列”。为此，术语“天然核苷酸序列”意指处于它的天然环境中且当与和它天然结合的整个启动子有效连接时的整个核苷酸序列，所述启动子也处于它的天然环境中。因此，本发明的多肽可由核苷酸序列在它的天然生物中表达，但其中该核苷酸序列不在与它在该生物内天然结合的启动子的控制下。
优选地，该多肽不是天然多肽。为此，术语“天然多肽”意指处于它的天然环境中且当它已被它的天然核苷酸序列表达时的整个多肽。
通常，用重组DNA技术来制备编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列(即重组DNA)。但是，在本发明的一个另选实施例中，可以使用本领域公知的化学方法来合成该核苷酸序列的全部或部分(参见 Caruthers MH等人(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
分子进化
一旦分离了酶编码核苷酸序列，或者鉴定了推定的酶编码核苷酸序列，可能需要修饰选定的核苷酸序列，例如可能需要将该序列突变以制备本发明的酶。
可用合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点旁侧的核苷酸序列。
合适的方法在Morinaga等人(Biotechnology(1984)2，第646-649页) 中公开。向酶编码核苷酸序列引入突变的另一种方法在Nelson和Long (Analytical Biochemistry(1989)，180，第147-151页)中有描述。
可以例如使用市售的试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或者来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒，来随机引入突变，而不是如上所述进行定点诱变。EP 0 583 265提到了优化基于PCR的诱变的方法，也可将它们与诱变DNA类似物(mutagenic DNA analogue)(如 EP 0 866 796中描述的那些)组合使用。易错PCR技术适合于生产具有优选的特性的脂质酰基转移酶变体。WO0206457提到了脂肪酶的分子进化。
第三种获得新序列的方法是，用多种限制性内切核酸酶或者诸如Dnase I的酶将不相同的核苷酸序列片段化，然后重新组装出编码功能蛋白的完全核苷酸序列。或者，可以使用一条或多条不相同的核苷酸序列，并在完全核苷酸序列的重新组装过程中引入突变。DNA改组和家族改组技术适合于生产具有优选的特性的脂质酰基转移酶变体。进行“改组”的合适方法可在 EP0 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606中找到。也可将改组与其他形式的 DNA诱变进行组合，如US 6,180,406和WO 01/34835中所描述。
因此，有可能在体内或体外对核苷酸序列作出多个定点突变或随机突变，并随后通过各种方法筛选所编码的多肽的改进的功能性。例如，采用计算机和exo介导的(in silico and exo mediated)重组方法(参见WO 00/58517、 US 6,344,328、US 6,361,974)，可进行分子进化，其中所产生的变体保留很低的与已知酶或蛋白质的同源性。由此获得的这种变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但具有极低的氨基酸序列同源性。
另外，作为一个非限制性实例，可将多核苷酸序列的突变或自然变体与野生型或其他突变或自然变体进行组合，以产生新的变体。也可以针对所编码的多肽的功能性改善对这种新的变体进行筛选。
上述的和类似的分子进化方法的应用，使得可以在事先不知道蛋白质结构或功能的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明酶的变体，并使得可以生产非可预测但有利的突变或变体。本领域中应用分子进化对酶活性进行优化或改变的实例很多，这种实例包括但不限于以下之一者或多者：在宿主细胞中或体外的表达和/或活性优化、酶活性提高、底物和/或产物特异性改变、酶稳定性或结构稳定性提高或降低、在优选的环境条件(例如温度、 pH、底物)下酶活性/特异性改变。
本领域技术人员会明白，使用分子进化工具，可对酶进行改变以改进其功能性。
合适地，编码在本发明中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列可编码变体脂质酰基转移酶，即该脂质酰基转移酶与亲本酶相比可含有至少一个氨基酸置换、缺失或添加。变体酶保留至少1％、2％、3％、5％、10％、 15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％的与亲本酶的同源性。合适的亲本酶可包括任何具有酯酶或脂肪酶活性的酶。优选地，亲本酶能与pfam00657共有序列比对。
在一个优选的实施例中，变体脂质酰基转移酶保留或掺入GDSx块、 GANDY块和HPT块中存在的pfam00657共有序列氨基酸残基中的至少一者或多者。
在含水环境中没有脂质酰基转移酶活性或脂质酰基转移酶活性低的酶 (如脂肪酶)可用分子进化工具进行突变以引入或增强该转移酶活性，从而产生具有适合在本发明的组合物和方法中使用的显著转移酶活性的脂质酰基转移酶。
合适地，编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列，可编码这样的脂质酰基转移酶，其与亲本酶相比可以是对极性脂质(优选磷脂和/或糖脂)的酶活性增强的变体。优选地，这种变体对溶血极性脂质的活性也低或者没有这种活性。对极性脂质、磷脂和/ 或糖脂的活性增强，可以是水解和/或转移酶活性或两者之组合的结果。
变体脂质酰基转移酶与亲本酶相比可对三甘油酯和/或单甘油酯和/或二甘油酯具有降低的活性。
合适地，变体酶可不具有对三甘油酯和/或单甘油酯和/或二甘油酯的活性。
或者，变体酶可对三甘油酯具有提高的活性，和/或也可对以下之一者或多者具有提高的活性：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基单甘油酯、一半乳糖基单甘油酯。
脂质酰基转移酶的变体是已知的，这种变体之一者或多者可适合在本发明的方法和用途中使用和/或在本发明的酶组合物中使用。仅以举例方式来说，以下参考文献中描述的脂质酰基转移酶的变体可按照本发明进行使用：Hilton&Buckley J.Biol.Chem.1991Jan 15：266(2)：997-1000； Robertson等人J.Biol.Chem.1994Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik等人J. Bacteriol.1996Apr；178(7)：2060-4；Peelman等人Protein Sci.1998Mar； 7(3)：587-99。
氨基酸序列
本发明还涵盖能编码供在本发明的方法和/或用途之任一者中使用的脂质酰基转移酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的用途。
本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。
氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
合适地，氨基酸序列可通过标准的技术从本文教导的分离多肽获得。
一种从分离多肽确定氨基酸序列的合适方法如下：
可将纯化了的多肽进行冷冻干燥，并可将100μg的冷冻干燥材料溶于 50μl的8M尿素和0.4M碳酸氢铵(pH 8.4)混合物中。可将溶解的蛋白质变性，并在覆盖氮气和加入5μl的45mM二硫苏糖醇后在50℃下还原15分钟。冷却到室温后，可加入5μl的100mM碘代乙酰胺，以让半胱氨酸残基在氮气下在暗处室温下衍生化15分钟。
可向以上反应混合物加入135μl的水和于5μl水中的5μg内切蛋白酶 Lys-C，然后可在氮气下在37℃下进行消化24小时。
所得的肽可在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group， Califomia，USA)上，用溶剂A：0.1％TFA水溶液和溶剂B：0.1％TFA乙腈溶液进行反相HPLC分离。可将选定的肽在Develosil C18上用相同的溶剂体系再进行色谱分离后，进行N末端测序。可根据厂商说明书(Applied Biosystems，Califomia，USA)使用Applied Biosystems 476A测序仪，采用脉冲液体快速循环进行测序。
序列同一性或序列同源性
在此，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。本文中，术语“同源性”可等同于“同一性”。
该同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应该提供和/或编码保留该酶的功能活性和/或增强该酶的活性的多肽。
在本说明书的语境中，同源序列意指：包括这样的氨基酸序列，其可与主题序列有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等等。尽管同源性也可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本说明书的语境中优选根据序列同一性来表示同源性。
在本说明书的语境中，同源序列意指：包括这样的核苷酸序列，其可与编码本发明多肽的核苷酸序列(主题序列)有至少75、85或90％同一性、优选至少95或98％同一性。通常，同源物将包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。尽管同源性可以根据相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)来考虑，但在本发明的语境中优选按照序列同一性来表示同源性。
同源性比较可通过眼来进行，或更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的同源性百分数(％)。
同源性百分数(％)可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常，这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
尽管这是十分简单和可靠的方法，但其不能考虑，例如，在原本相同的一对序列中，一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致％同源性有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对，该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得对于同样数目的相同氨基酸来说，具有尽可能少空位的序列比对 (反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其对空位的存在征收相对较高的成本，对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位打分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
最大％同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。进行这种比对的合适计算机程序是Vector NTI(Invitrogen Corp.)。其他可进行序列比较的软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel 等人1999Short Protocols in Molecular Biology，第4版第18章)和FASTA (Altschul等人1990J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可供进行离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，第7-58至7-60页)。但是，对于某些应用而言，优选使用Vector NTI程序。一种称为BLAST 2 Sequences的新工具也可供用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999177(1)：187-8 和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终的同源性百分数(％)也可以同一性来度量，但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反，通常使用标度化相似性打分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。 Vector NTI程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话) (对于进一步的细节请参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用 Vector NTI软件包的各默认值。
或者，可基于与CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988)，Gene 73(1)， 237-244)类似的算法，使用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多序列比对特征，来计算同源性百分数。
一旦该软件产生了最佳比对，则有可能计算同源性百分数(％)，优选％序列同一性。该软件通常作出这一点作为序列比较的一部分，并产生数值结果。
当测定序列同一性时应该使用空位罚分(Gap Penalties)，然后优选地将如下参数用于双序列比对：
对于BLAST 空位开放(GAP OPEN) 0 空位延伸(GAP EXTENSION) 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白质 字长(WORD SIZE) 2 1 K triple 空位罚分(GAP PENALTY) 15 10 空位延伸(GAP EXTENSION) 6.66 0.1
在一个实施例中，优选地，使用CLUSTAL以上文所定义的空位罚分和空位延伸组来确定核苷酸序列的序列同一性。
合适地，针对核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在 50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续核苷酸上，优选在至少100个连续核苷酸测定。
合适地，针对核苷酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
在一个实施例中，可合适地通过本领域知道的计算机程序(如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.))来确定根据本发明的氨基酸序列同一性程度。对于双序列比对，所用的矩阵优选为BLOSUM62，空位开放罚分取10.0，空位衍生罚分取0.1。
合适地，氨基酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸上、优选在至少30个连续氨基酸上、优选在至少40个连续氨基酸上、优选在至少 50个连续氨基酸上、优选在至少60个连续氨基酸上测定。
合适地，氨基酸序列的同一性程度可在整个序列上测定。
序列还可具有氨基酸残基的插入或置换，该插入或置换产生了沉默改变和导致功能等价的物质。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性作出有意的氨基酸置换，只要该物质的二级结合活性得以保留。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似疏水性值的有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
保守置换可例如按照下表2作出。第二列同一区组中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可彼此置换：
表2
本发明还涵盖可能出现的同源置换(在本文中，置换和取代都用来指将现有的氨基酸残基用另选的残基进行交换)，即对等置换，如碱性对碱性，酸性对酸性，极性对极性等。非同源置换也可能出现，即从一类残基置换成另一类残基，或者涉及到加入非自然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为 Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为 O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
置换还可通过非天然氨基酸进行。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑问，“类肽”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)13(20)，9367-9371和Horwell DC， Trends Biotechnol.(1995)89(4)，132-134。
供在本发明中使用的核苷酸序列或者编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，可在其中包含合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解本文所描述的核苷酸序列可通过本领域可用的任何方法修饰。可进行这种修饰以提高核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还涵盖与本文所讨论的序列互补的核苷酸序列或其任何衍生物、片段或衍生物的用途。如果序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴别其他生物中的相似编码序列等等。
不与本发明的序列100％同源但处于本发明的范围之内的多核苷酸可以多种方式获得。本文描述的序列的其他变体可例如通过用探针探测(probing) 从一系列个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库来获得。另外，可获得存在于哺乳动物细胞(例如大鼠、小鼠、牛和灵长类动物细胞)的其他病毒/细菌或细胞类似物，特别是细胞同源物，这种同源物及其片段通常将能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。这种序列可通过这样获得：从其他动物物种制备的eDNA文库或基因组DNA文库，在中等至高严格性条件下用包含随附的序列表中的序列中的任一条的全部或部分的探针，探测这些文库。可应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的种同源物和等位基因变体。
变体和株系/物种同源物还可用简并PCR获得，简并PCR将使用这样一种引物，该引物被设计用于靶向变体和同源物内编码本发明序列内的保守氨基酸序列的序列。保守序列可例如通过将来自数种变体/同源物的氨基酸序列进行比对来预测。序列比对可用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
简并PCR中使用的引物将含有一个或多个简并位置并将在比从已知序列用单序列引物克隆序列所用的严格性条件低的严格性条件下使用。
作为另外一种选择，这种多核苷酸可通过对已表征的序列进行定点诱变来获得。在例如需要沉默密码子序列改变来优化多核苷酸序列在其中表达的特定宿主细胞的密码子偏好的情形中这可能是有用的。为了引入限制多肽识别位点，或者为了改变被多核苷酸所编码的多肽的性质或功能，可能需要其他的序列改变。
本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于产生引物(例如PCR引物)、备选的扩增反应的引物、探针(例如用放射性或非放射性标记通过常规手段标记有显示标记的探针)，或者可将该多核苷酸克隆进载体中。这种引物、探针和其他片段将长为至少15个，优选至少20个，例如至少25、 30或40个核苷酸，并且也为本文所用的术语本发明的多核苷酸所涵盖。
根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可重组产生、合成产生或通过本领域技术人员可用的任何手段产生。它们还可以通过标准技术克隆。
通常，引物将通过合成手段产生，涉及所需核酸序列的逐步制备，一次一个核苷酸。利用自动化技术完成该过程的技术是本领域容易获得的。
较长的多核苷酸将通常用重组手段产生，例如用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将涉及到制备与脂质靶标序列的需要进行克隆的区域侧接的一对引物(例如约15至30个核苷酸的引物)，使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起所需要的区域的扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物来分离)和回收扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点使得可将扩增的DNA克隆进合适的克隆载体中。
杂交
本发明还涵盖与本发明序列互补的序列或者能够与本发明序列或其互补序列杂交的序列的用途。
本文所用的术语“杂交”应包括“一条核酸链与互补链通过碱基配对接合的过程”以及在聚合酶链反应(PCR)技术中所进行的扩增过程。
本发明还涵盖能够与和本文所讨论的主题序列互补的序列或其任何衍生物、片段或衍生物杂交的核苷酸序列的用途。
本发明还涵盖和能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
杂交条件是如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，San Diego CA)中所教导基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，并赋予下文所解释的确定的“严格性”。
最大严格性通常在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)出现；高严格性在比Tm低约5℃至10℃下出现；中等严格性在比Tm低约10℃至20℃下出现；低严格性在比Tm低约20℃至25℃下出现。本领域技术人员会认识到，可使用最大严格性杂交来鉴定或检测相同的核苷酸序列，而可使用中等 (或低)严格性杂交来鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。
优选地，本发明涵盖这样的序列的用途，所述序列和能够在高严格性条件或中等严格性条件下与编码具有本文所定义之特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列互补。
更优选地，本发明涵盖这样的序列的用途，所述序列和能够在高严格性条件(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH 7.0})下与编码具有本文所定义之特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列互补。
本发明还涉及能与本文所讨论的核苷酸序列(包括本文所讨论的那些核苷酸序列的互补序列)杂交的核苷酸序列的用途。
本发明还涉及和能与本文所讨论的核苷酸序列(包括本文所讨论的那些核苷酸序列的互补序列)杂交的序列互补的核苷酸序列的用途。
能够在中等至最大严格性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的用途，也包括在本发明的范围之内。
在一个优选的方面，本发明涵盖能在严格性条件(例如50℃和 0.2xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的用途。
在一个更优选的方面，本发明涵盖能在高严格性条件(例如65℃和 0.1xSSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的用途。
多肽的表达
可将供在本发明中使用的核苷酸序列或者编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列掺入到重组可复制载体中。该载体可用来在和/或从相容的宿主细胞复制该核苷酸序列和以多肽形式表达该核苷酸序列。表达可用控制序列进行控制，控制序列包括启动子/增强子和其他表达调节信号。可使用原核生物启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。也可使用包含来自上述两个或多个不同的启动子的序列元件的嵌合启动子。
取决于所用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列所产生的多肽可被分泌或者可包含在细胞内。编码序列被设计成带有信号序列，信号序列会指导物质编码序列分泌穿过特定的原核或真核细胞膜。
构建体
术语“构建体”-与诸如“缀合物”、“盒(cassette)”和“杂交体”的术语同义-包括与启动子直接或间接连接的、编码供根据本发明使用的具有本文所定义特定性质的多肽的核苷酸序列。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列中间提供合适的间隔基团如内含子序列，例如Shl-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合的”同样如此，其包括直接或间接连接。在一些情况下，该术语不涵盖编码该蛋白质的核苷酸序列与通常结合的野生型基因启动子的天然组合，当它们均处于它们的自然环境中时。
构建体可甚至含有或表达标志物，该标志物便于该遗传构建体的选择。
对于一些应用而言，优选地，构建体包含至少本发明的核苷酸序列或者有效连接到启动子的、编码具有本文所定义特定性质的多肽的核苷酸序列。
生物
与本发明相关的术语“生物”，包括任何可能包含根据本发明的核苷酸序列或者编码具有本文所定义特定性质的多肽和/或从中获得的产物的核苷酸序列的生物。
与本发明相关的术语“转基因生物”包含任何包含编码具有本文所定义特定性质的多肽和/或从中获得的产物的核苷酸序列的生物，和/或其中启动子可使该编码具有本文所定义特定性质的多肽的核苷酸序列在该生物内得以表达。优选地，所述核苷酸序列掺入生物的基因组中。
术语“转基因生物”不涵盖处于它们的天然环境中且当它们处于它们的天然启动子(也处于其天然环境中)的控制之下时的天然核苷酸编码序列。
因此，本发明的转基因生物包括包含以下任一者或它们的组合的生物：编码具有本文所定义特定性质的多肽的核苷酸序列、本文所定义的构建体、本文所定义的载体、本文所定义的质粒、本文所定义的细胞或它们的产物。例如，转基因生物还可包含处于这样的启动子控制下的编码具有本文所定义特定性质的多肽的核苷酸序列，所述启动子在自然界中不与编码脂质酰基转移酶的序列相结合。
宿主细胞/生物的转化
宿主生物可以是原核生物或真核生物。
合适的原核生物宿主的实例包括细菌，如大肠杆菌和地衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌。
有关原核生物宿主的转化的教导在文献中有充分记载，例如参见 Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989， Cold Spring Harbor Laboratory Press)。如果使用原核生物宿主，则该核苷酸序列可能需要适当地进行修饰后再进行转化，例如通过去除内含子来进行修饰。
在另一个实施例中，转基因生物可以是酵母。
可用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如涉及原生质体形成和原生质体转化以及随后的以已知的方式再生细胞壁的方法。使用曲霉属 (Aspergillus)作为宿主微生物在EP 0 238 023中有描述。
另一种宿主生物可以是植物。有关用来转化植物的通用技术的一篇综述，可在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225) 和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中找到。有关植物转化的更多教导可在EP-A-0449375中找到。
有关真菌、酵母和植物的转化的一般教导在以下各节中给出。
转化的真菌
宿主生物可以是真菌，如丝状真菌。合适的这种宿主的实例包括以下各属微生物的任何成员：嗜热真菌属(Thermomyces)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属 (Neurospora)、木霉属(Trichoderma)等。
有关转化丝状真菌的教导在US-A-5741665中综述，其声称用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术是本领域公知的。关于应用于粗糙链孢霉(N. crassa)的技术的详尽综述可见于例如Davis和de Serres，Methoda Enzymol (1971)17A：79-143中。
有关转化丝状真菌的更多教导在US-A-5674707中综述。
在一个方面，宿主生物可以是曲霉属，如黑曲霉(Aspergillus niger)。
根据本发明的转基因曲霉也可例如按照Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.载于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus：50 years on.Progress in industrial microbiology，第29卷，Elsevier Amsterdam 1994.第641-666页)的教导来制备。
Punt等人.(2002)Trends Biotechnol 2002年5月；20(5)：200-6，Archer& Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306综述了在丝状真菌中的基因表达。
转化的酵母
在另一个实施例中，转基因生物可以是酵母。
有关酵母中异源基因表达的原理的综述提供在例如Methods Mol Biol (1995)，49：341-54和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60中。
为此，可使用酵母作为异源基因表达的载体，酵母例如是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisi)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(2000，24(1)：45-66))。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”，Yeasts，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison (编辑)第2版，Academic Press Ltd.)给出了有关酿酒酵母中异源基因表达和基因产物分泌的原理的综述。
为转化酵母，已开发了几种转化方案。例如，可按照Hinnen等人.， (1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)； Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)和Ito，H等人(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教导制备根据本发明的转基因酵母菌。
转化的酵母细胞可用各种选择性标志物-如营养缺陷型标志物、显性抗生素抗性标志物-来进行选择。
可从生物技术上相关的酵母种类中选择合适的酵母宿主生物，所述酵母种类如但不限于选自以下的酵母种类：毕赤酵母属(Pichia spp.)、汉逊酵母属(Hansenula spp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Yarrowinia spp.、酵母属(Saccharomyces spp.)(包括酿酒酵母(S.cerevisiae))或裂殖酵母属 (Schizosaccharomyce spp.)(包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce pombe))。
甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株可用作宿主生物。
在一个实施例中，宿主生物可以是汉逊酵母属(Hansenula)，如多形汉逊酵母(H.polymorpha)(如WO01/39544中描述)。
转化的植物/植物细胞
适合于本发明的宿主生物可以是植物。有关通用技术的综述，可在 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中或者在WO 01/16308中找到。转基因植物可例如产生出提高了的水平的植物甾醇酯和植物甾烷醇酯。
因此，本发明还涉及产生具有提高了的水平的植物甾醇酯和植物甾烷醇酯的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：用本文所定义的脂质酰基转移酶(特别是用包含本文所定义的脂质酰基转移酶的表达载体或构建体)转化植物细胞，并从转化的植物细胞生长出植株。
分泌
通常，总希望多肽从表达宿主分泌到培养基中，从该培养基可更容易地回收该酶。根据本发明，可根据所需的表达宿主选择分泌引导序列。杂交体信号序列也可用于本发明的该方面。
在自然界中不与编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列相关的分泌前导序列的典型实例有那些来源于以下基因的分泌前导序列：真菌淀粉葡糖苷酶 (AG)基因(glaA-有18个氨基酸和24个氨基酸的版本，例如来自曲霉属)、a-因子基因(酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)和汉逊酵母属(Hansenula))或者α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属 (Bacillus))。
检测
多种用于检测和测量氨基酸序列的表达的规程是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选 (FACS)。
很多标签和缀合技术是本领域技术人员已知的并且可用于多种核酸和氨基酸测定法。
多个公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI) 和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供商业试剂盒和用于这些程序的方案。
合适的报告分子或标签包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等等。指导这种标签的使用的专利包括US 3,817,837、US 3,850,752、US 3,939,350；US 3,996,345、 US 4,277,437、US 4,275,149和US 4,366,241。
另外，也可如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。
融合蛋白
供在本发明中使用的脂质酰基转移酶可以例如作为融合蛋白产生，以有助于它的提取和纯化。融合蛋白伴侣的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。还可能便利的是在融合蛋白伴侣和所关注的蛋白质序列之间包括蛋白水解裂解位点，以使得能移除融合蛋白序列。优选地，该融合蛋白将不妨碍该蛋白质序列的活性。
在Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6中综述了大肠杆菌中的基因融合表达系统。
可将具有本文所定义特定性质的多肽的氨基酸序列连接到非天然序列以编码融合蛋白。例如，为筛选肽文库寻找能够影响物质活性的对象 (agent)，可能有用的是编码嵌合物质，该嵌合物质表达能被市售抗体识别的非天然表位。
现在将仅以举例的方式，参照如下附图和实例来描述本发明。
实施例
磷脂酶活性的测定(TIPU-K测定法)：
底物：
将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100 (Sigma X-100)和5mM CaCl2溶于0.05M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES) 缓冲液(pH 7)。
测定程序：
用KoneLab自动分析仪，将34μl底物加到小玻璃管中。在时间T＝0分钟，加入4μl酶溶液。加水而不加酶的空白样也进行分析。将样品混合并在 30℃下温育10分钟。
用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品的游离脂肪酸含量。
酶活性TIPU pH 7以测定条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔数计算。
实例1：在地衣芽孢杆菌中表达KLM3’
将编码脂质酰基转移酶(SEQ.ID No.16，下称KLM3’)的核苷酸序列 (SEQ ID No.49)在地衣芽孢杆菌中表达成融合蛋白，该融合蛋白具有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)的信号肽(参见图53和54)。为在芽孢杆菌中有表达最佳，在Geneart(Geneart AG，德国雷根斯堡)订购了经密码子优化的基因构建体(052907号)。
052907号构建体在LAT-KLM3’前体基因的前面含有不完全LAT启动子(仅-10序列)，在LAT-KLM3’前体基因的下游含有LAT转录(Tlat)(参见图53和55)。为产生含有在5’末端侧接有完全LAT启动子、在3’末端侧接有LAT终止子的LAT-KLM3’前体基因的XhoI片段，用引物 Plat5XhoI_FW和EBS2XhoI_RV并用基因构建体052907作为模板进行PCR (聚合酶链反应)扩增。
Plat5XhoI_FW：
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc
ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV：tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
PCR是用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY，Espoo，芬兰) 在热循环仪上按照厂商说明书(退火温度55℃)进行的。
所得的PCR片段用限制性内切核酸酶XhoI消化，并用T4 DNA连接酶连接到XhoI消化的pICatH中(按照供应商(Invitrogen，Carlsbad，California， USA)的说明书进行)。
如US 2002-0182734(WO 02/14490)中所述，将连接混合物转化到枯草芽孢杆菌菌株SC6.1中。通过DNA测序(BaseClear，荷兰莱顿市)证实含有LAT-KLM3’前体基因的XhoI插入片段的序列，其中一个正确的质粒克隆命名为pICatH-KLM3’(ori1)(图53)。在允许的温度(37℃)下将plCatH- KLM3’(ori1)转化到地衣芽孢杆菌菌株BML780(BRA7和BML612的衍生物，参见WO2005111203)中。
选出一个新霉素抗性(neoR)和氯霉素抗性(CmR)转化子，命名为 BML780(plCatH-KLM3’(ori1))。通过在含有5μg/ml氯霉素的培养基中在非允许温度(50℃)下生长地衣芽孢杆菌菌株，将BML780(plCatH-KLM3’(ori1)) 中的质粒整合到该菌株基因组上的catH区域中。选出一个CmR抗性克隆，命名为BML780-plCatH-KLM3’(ori1)。使BML780-plCatH-KLM3’(ori1)在允许的温度下再生长几代，无抗生素以使载体序列环出(without antibiotics to loop-out vector sequences)，然后选出一个新霉素敏感性(neoS)，CmR克隆。在这个克隆中，染色体上的plCatH的载体序列被切除(包括新霉素抗性基因)，仅留下catH-LATKLM3’盒。接着，通过使该菌株在具有递增浓度的氯霉素的培养基之中/之上生长，将染色体上的catH-LATKLM3’盒扩增。经过多轮扩增之后，选出一个克隆(对50μg/ml氯霉素有抗性)并命名为 BML780-KLM3’CAP50。为验证KLM3’表达，使BML780-KLM3’CAP50和 BML780(空宿主菌株)在含有1％甘油三丁酸酯的Heart Infusion(Bacto)琼脂平板上在37℃下生长48小时。在BML780-KLM3’CAP50的菌落的周围明显可见到指示脂质酰基转移酶活性的透明区，而在宿主菌株BML780周围则没有见到(参见图56)。这个结果表明，在地衣芽孢杆菌菌株 BML780-KLM3’CAP50中有大量的KLM3’表达，且这些KLM3’分子是有功能的。
比较实例1
载体构建体
质粒构建体是pCS32new N80D，其是携带编码成熟形式的天然杀鲑气单胞菌甘油磷脂-胆固醇酰基转移酶的序列的pCCmini衍生物，该序列在位置80(KLM3′)处由Asn置换成Asp，在p32启动子的控制下并具有CGT酶信号序列。
用于表达的宿主菌株是在枯草芽孢杆菌OS21ΔAprE菌株中。
表达水平按转移酶活性进行测量，以％酯化了的胆固醇表示，从以PC (TPc)为供体分子和以胆固醇为受体分子的反应中参考样品中游离胆固醇与酶样品中游离胆固醇之差计算。
培养条件
向5ml补加有50mg/l卡那霉素的LB肉汤(酪蛋白酶消化液，10g/l；低钠酵母膏，5g/l；氯化钠，5g/l；惰性压片助剂，2g/l)接种单菌落，并在 30℃下在205rpm下温育6小时。用0.7ml的此培养物接种50ml的SAS培养基(K2HPO4，10g/l；MOPS(3-吗啉丙磺酸)，40g/l；氯化钠，5g/l；消泡剂 (Sin 260)，5滴/1；脱脂大豆粉，20g/l；Biospringer 106(100％dw YE)， 20g/l)，该培养基补加有50mg/l卡那霉素和补加有高麦芽糖淀粉水解物溶液(60g/l)。在30℃和180rpm下继续温育40小时，然后在19000rpm下离心分离培养物上清液30分钟。将上清液转移到清洁的管子中并直接用于转移酶活性测量。
底物的制备和酶反应
按9∶1比例称量PC(Avanti Polar Lipids#441601)和胆固醇(Sigrma C8503)，溶于氯仿中，蒸发至干。
通过将3％PC：胆固醇9∶1分散于50mM HEPES缓冲液(pH 7)中制备底物。
将0.250ml底物溶液转移到带螺旋盖的3ml玻璃管中。加入0.025ml培养物上清液，将混合物在40℃下温育2小时。还制备了含水而不含酶的参考样品。将反应混合物在沸水浴中加热10分钟停止酶反应。向反应混合物加入2ml的99％乙醇，然后进行胆固醇测定分析。
胆固醇测定
将100μl含有1.4U/ml胆固醇氧化酶(SERVA Electrophoresis GmbH cat. No 17109)、0.4mg/ml ABTS(Sigma A-1888)、6U/ml过氧化物酶(Sigma 6782) (于0.1M Tris-HCl，pH 6.6中)和0.5％Triton X-100(Sigma X-100)的底物在 37℃下温育5分钟，然后加入5μl酶反应样品并混合。将反应混合物再温育 5分钟，然后测量OD405。从在99％乙醇中含有0.4mg/ml、0.3mg/ml、 0.20mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml和0mg/ml胆固醇的胆固醇标准溶液的分析结果计算胆固醇的含量。
结果
下表3显示8个分别的表达培养物的平均值：
表3
实例2：酶试验
在以下描述的试验中，将通过喷雾干燥已用酶处理30分钟和4小时 (如下所述)的25升标准全脂乳所形成的乳粉的水分含量、润湿时间以及胆固醇和胆固醇酯水平，与通过将25升标准全脂乳直接送到喷雾干燥塔所形成的乳粉(下文称为对照样品)进行比较。
来自ARLA的全脂乳的酶处理
将20升全脂乳加热到40℃，加入76μl的SEQ ID No.16酶溶液(下文称KLM3’)(KTP08015，1300TIPU/g乳，对应于12.4mg酶/g乳)。
继续混合38分钟以确保均匀，然后将经处理的乳分成两批次。批次1 直接泵送到喷雾塔；批次2在加入酶4小时后泵送到喷雾塔。
试验过程中用于中试车间喷雾干燥机的操作的参数如下：
对照样品(ARLA全脂乳)
喷雾塔：NIRO DRYER P 6.3型；400m3；空气进口220℃；功率 54kW。
出口温度：105/40.5℃(空气/产物)。
给料温度40℃。Rannie给料泵17rpm。
喷雾嘴压力：18MPa(180巴)(ata)。喷嘴类型KMFP SKYM M76。
酶处理批次1
400m3；空气进口195℃；功率48kW。
出口温度：100-103/43℃(空气/产物)。
给料温度40℃。Rannie给料泵15rpm。
喷雾嘴压力：16MPa(160巴)(ata)。喷嘴类型KMFP SKYM M76。
酶处理批次2
400m3；空气进口195℃；功率48kW。
出口温度：100-103/43℃(空气/产物)。
给料温度42℃。Rannie给料泵16rpm。
喷雾嘴压力：17.5MPa(175巴)(ata)。喷嘴类型KMFP SKYM M76。
实例3；润湿性试验
按照IDF方法87：1979测试实例2所得的乳粉的润湿性，并充分考虑到这样的事实，即该方法预定用于测试速溶化乳粉，而由中试车间干燥机制备的粉末是非速溶和非附聚的粉末。所用的设备在图76中示出。
结果在下表4显示。
粉末特性表明由经酶处理的乳制备的粉末自由流动性更好，结块的倾向稍低。
表4
实例4：储藏后粉末样品中残余水分含量的分析
根据以上实例2制备的样品在5℃下储藏一个星期后，用A&D Company，Limited的水分分析仪ML-50分析粉末样品中的残余水分含量。水分分析是在120℃下干燥至恒重和140℃下干燥至恒重之后进行的。结果在下表5中显示。
样品 干燥温度120℃ 干燥温度140℃ 平均水分％ 对照 2.5 2.6 2.6 酶处理批次1 2.0 2.1 2.1 酶处理批次2 1.7 1.8 1.8
表5
实例5：胆固醇和胆固醇酯水平的测定
通过GLC分析以上实例2制备的乳粉样品的胆固醇和胆固醇酯含量。所用的方法描述如下。
量取100mg乳粉到15ml带盖离心管中。加入5ml的氯仿∶甲醇2∶1，将样品在上40rpm旋转萃取30分钟。将样品离心。将量出的溶剂等分试样转移到10ml Dramglass，在氮气蒸汽下50℃蒸发溶剂。通过GLC 分析分离的样品。
气相色谱：
Perkin Elmer Autosystem 9000毛细管气相色谱仪，装有WCOT熔融石英柱12.5m×0.25mm内径×0.1μ膜厚5％苯基-甲基-硅酮(CP Sil 8CB， Chrompack)。
载气：氦气。
进样器。PSSI冷分流注射进样(起始温度50℃加热至385℃)，体积 1.0μl。
检测器FID：395℃
用于GC分析的乳样品的制备：
将脂质级分再溶于含有十七烷作为内标的庚烷/吡啶(2∶1)中，通过GC 测量胆固醇。
然后将500μl样品溶液转移到钳口瓶，加入100μl MSTFA∶TMCS-99∶1 (N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺)并在60℃下反应20分钟。
计算：以纯的参考材料(称取8-10mg纯材料于12ml吡啶中，含有内标十七烷，0.5mg/ml)测定胆固醇和胆固醇酯的响应因子。
结果在下表6中显示。
样品 胆固醇，％ 胆固醇酯，％ 酯化的胆固醇，％ 对照 0.084 0 0 酶处理批次1 0.021 0.080 69.2 酶处理批次2 0.007 0.094 89.0
表6
结论
用脂质酰基转移酶KLM3对全脂乳进行酶处理，对由该乳生产出的乳粉的润湿性有重大影响。酶处理还对干燥温度有影响，因为已证实经酶处理的样品的水分含量比对照样品低。
与未做酶处理的对照样品相比，从用酰基转移酶处理的乳生产出的乳中的游离胆固醇显著降低。
上面说明书中提及的所有出版物以引用的方式并入本文。对本领域的技术人员将显而易见的是，可在不背离本发明的范围和精神的条件下对所描述的本发明方法和系统作出多种修改和变型。尽管本发明已结合特定的优选实施例进行了说明，但应该理解受权利要求书保护的本发明不应该不当地受限于这些特定的实施例。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的所述模式的多种修改旨在处于如下权利要求书的范围内。
保藏收据
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1 如规则6/4(d)适用，则该日期是获得国际保藏单位的资格的日期。
2 表BP/4(单独一页)
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1指明原始保藏的日期，或者在作出新保藏或转保藏的情况下，指明最近的相关日期 (新保藏或转保藏的日期)。
2在规则10.2(a)(ii)和(iii)中提到的情况下，指最近的存活力试验。
3在适合的框中用“x”号标出。
表BP/9(第一页)
4如果该信息被要求和如果试验结果为阴性，则填写。
表BP/9(第二页即最后一页)
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1如规则6/4(d)适用，则该日期是获得国际保藏单位的资格的日期。
表BP/4(单独一页)
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1指明原始保藏的日期，或者在作出新保藏或转保藏的情况下，指明最近的相关日期 (新保藏或转保藏的日期)。
2在规则10.2(a)(ii)和(iii)中提到的情况下，指最近的存活力试验。
3在适合的框中用“x”号标出。
表BP/9(第一页)
4如果该信息被要求和如果试验结果为阴性，则填写。
表BP/9(第二页即最后一页)
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1如规则6/4(d)适用，则该日期是获得国际保藏单位的资格的日期。
表BP/4(单独一页)
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1指明原始保藏的日期，或者在作出新保藏或转保藏的情况下，指明最近的相关日期 (新保藏或转保藏的日期)。
2在规则10.2(a)(ii)和(iii)中提到的情况下，指最近的存活力试验。
3在适合的框中用“x”号标出。
表BP/9(第一页)
4如果该信息被要求和如果试验结果为阴性，则填写。
表BP/9(第二页即最后一页)
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1如规则6/4(d)适用，则该日期是获得国际保藏单位的资格的日期。
表BP/4(单独一页)
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
1指明原始保藏的日期，或者在作出新保藏或转保藏的情况下，指明最近的相关日期 (新保藏或转保藏的日期)。
2在规则10.2(a)(ii)和(iii)中提到的情况下，指最近的存活力试验。
3在适合的框中用“x”号标出。
表BP/9(第一页)
4如果该信息被要求和如果试验结果为阴性，则填写。