技术领域
本发明涉及一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，属于生物领域。
背景技术
兰科手参属植物为多年生草本植物,全世界共10种,我国有5种,包括西南手参、手参、短距手参、峨眉手参和角距手参。佛手参因具有可观的药用价值而被列入多部藏医药经典。
兰科植物的种子极小(每粒种子长1~2mm,直径0.1~0.2mm),由于其胚发育不完全,缺乏供给营养成分的胚乳,因此在自然条件下需要与生境中的真菌共生才能萌发,自然萌发率极低。兰科植物依其生长的环境可分为气生兰和陆生兰,生长于土壤中的陆生兰为了适应其分布地的生态环境,在长期的进化中发展了种皮厚及含有阻碍萌发的物质等特征,其种子比气生兰种子更难以萌发。兰科手参属植物为陆生兰类,佛手参的无性繁殖是由老手参根部仅增生一个小手参,当小手参长大时,老手参枯死,平均繁殖倍数低于2,而种子的自然萌发率也极低。解决佛手参的种苗规模化繁殖是实现其人工栽培、药用开发及种质资源保护的关键。
佛手参属于陆生兰类,其无性及有性繁殖均较为困难,人为的采挖导致了野生资源日益匮乏,迫切需要像天麻、石斛等药用兰科植物一样进行人工栽培,而种苗的规模化生产是实现人工栽培的关键技术。现有技术有人曾尝试利用佛手参的根、芽体和花梗为外植体进行离体培养研究,设计了大量不同植物生长物质组合的培养基,但接种的150个块根、150个花梗和20余个芽体无一例诱导成功,表明佛手参组织培养难度很大。该研究还首次对佛手参种子进行了非共生萌发研究,种子萌发率可达到20%,这已经是很重大的突破，但是萌发率还是非常低。
本发明旨在提供一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅度提高濒危植物佛手参种子的萌芽率，为后期根状茎、愈伤组织的诱导和增殖打下基础。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明针对背景技术存在的问题，一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅度提高濒危植物佛手参种子萌芽率，为后期根状茎、愈伤组织的诱导和增殖打下基础。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）预处理：
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在25-28℃恒温处理10-15min；
所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；
（2）萌发培养基培养：
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m-2·s-1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；
所述复方中药提取液的制备方法为：
如下所述均为质量份；
取5-6份罗汉果，3-4份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
本发明首次将中草药萃取液用于提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其效果好，成本低。
中草药的配伍既可选择单味药，也可选择多味药组成的复方，但不是一些药物的简单粗制组合，无“法”无“方”无“配伍”，在理论联系实践基础上，考虑到现代药物本身的性能有选择地将药物配伍起来使用，充分发挥药物的整体作用。
本发明在传统中草药理论的基础上，通过大量实验得到一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅度提高濒危植物佛手参种子萌芽率，为后期根状茎、愈伤组织的诱导和增殖打下基础。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅度提高濒危植物佛手参种子萌芽率，为后期根状茎、愈伤组织的诱导和增殖打下基础。
（2）培养30d后，萌动率达到86.7-99.8%，萌发率高达59.8-92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
具体实施方式
实施例1：
一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）预处理：
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在25℃恒温处理3min；
所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；
（2）萌发培养基培养：
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m-2·s-1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；
所述复方中药提取液的制备方法为：
如下所述均为质量份；
取5份罗汉果，4份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
结果：培养30d后，萌动率达到86.7%，萌发率高达77.3%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
实施例2：
一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）预处理：
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在28℃恒温处理3min；
所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；
（2）萌发培养基培养：
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m-2·s-1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；
所述复方中药提取液的制备方法为：
如下所述均为质量份；
取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
结果：培养30d后，萌动率达到99.8%，萌发率高达92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
实施例3：
一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）预处理：
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在26℃恒温处理3min；
所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；
（2）萌发培养基培养：
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m-2·s-1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；
所述复方中药提取液的制备方法为：
如下所述均为质量份；
取5份罗汉果，4份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
结果：培养30d后，萌动率达到90.3%，萌发率高达81.4%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
实施例4：
一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）预处理：
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在27℃恒温处理3min；
所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；
（2）萌发培养基培养：
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m-2·s-1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；
所述复方中药提取液的制备方法为：
如下所述均为质量份；
取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
结果：培养30d后，萌动率达到88.7%，萌发率高达65.7%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
实施例5：
一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）预处理：
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min,然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器（功率：25KHz），在28℃恒温处理3min；
所述预处理液的配方为：苹果酸1g/L,漆酶0.8g/L（酶活为5000u/g）,甘氨酸2g/L，其余为纯净水；
（2）萌发培养基培养：
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍,在无菌条件下将其转至无菌瓶内;用无菌水冲洗3遍后,冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚,挑出种子,散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18℃黑暗条件下培养5d后,升温至25℃黑暗条件下继续培养1d，接着置于光照周期12h·d-1,光照强度3.2μmol·m-2·s-1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为：以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液0.5g/L、椰汁8g/L、6-BA0.1mg/L、pH6.5；
所述复方中药提取液的制备方法为：
如下所述均为质量份；
取5份罗汉果，4份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3℃备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大;萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
结果：培养30d后，萌动率达到95.4%，萌发率高达90.6%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
可见，本发明在传统中草药理论的基础上，通过大量实验得到一种提高濒危植物佛手参种子萌芽率的方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅度提高濒危植物佛手参种子萌芽率，培养30d后，萌动率达到86.7-99.8%，萌发率高达59.8-92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。这为后期根状茎、愈伤组织的诱导和增殖打下基础。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。