技术领域
本发明属于分子育种技术领域，涉及香型抗稻瘟病水稻新品种的选育方法。 法。
背景技术
稻瘟病是全世界范围内影响水稻生产的重要病害之一，全世界已有80多个国家报道此病 害发生，每年造成的粮食损失近1000万吨，我国每年由此造成的稻谷损失也达上亿公斤，培 育和种植抗病品种是防治稻瘟病最有效和最安全的措施。但是，传统的抗病育种需要大量的 田间工作，周期长，同时对育种目标的选择受到很多因素的干扰，而新育成的品种在连续多 代种植之后，品种的抗性因稻瘟病菌的生理小种变异而很快损失，抗稻瘟病能力往往表现衰 退，因而培育具有持久抗性的水稻新品种成为水稻科研的重要课题。
近年来迅速发展起来的分子标记辅助选择技术(MAS)可弥补传统育种选择技术准确率 低的缺点来加快育种进程，同时又选择抗谱较广、具持久抗性的抗病基因作为抗源来培育新 品种，从而延长抗稻瘟病品种的寿命。然而，常规的分子标记检测程序过程复杂、费时费力， 对大的育种群体而言耗时长、成本高，难以大范围、规模化地运用于商业化的育种程序中。 如何简化检测程序、提高效率、降低成本，是企业育种工作者十分关注的问题。
另一方面，水稻花药培养单倍体育种技术可以缩短育种年限，提高特定基因型的选择效 率，固定那些常规育种无法显现的配子重组体，从而得到具有较多双亲优良性状的基因型。 然而，要选择特定的基因型，必须有足够数量的纯合二倍体植株供选择。就目前的单倍体技 术而言，如何简化培养方法、建立花药培养新体系、提供足够的供选择群体，仍是研究的主 要内容。
发明内容
本发明的目的在于通过高通量分子标记辅助选择技术在水稻抗稻瘟病分子标记辅助育种 过程中对抗稻瘟病基因进行准确、稳定、快捷、规模化检测；同时，建立高效、稳定的花药 离体培养技术体系，快速稳定获得具有较多双亲优良性状的理想基因型，进一步提高选择效 率、缩短育种年限；此外，利用广适、优质的香型水稻恢复系材料和广适、优质不育系材料 作为育种亲本，以保证选育出的品种具有应用推广价值；总之，建立现代生物技术与传统育 种技术有效结合的一种“香型抗稻瘟病水稻新品种高效选育方法”，以适应商业化育种要求。
本发明解决技术问题，采用如下技术方案：
本发明香型抗稻瘟病水稻新品种的高效选育方法，其特点在于：以广适、优质的香型水 稻恢复系丰香恢一号为受体亲本，以携带抗稻瘟病基因的抗稻瘟病水稻材料为供体亲本，结 合常规育种技术，综合利用高通量分子标记辅助选择技术、水稻花药离体培养技术、香味人 工鼻子嗅闻和抗性田间鉴定手段，育成香味稳定、稻瘟病抗性好且农艺性状优良的抗性改良 香型水稻丰香恢一号恢复系，再与不育系进行组合测配，高效选育出香型抗稻瘟病水稻新品 种。具体包括以下步骤：
(1)以广适、优质的香型水稻恢复系丰香恢一号为受体亲本，以携带抗稻瘟病基因的抗 稻瘟病水稻材料为供体亲本，杂交获得杂种F1代种子；
(2)种植杂种F1代种子，并将杂种F1代与步骤(1)所述的受体亲本回交，获得BC1F1代种子；
(3)种植BC1F1代种子，并通过高通量分子标记辅助选择技术和香味人工鼻子嗅闻的方 式，选取成功导入有抗稻瘟病基因且具有香味的BC1F1代植株与步骤(1)所述的受体亲本进 行回交，获得BC2F1代种子；
(4)种植BC2F1代种子，并通过高通量分子标记辅助选择技术和香味人工鼻子嗅闻的方 式，选取成功导入有抗稻瘟病基因且具有香味的BC2F1代植株；
(5)在步骤(4)所选取的BC2F1代植株中再次选取田间农艺性状表现优良的植株，取 花药进行离体培养，获得双单倍体D1代花培株系；
(6)检测双单倍体D1代花培株系的抗稻瘟病基因的基因型，选取与供体亲本基因型一 致的植株移入大田，单株收种、种植，获得D2代株系并鉴定稻瘟病抗性，筛选香味稳定、稻 瘟病抗性好且农艺性状优良的D2代株系套袋自交，获得抗性改良香型水稻丰香恢一号恢复 系；
(7)对筛选得到的抗性改良的香型水稻丰香恢一号恢复系与不育系进行组合测配，选育 出优质、广适的香型抗稻瘟病水稻新品种。
上述香型抗稻瘟病水稻新品种的高效选育方法的特点也在于：所述携带抗稻瘟病基因的 抗稻瘟病水稻材料是携带抗稻瘟病双基因Pi1、Pi2的抗稻瘟病水稻材料。
通过高通量分子标记辅助选择技术选取导入有抗稻瘟病基因的目标植株的具体步骤是：
(1)高通量DNA快速提取：
每个单株的叶片取1.0cm×1.0cm左右大小的样品，放入96孔PCR管中，加入0.2MNaOH 溶液40μL，在沸水中煮45s，然后加入0.17M的Tris-HCI溶液60μL，在沸水中煮沸2min 后置冰上冷却，获得DNA提取液4℃下保存待用；
(2)Pi1、Pi2两重快速PCR反应：
在PCR反应管中分别加入1μLDNA提取液、Buffer、dNTP、引物P1(引物P1F： 5′-ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3′；引物P1R：5′-AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-3′)、引 物P2(引物P2F：5′-GTGCATGAGTCCAGCTCAAA-3′；引物P2R： 5′-GTGTACTCCCATGGCTGCTC-3′)、ddH2O和Taq酶；先94℃预变性4′；再94℃变性15″， 55℃退火15″，72℃延伸30″，35个循环；72℃延伸7′；反应完成后，加入6×Loadingbuffer终 止反应，置4℃环境下保存备用；
(3)高效聚丙烯酰胺凝胶电泳：
先将分离胶缓慢注入两玻璃板之间，静置凝固半小时以上；再将玻璃板装上电泳槽，插 100齿梳子、点样，2000V、85W条件下电泳8分钟，断开电源；第二次点样，2000V、85W 条件下电泳25分钟，断开电源；最后下胶，将胶板用清水漂洗15″；放入染色盆中(1g/L的 AgNO32L)染色8′；取出胶板，用清水漂洗25″；放入显影液(20g/L的NaOH2L，加入10ml 甲醛)中显影至DNA带清晰；再水洗1′；待胶板晾干后于读X光片的灯箱下观察记录结果。
步骤(6)鉴定D2代株系稻瘟病抗性是采用人工接种和大田诱导相结合的方法进行。
本发明的有益效果体现在：
本发明在育种亲本材料的选择上，采用广适、优质、香型水稻恢复系丰香恢一号为受体 亲本，以携带抗稻瘟病基因的抗稻瘟病材料为供体亲本，同时采用优质、广亲和的测交不育 系，保证选育出的品种具有应用推广价值；本发明结合常规育种技术，综合利用优化的高通 量分子标记辅助选择技术、稳定的水稻花药离体培养技术、准确快捷的香味人工鼻子嗅闻和 抗性田间鉴定手段，育成一系列香味稳定、稻瘟病抗性好且农艺性状优良的改良香型水稻丰 香恢一号恢复系，再与不育系进行组合测配，高效选育出了香型抗稻瘟病水稻新品种。
本发明的改良香型水稻丰香恢一号恢复系散发特异香味，采用人工鼻子嗅闻的手段即可 准确、快捷筛选具有香味的目标植株，操作简单。
本发明采用稳定的水稻花药离体培养技术快速纯合目标基因型，获得同时携带抗稻瘟病 基因、具有香味、农艺性状优良且遗传稳定的植株
本发明的方法高效、快捷、成本低，同时有效结合了传统育种技术和现代分子生物技术， 选育出的品种推广应用价值高，适用于企业商业化育种需求。
附图说明
图1为本发明香型抗稻瘟病水稻新品种的高效选育方法的技术路线图；
图2为Pi1、Pi2基因型检测图谱。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，本实施例按如下步骤选育香型抗稻瘟病水稻新品种：
(1)以广适、优质的香型水稻恢复系丰香恢一号为受体亲本，以携带抗稻瘟病双基因 Pi1、Pi2(如图2所示)的抗稻瘟病水稻材料编号FLK22为供体亲本，杂交获得杂种F1代种 子23粒；
(2)种植23粒杂种F1代种子，剔除假杂种选中16株，检测其抗稻瘟病基因Pi1、Pi2 的基因型，最终选择5株与步骤(1)中的受体亲本回交，获得BC1F1代种子67粒；
(3)种植67粒BC1F1代种子，并通过高通量分子标记辅助选择技术和香味人工鼻子嗅 闻的方式，选取成功导入有抗稻瘟病基因且具有香味的3株BC1F1代植株与步骤(1)中的受 体亲本进行回交，获得BC2F1代种子41粒；
(4)种植41粒BC2F1代种子，并通过高通量分子标记辅助选择技术和香味人工鼻子嗅 闻的方式，选取成功导入有抗稻瘟病基因且具有香味的28份BC2F1代植株；
(5)在步骤(4)所选取的28份BC2F1代植株中再次选取田间农艺性状表现优良的植株 21株，取花药进行离体培养，获得双单倍体D1代花培株系17苗；
(6)检测双单倍体D1代花培株系的抗稻瘟病基因的基因型，选取与供体亲本基因型一 致的3份植株移入大田，单株收种、种植，获得D2代株系并鉴定稻瘟病抗性，筛选香味稳定、 稻瘟病抗性好且农艺性状优良的D2代株系编号为HK6030套袋自交，获得抗性改良香型水稻 丰香恢一号恢复系，定名为；FLRK305。
(7)对筛选得到的抗性改良香型水稻恢复系FLRK305与丰39S进行组合测配，选育出 优质、广适香型抗稻瘟病新品种丰两优3305，2015年通过广西省的审定。