技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的方法及 应用，还涉及一种油茶抑菌提取物。
背景技术
天然产物原料中的活性成分的提取的研究及应用已有多年的历史，部分产品在工业上也有 大规模的应用。当前科研上对天然产物活性成分的分离还是利用各种不同极性的溶剂，按照“相 似相溶”的原理，针对目标提取物，选用对所需抑菌活性成分溶解度大、对不需要溶出成分溶 解度小的溶剂，将目标组分从原料内溶解出来，然后蒸馏回收萃取溶剂，以完成提取、分离加 工过程。
近几年，对植物抑菌物的提取，国内外也广泛采用微波、超声波辅助提取法和超临界二氧 化碳流体萃取法。超声波提取法，即利用超声波的在一定功率下的“空化”作用，激化提取溶媒 在萃取物中渗透、溶解、扩散以提取目标物的提取工艺。超临界二氧化碳流体萃取法，需控制 二氧化碳处于临界温度和临界压力以上，在临界状态下，二氧化碳处于临界状态并具有液体和 气体的双重特性，以其作为溶剂，通过分子间的相互作用和扩散作用溶解原料的目标成分，形 成超临界二氧化碳负载相，然后升高载气的温充或降低载气的压力，使超临界二氧化碳的溶解 度降低，从而获得目标物质。超临界二氧化碳萃取法具有萃取能力强，提取率高，选择性强， 产品品质好等优势，但是，二氧化碳必须在25MPa以上的超高压状态下才能够进行萃取加工， 极高的压力限制了设备工业化生产，也制约了该技术在天然产物生产中的工业化应用。超声波 提取虽法对传统工艺方法有较大改进，也具有较好的经济性和广泛的适应性，但只是一种辅助 手段，需要与其它萃取技术结合才能发挥作用。
连续相变萃取是以亚临界状态的流体或亚临界流体的混合溶液为溶媒，与溶质在系统内相 继经过浸提、蒸发脱溶、压缩、冷凝回收等过程，从天然产物中提取目标组分的一种新技术。 当萃取剂等以亚临界流体状态存在时，分子的扩散性能增强，传质速度加快，对天然产物中弱 极性以及非极性物质的渗透性和溶解能力显著提高。亚临界环境下萃取，不破坏热敏性成分， 被视为绿色环保、前景广阔的一项变革性技术。
目前还未有采用连续相变萃取方法提取油茶中抑菌物质的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的方法及应 用，还提供了一种油茶抑菌提取物。
第一方面，本发明提供了一种连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的方法，包括如下步骤：
(1)原料处理：将油茶的茶叶或茶梗、根、花、籽粕粉碎得到茶粉原料；
(2)连续相变萃取：将步骤(1)所得茶粉原料装入萃取釜中，在始终低于萃取剂的临界 压力和临界温度的条件下，将萃取剂压缩为液体，在萃取温度50-90℃，萃取压力0.3-0.7MPa 的条件下，流经萃取釜，连续萃取1-5h，所得萃取物流经解析釜，获得油茶中的抑菌物质。
优选地，所述步骤(2)中，将油茶的茶叶或茶梗、根、花、籽粕粉碎至20-80目，得到 所述的茶粉原料。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂包括但不限于乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、苯、 氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷，丙烷、丁烷中的一种或多种。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂的浓度为50-90％。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为70-90％的乙醇水溶液，萃取温度优选为70-90℃， 萃取压力优选为0.4-0.6MPa，连续萃取1-3h。
优选地，所述步骤(2)中，所述流经萃取釜的流速为80-150L/h。
优选地，所述步骤(2)中，所述流经解析釜中解析并收集萃取物的条件为：解析温度为 80-90℃，解析压力为0.05-0.2MPa。
进一步优选地，所述步骤(2)中，解析温度为90℃，解析压力为0.2MPa。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为70％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃， 萃取压力0.4MPa，连续萃取1h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为70％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃， 萃取压力0.5MPa，连续萃取2h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为70％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度90℃， 萃取压力0.6MPa，连续萃取3h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度90℃， 萃取压力0.5MPa，连续萃取1h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃， 萃取压力0.6MPa，连续萃取2h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃， 萃取压力0.4MPa，连续萃取3h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为90％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃， 萃取压力0.6MPa，连续萃取1h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为90％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度90℃， 萃取压力0.4MPa，连续萃取2h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为90％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃， 萃取压力0.5MPa，连续萃取3h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度70℃， 萃取压力0.5MPa，连续萃取1h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃， 萃取压力0.4MPa，连续萃取3h。
优选地，所述步骤(2)中，所述萃取剂为80％的乙醇水溶液，萃取条件为：萃取温度80℃， 萃取压力0.4MPa，连续萃取1h。
可以理解的是，本领域技术人员为了后续纯化，可进一步采用有机溶剂对步骤(2)获得 的油茶中抑菌物质进一步萃取提纯。
所述有机溶剂包括但不限于石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、苯、氯仿、二氯乙烷、丙 烷、丁烷中的一种或多种。
优选地，本发明第一方面提供的方法还包括采用有机溶剂对步骤(2)获得的油茶中抑菌 物质进一步萃取提纯的步骤包括：
将步骤(2)所得抑菌物质加入蒸馏水溶解后，加入石油醚，充分振摇萃取，静置，待溶 液完全分层后，放出上层的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物。
进一步优选地，采用有机溶剂对所得石油醚萃取物进一步萃取提纯的步骤包括：
将所得石油醚萃取物加入蒸馏水溶解后，加入乙酸乙酯，充分振摇萃取，静置，待溶液完 全分层后，放出上层的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物。
更进一步优选地，采用有机溶剂对所得乙酸乙酯萃取物进一步萃取提纯的步骤包括：
将所得乙酸乙酯萃取物加入蒸馏水溶解后，加入正丁醇，充分振摇萃取，静置，待溶液完 全分层后，放出上层的正丁醇萃取液，直至正丁醇层澄清无色。将萃取液合并，减压浓缩得正 丁醇萃取物。
可以理解的是，本领域技术人员可采用本领域常规纯化方法纯化本发明步骤(2)获得的 油茶中抑菌物质或其后续经有机溶剂进一步萃取的萃取物，以获得纯度更高的抑菌物质。包括 但不限于采用高速逆流色谱对萃取物进行分离纯化。
优选地，本发明第一方面提供的方法还包括采用高速逆流色谱对油茶中抑菌物质或其后续 经有机溶剂进一步萃取所得的萃取物进行分离纯化，所述高速逆流色谱(HSCCC)的溶剂系 统为乙酸乙酯-正丁醇-水(含1-10％乙酸，优选含3％乙酸)体系。
进一步优选地，所述乙酸乙酯-正丁醇-水(含1-10％乙酸，优选含3％乙酸)体系中乙酸 乙酯、正丁醇、水的体积比为1：4：4、1：3：4或1：2：4。
可以理解的是，步骤(2)中乙酸乙酯-正丁醇-水(含1-10％乙酸，优选含3％乙酸)溶剂 体系的配制方法为本领域技术人员容易理解的常规技术，包括但不限于如下方法：将乙酸乙酯、 正丁醇、水、乙酸按一定体积比用分液漏斗配制，充分振摇后静置过夜，分离上、下相，两相 分别超声脱气15-30min，即得乙酸乙酯-正丁醇-水(含1-10％乙酸，优选含3％乙酸)溶剂体 系，以上相溶液为高速逆流色谱的固定相，下相溶液为流动相。
进一步优选地，所述高速逆流色谱(HSCCC)的条件为:采用含1-10％乙酸的乙酸乙酯、 正丁醇、水混合液作为两相溶剂体系，流速为1.0-3.0mL/min，主机转速为500-900r/min，进 样量为100mg-600mg，根据峰形分段收集流出液，获得油茶中的抑菌物质；其中，所述含1-10％ 乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水混合液中，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为1:2-4:4。
更进一步优选地，所述高速逆流色谱的条件为:采用含3％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水 混合液作为两相溶剂体系，流速为1.5ml/min，转速为850r/min，进样量为500mg；，根据峰形 分段收集流出液，获得油茶中的抑菌物质；其中，所述含1-10％乙酸的乙酸乙酯、正丁醇、水 混合液中，乙酸乙酯、正丁醇、水的体积比为1:4:4。
第二方面，本发明提供了一种油茶抑菌提取物，所述油茶抑菌提取物为采用如第一方面所 述的连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的方法所提取。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的方法 或如第二方面所述的油茶抑菌提取物在抑菌中的应用。
优选地，所述被抑制的菌类为大肠杆菌、葡萄球菌和/或霉菌。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的方法 或如第二方面所述油茶抑菌提取物在制备抑菌剂中的应用。
优选地，所述被抑制的菌类为大肠杆菌、葡萄球菌和/或霉菌。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用了连续相变萃取技术，不仅工艺流程简单、操作性强，而且能有效地降 低生产成本，缩短提取分离时间，减少工艺过程中的能耗，工艺安全环保、无污染、无有害溶 剂残留的，可实现大规模工业化生产；
(2)本发明提供的连续相变萃取提取的油茶中抑菌物质及其纯化后的抑菌提取物均能有 效地抑制细菌和真菌。
附图说明
图1是本发明实施例提供的正丁醇萃取物分析液相图；
图2是本发明实施例提供的F1组分分析液相图；
图3是本发明实施例提供的F2组分分析液相图；
图4是本发明实施例提供的F3组分分析液相图；
图5是本发明实施例提供的F1的质谱图；
图6是本发明实施例提供的F1的核磁氢谱图；
图7是本发明实施例提供的J2的质谱图；
图8是本发明实施例提供的J2的核磁氢谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
本领域技术人员可以理解的是，连续相变萃取的具体步骤如下：采用连续相变萃取法提取 油茶中抑菌物质，是先将油茶的茶叶或茶梗、根、花、籽粕粉碎后装入连续相变萃取装置的萃 取釜中，在始终低于萃取剂的临界压力和临界温度的条件下，高压泵将萃取剂压缩为液体，以 一定流速流经萃取釜萃取提取物粗品，进入解析釜中，在解析釜中通过加热、减压使萃取剂相 变为气体，再通过即时冷却降温，萃取剂变为液体回到溶剂回收桶中，桶中的液态萃取剂通过 加压泵再次流经萃取釜，对物料再次萃取，如此循环多次。
连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的工艺流程如下：
在以下实施例按照所述的连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的工艺流程实施。
本发明实施例所用仪器设备名称、型号及其厂家如下表所示：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1乙醇浓度对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
(1)原料处理：将油茶的籽粕粉碎至20-80目，得到茶粉原料。
(2)连续相变萃取：将步骤(1)所得茶粉原料1.5kg并装入萃取釜中，在始终低于萃取 剂的临界压力和临界温度的条件下，将浓度为50％、60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂压 缩为液体，在萃取温度80℃、萃取压力0.4MPa的条件下，以100L/h的流速流经萃取釜，连 续萃取2h，萃取油茶中抑菌物质后，在解析温度80℃、解析压力0.2MPa的条件下，流经解 析釜中，分别获得油茶中的抑菌物质287、293、300、310、303g。
(3)细菌抑菌实验
选用大肠杆菌，金黄色葡萄球菌作为供试菌，以上菌种均为华南农业大学食品学院微生物 实验室保藏，均为广东省微生物所提供。。
培养基的配置：LB固体培养基的制法：分别称取胰蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、氯化钠 10.0g、琼脂20g，加热搅拌溶于1000ml的水中，分装，高压湿热灭菌(121℃，20min)，备 用。
菌种的活化：将培养基等放入高温灭菌锅中以121℃灭菌20min，冷却后，用接种环从菌 株平板挑单菌落于3-5mlLB液体培养基中，于37℃、250r/min恒温摇床中培养过夜。
菌悬液的配制：再吸取30μl以上菌悬液转接于3ml新鲜LB液体培养基中再次活化，于 37℃、250r/min恒温摇床中培养3-5h，测OD值，用LB液体培养基稀释为OD600＝0.01-0.1(即 菌液浓度为105-106cfu/ml)。
抑菌圈法测抑菌活性大小的操作方法：吸取40μl大肠杆菌稀释液(或20μl金黄色葡萄球菌) 至直径为9cm的培养皿中，加入10ml经溶解灭菌并冷却至40-50℃的LB固体培养基，迅速 振荡摇匀，致使菌体分散均匀，冷却后用直径2.7mm的打孔器打孔，每孔加入5μl待测液， 所述待测液为步骤(2)所得的抑菌物质，以灭菌发酵培养基为对照，静置片刻，37℃倒置培 养过夜，通过十字交叉法测量抑菌圈直径。
(4)霉菌抑菌实验
选取黑曲霉作为供试菌，以上菌种为华南农业大学食品学院微生物实验室保藏，均为广东 省微生物所提供。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基的配置：将200g马铃薯去皮，切成小块，加水煮软， 用纱布过滤，再加20g蔗糖和15g琼脂，融化后补足水分至1000ml，分装，高压湿热灭菌(121℃， 20min)，备用。
菌种的活化：将洗净烘干的培养皿包扎好，放入高温灭菌锅中以121℃灭菌20min，后取 出培养皿，待其干燥后，倒入统一灭菌的培养基，培养基凝固，用接种环从冻干管中取出该菌 种，在凝固好的培养基划线接种，然后放入恒温培养箱内，28℃培养48h，备用。
孢子的收集：在长满成熟孢子的真菌平板加3-5ml灭菌蒸馏水，用接种环轻轻划平板表面， 然后吸取孢子悬液经4层灭菌纱布过滤至小三角瓶，用5ml的灭菌水将纱布上面的孢子冲下去， 得孢子液稀释至OD600＝0.01-0.1范围(即菌液浓度为105-106cfu/ml)。
抑菌圈法测抑菌活性大小的操作方法：取孢子悬液20μl加至直径为9cm的培养皿中，加 入10ml经溶解并冷却至40-50℃的PDA培养基，迅速震荡摇匀，使孢子分散均匀，冷凝后用 直径2.7mm的打孔器打孔，每孔加入5μl待测液，以灭菌发酵培养基为对照，静置片刻，30℃ 倒置培养过夜，测量抑菌圈直径，具体如表1所示。
实验结果显示：由表1可知，随着乙醇浓度的逐渐升高，连续相变萃取物对大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌的抑菌圈均有增大的趋势，且当乙醇浓度为80％时，所述连续相变萃取物的抑菌 圈最大，说明其抑菌活性最强。
表1不同乙醇浓度对连续相变萃取物抑菌活性大小的影响(X±SD，n＝3)
实施例2萃取压力对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，将实施例1步骤(2)中的50％、 60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂替换成浓度为80％乙醇萃取剂，将实施例1步骤(2)中 的萃取压力0.4MPa替换成0.3MPa、0.4MPa、0.5MPa、0.6MPa、0.7MPa，分别获得油茶中的 抑菌物质291、302、311、301、297g，具体如表2所示。
实验结果显示：由表2可知，随着系统萃取压力的逐渐升高，抑菌圈直径的大小有所变化， 但规律性不明显，当压力在达到0.5MPa后，萃取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉的 抑菌效果在较高的水平上。因此，萃取压力为0.5MPa用于正交实验设计，过低的压力不利于 提取介质的流动，过高的压力不利于抑菌活性物的溶出。
表2不同压力对油茶中抑菌物质的抑菌活性大小的影响(X±SD，n＝3)
实施例3萃取温度对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，将实施例1步骤(2)中的50％、 60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂替换成浓度为80％乙醇萃取剂，将实施例1步骤(2)中 的萃取温度80℃替换成50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，分别获得油茶中的抑菌物质293、 296、302、317、310g，具体如表3所示。
实验结果显示：由表3可知，随着萃取温度的逐渐升高，提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄 球菌及黑曲霉的抑菌圈增大，当温度超过80℃以后，呈现逐步下降的趋势，可能是在一定的 温度范围内，温度的升高有利于物料中抑菌活性物的渗出，但过高的温度会损伤抑菌物的活性， 因此，取温度为80℃为连续相变萃取的提取温度。
表3不同温度对油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响(X±SD，n＝3)
实施例4萃取时间对连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的抑菌活性的影响
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，将实施例1步骤(2)中的50％、 60％、70％、80％、90％的乙醇萃取剂替换成浓度为80％乙醇萃取剂，将实施例1步骤(2)中 的萃取时间2h替换成1h、2h、3h、4h、5h，分别获得油茶中的抑菌物质294、308、312、317、 323g，具体如表4所示。
实验结果显示：由表4可知，随着萃取时间的逐渐加长，提取物对三种菌的抑菌圈变化明 显，在提取2h时达到最大，当萃取时间超过2h以后，抑菌圈的直径没有明显的增大，即提取 时间对抑菌活性的影响不显著，延长提取时间跟提取物的得率关系很大。因此，选取2h时为 正交试验的提取时间。
表4不同时间对油茶中抑菌物质抑菌活性大小的影响(X±SD，n＝3)
实施例5连续相变萃取提取油茶中抑菌物质的正交试验
为进一步说明本发明的有益效果，重复实施例1的步骤，根据实施例1-4所得的最优萃取 条件，以萃取物的抑菌活性为考察指标，以乙醇浓度(A)、萃取时间(B)、萃取压力(C)、萃取温 度(D)为因素，设计L9(34)正交试验(见表5)。研究不同乙醇浓度(A)、萃取时间(B)、萃取 压力(C)、萃取温度(D)因素与萃取物抑菌能力的关系，并根据极差分析、直观分析优化最佳提 取工艺条件。
表5连续相变萃取提取的油茶中抑菌物质的L9(34)正交试验因素水平表
实验结果显示：通过对正交实验数据表6的直观分析，萃取物对大肠杆菌有最强抑菌活性 的提取工艺条件是A2B1C2D1；萃取物对金黄色葡萄球菌有最强抑菌活性的提取工艺条件是 A2B3C1D2；萃取物对黑黄霉有最强抑菌活性的提取工艺条件也是A2B3C1D2。因此，从上面 的三个组合可以看出，因素(A)乙醇的浓度对提取抑菌活性物的影响是比较大，也是比较确 定的，都是80％浓度的醇，其他三个因素的影响，因指标不一而有所变化，且对金黄色葡萄球 菌与黑曲霉的抑制而言，两者的提取因素水平亦是相同。
由表6可知，从整体考虑因素水平对实验指标的影响，A2B1C3D2对大肠杆菌的抑菌活性 影响最大；对金黄色葡萄球菌而言，影响最大的因素水平是A2B3C1D2；对黑曲霉而言，影响 最大因素水平是A2B1C1D2。乙醇浓度及萃取温度对三种菌的抑菌活性影响是一致的，都是 80％的乙醇及80℃，而萃取时间和萃取压力两个因素中，对三种菌而言，同时对两种菌影响比 较大的是B1及C1，即是1h和0.4MPa。相比较之前的直观分析，在萃取时间和萃取压力的选 择上，对两种菌一致的是B3和C1，即3h及0.4MPa，可以确定同时对三种菌比较优势的压力 水平是C1，即0.4MPa。因为对于因素B的水平选择，可以参考实施例1-4，萃取时间对抑菌 物抑菌活性的大小影响不大，可能是由于高温，太长的萃取时间对抑菌活性物有一定的破坏作 用，因此萃取时间选取1h，进行验证。
通过正交实验设计，拟确定的因素最优水平是提取介质是80％乙醇，萃取时间为1h，萃 取压力为0.4MPa，萃取温度为80℃，对此因素水平进行实验验证。重复实施例1的步骤，将 实施例1步骤(2)中的连续相变萃取条件替换成80％乙醇，萃取时间1h，萃取压力0.4MPa， 萃取温度80℃，获得油茶中的抑菌物质303g。
实验结果显示：其萃取物冻干后对大肠杆菌的抑菌圈直径为13.6mm，对金黄色葡萄球菌 的抑菌圈直径为15.1mm，对黒曲霉的抑菌圈直径为13.8mm，达到最好的抑菌效果。
表6连续相变萃取提取油茶籽粕中抑菌物质的正交实验数据表(X±SD，n＝3)
实施例6一种油茶中抑菌物质的纯化方法
(1)原料处理：将油茶的籽粕粉碎至20-80目，得到茶粉原料。
(2)连续相变萃取：将步骤(1)所得茶粉原料1.5kg并装入萃取釜中，在始终低于萃取 剂的临界压力和临界温度的条件下，将浓度为80％的乙醇萃取剂压缩为液体，在萃取温度80℃、 萃取压力0.4MPa的条件下，以100L/h的流速流经萃取釜，连续萃取1h，萃取油茶中抑菌物 质后，在解析温度80℃、解析压力0.2MPa的条件下，流经解析釜中，获得萃取物303g。
(3)将步骤(2)所得的抑菌物质浓缩干燥后，加入蒸馏水溶解，摇匀，转入分液漏斗中， 加入4倍体积的石油醚，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的石油醚萃取液， 减压浓缩得石油醚萃取物(SYM)。
(4)将步骤(3)所得石油醚萃取物(SYM)加入蒸馏水溶解后，加入4倍体积的乙酸 乙酯，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的乙酸乙酯萃取液，减压浓缩得乙 酸乙酯萃取物(YSYZ)。
(5)将步骤(4)所得乙酸乙酯萃取物(YSYZ)加入蒸馏水溶解后，加入4倍体积的正 丁醇，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的正丁醇萃取液，直至正丁醇层澄 清无色，将萃取液合并，减压浓缩得正丁醇萃取物(ZDC)。
(6)将步骤(2)中所得萃取物浓缩干燥后，采用水萃取，减压浓缩获得提取物，标记为 SZF(即为水提取物)。
(7)重复实施例1步骤(3)中的细菌抑菌实验和步骤(4)中的霉菌抑菌实验，将实施 例1步骤(3)和(4)中的待测液替换成所述的萃取物、石油醚萃取物(SYM)、乙酸乙酯萃 取物(YSYZ)、正丁醇萃取物(ZDC)和水提取物(SZF)，实验结果如表7所示。
实验结果显示：由表7可知，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黒曲霉三种菌中，正丁醇提 取物(ZDC)的抑菌圈最大，均大于其余三个提取物及步骤(1)所得萃取物的抑菌圈，因此 推测正丁醇萃取组分中含有最强抑菌活性物质或含有最多的抑菌活性物质。
表7不同极性溶剂提取物的抑菌活性大小(X±SD，n＝3)
实施例7
一种油茶抑菌提取物的纯化方法，包括如下步骤：
(1)重复实施例6中(1)-(5)的步骤，获得正丁醇萃取物。
(2)将步骤(1)中所得正丁醇萃取物浓缩干燥后，采用高速逆流色谱(HSCCC)对所 得正丁醇萃取物进行分离纯化；高速逆流色谱(HSCCC)的条件为乙酸乙酯-正丁醇-水(含3％ 乙酸)(1:4:4，V/V)体系，流速为1.5ml/min，转速为850r/min，进样量为500ml，进样液为3ml。 分别收集三个峰对应的组分，浓缩冻干物，分别命名为F1，F2，F3，其中，F2的重量为50g。
实施例8HPLC验证F1、F2、F3纯度
为了验证F1、F2、F3的纯度，采用HPLC对正丁醇萃取物，F1，F2，F3进行检测HPLC 操作条件为：色谱柱选用C18色谱柱柱，洗脱液为40％的甲醇，进样量20μl，色谱检测波长为 210nm，结果如图1-4所示。
实验结果显示：F1组分中含有的物质极性很强，40％的甲醇溶液不易洗脱，直到用90％的 甲醇浓度都不能很好的分离；F2组分是极性中等的物质，其纯度为98.5％，几乎是很纯的单体 物质；F3组分亦是中等极性物质，纯度为85％。
实施例9分离物抑菌活性的研究
为了继续追踪最强抑菌活性物质，采用刃天青法对F1、F2、F3进行抑菌活性试验，得到 其抑菌活性如表8。
实验结果显示：由表8可知，第一个峰F1的最低抑菌浓度比正丁醇萃取物要高，F2及F3的 最低抑菌浓度均比NL2要低，因此，F2，F3的抑菌活性是比较强的。
表8正丁醇萃取物中分离的不同组分的抑菌活性表(X±SD，n＝3)
注：“－”表示无明显抑菌效果
实施例10HPLC进一步分离F3
为了继续追踪最强抑菌活性物质，将实施例7步骤(2)所得的F3采用高效液相色谱 (HPLC)进一步分离，HPLC操作条件：谱柱选用C18色谱柱，流动相选用30％的甲醇溶液， 检测波长为210nm，流速10mL/min，进样量为50μl，样品浓度15mg/mL；冷冻干燥后得到 J1、J2，其中，J2重量为50g。
采用刃天青法进行抑菌活性进行检测，采用大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、黑曲霉作为供试 菌，最低抑菌浓度如表9所示。
实验结果显示：经HPLC检测所得产品J2的纯度为98.7％；J1的含量不仅极低，且其抑菌 活性不如J2，亦不如F2。
表9组分F3及其分离物的抑菌活性(X±SD，n＝3)
将本发明分离得到的化合物F2进行核磁氢谱、质谱的表征，其质谱图如图5所示，氢谱 图如图6所示。
实验结果显示：由图5和图6可知，F2为山奈酚-3-O-{β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-[α-L-鼠李 糖-(1→6)]-β-D-葡萄糖甙}(kaempferol-3-O-{β-D-glucopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl- (1→6)]-β-D-glucopyranoside})，结构式如式Ⅰ所示：
将本发明分离得到的油茶提取物J2进行核磁氢谱、质谱的表征，其质谱图如图7所示， 氢谱图如图8所示。
实验结果显示：由图7和图8可知，J2为山奈酚-3-O-{β-D-吡喃木糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖 -(1→6)]-β-D-葡萄糖甙}(即kaempferol3-O-{β-D-xylopyranosyl-(1→2)-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside})，化学结构如式Ⅱ所示：
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加 以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。