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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510922552.2 (22)申请日 2015.12.14 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105557515 A (43)申请公布日 2016.05.11 (73)专利权人 海南中科花海云商科技股份有限 公司 地址 570311 海南省海口市海口国家高新 技术产业开发区狮子岭工业园办公楼 237号 (72)发明人 武华周 冷青云 胡悦祥 寸德志 (74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限 公司 44202 代理人 郝传鑫 陈欢 (51)Int.Cl.。
2、 A01H 4/00(2006.01) 审查员 冀敏 (54)发明名称 一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法 (57)摘要 本发明公开了一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁 方法， 包括以下步骤： 愈伤组织诱导： 将外植体材 料清洗后， 在氯化汞溶液中表面灭菌7-10min， 用 水冲洗， 切成块状接种于诱导培养基， 45天后诱 导产生愈伤组织； 增殖培养： 将愈伤组织接种于 增殖培养基进行增殖； 孢子体诱导： 将增殖培养 后的愈伤组织接种于分化培养基， 处理30天后获 得发芽的孢子体； 生根培养： 待孢子体的叶片长 到2-3cm后， 接种于生根培养基培养成苗， 30d后 苗的基部长出棕色的根； 炼苗移栽： 待苗。
3、长有2 3条根， 高度在4cm以上时， 进行炼苗移栽。 通过培 养基配方改进， 愈伤组织诱导率为65.29， 增殖 率为8.71， 分化率为达到88.35， 生根率达到 91.21， 成活率达95.3以上。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105557515 B 2018.01.16 CN 105557515 B 1.一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)愈伤组织诱导： 将外植体材料清洗后， 在氯化汞溶液中表面灭菌7-10min， 用水冲 洗， 切成块状接种于诱导培养基， 45天后诱导产生愈伤组织； 所述外植体材料为未展开的圆 叶鸟巢蕨嫩叶， 所述诱导。
4、培养基成分为1/2MS改良培养基、 1.0-2.0mg/L6-BA和0.5-1.0mg/ LNAA； (2)增殖培养： 将愈伤组织接种于增殖培养基进行增殖， 增殖培养基成分为MS基本培养 基、 0.5-1.0mg/L6-BA和0.1-0.5mg/LNAA； 孢子体诱导： 将增殖培养后的愈伤组织接种于分 化培养基， 处理30d天后获得发芽的孢子体， 分化培养基成分为MS基本培养基、 0.4-0.5mg/ L6-BA和0.1-0.2mg/LNAA； (3)生根培养： 待孢子体的叶片长到2-3cm后， 接种于生根培养基培养成苗， 30d后苗的 基部长出棕色的根， 生根培养基成分为1/2MS改良培养基。
5、、 0.1-0.2mg/L NAA、 10-20g/L蔗糖 和0.5-0.8g/L活性炭； (4)炼苗移栽： 待苗长有23条根， 高度在4cm以上时， 进行炼苗移栽， 置于太阳光下炼 苗5-7d后， 取出瓶苗， 洗净根部附着的生根培养基， 晾干并种植于灭菌后的培养基质中， 培 养基质为椰糠、 泥炭土和火山岩的混合物； 其中， 所述1/2MS改良培养基为825mg/LNH4NO3和950mg/LKNO3。 2.根据权利要求1所述的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法， 其特征在于， 所述氯化汞溶 液浓度为0.1。 3.根据权利要求1所述的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法， 其特征在于， 所述椰糠、 泥 炭土。
6、和火山岩的体积比为1:1:1。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105557515 B 2 一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法 技术领域 0001 本发明涉及农业生物技术领域， 尤其涉及一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法。 背景技术 0002 圆叶鸟巢蕨是一种拉丁名为Neottopteris nidus cv.“Avis“的中型附生蕨， 是南 洋巢蕨(Asplenium australasicum)驯化出的一个圆叶盆栽品种， 株形呈漏斗状或鸟巢状。 根状茎短而直立， 柄粗壮而密生大团海绵状须根， 能吸收大量水分。 叶簇生， 辐射状排列于 根状茎顶部， 中空如巢形结构， 能收集落叶及鸟粪； 革质叶。
7、阔披针形， 两面滑润， 叶脉两面稍 隆起， 孢子囊群长条形。 0003 圆叶鸟巢蕨具有四季常青、 株形丰满、 淡雅秀丽、 叶色葱绿等特点， 主要用作室内 布景盆栽， 其叶片是优良的花材； 卷曲的嫩叶可以煮食、 也可做泡菜； 鸟巢蕨的性味微苦， 清 热解毒， 可用于药材。 0004 鸟巢蕨类植物传统的繁殖方法为营养繁殖、 孢子繁殖和组织培养， 营养繁殖通常 需要切割母株， 繁殖率低且易伤害母株， 不适用于批量植苗。 孢子繁殖对培育环境要求条件 高且培育周期长， 不适用商业化植苗。 相对来说， 组织培养生产成本低， 条件可控， 周期短， 因此可大规模植苗。 0005 目前， 还未有一种适用圆叶鸟巢。
8、蕨组织培养并快速繁殖的方法， 直接从叶子组织 培养。 发明内容 0006 有鉴于此， 本发明提供一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法， 包括以下步骤： 0007 (1)愈伤组织诱导： 将外植体材料清洗后， 在氯化汞溶液中表面灭菌7-10min， 用水 冲洗， 切成块状接种于诱导培养基， 45天后诱导产生愈伤组织； 外植体材料为未展开的圆叶 鸟巢蕨嫩叶， 诱导培养基成分为MS改良培养基、 1、 0-2.0mg/L 6-BA和0.5-1.0mg/L NAA； 0008 (2)增殖培养： 将愈伤组织接种于增殖培养基进行增殖， 增殖培养基成分为MS基本 培养基、 0.5-1.0mg/L 6-BA和0.1-0.。
9、5mg/L NAA。 0009 (3)孢子体诱导： 将增殖培养后的愈伤组织接种于分化培养基， 处理30天后获得发 芽的孢子体， 分化培养基成分为MS基本培养基， 0.4-0.5mg/L 6-BA和0.1-0.2mg/L NAA； 0010 (4)生根培养： 待孢子体的叶片长到2-3cm后， 接种于生根培养基培养成苗， 30d后 苗的基部长出棕色的根， 生根培养基成分为MS改良培养基、 0.1-0.2mg/L NAA、 10-20g/L蔗 糖和0.5-0.8g/L活性炭； 0011 (5)炼苗移栽： 待苗长有23条根， 高度在4cm以上时， 进行炼苗移栽， 置于太阳光 下炼苗5-7d后， 取出瓶。
10、苗， 洗净根部附着的生根培养基， 晾干并种植于灭菌后的培养基质 中， 培养基质为椰糠、 泥炭土和火山岩的混合物。 0012 本发明的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法， 通过培养基的改进， 通过培养基配方 改进， 愈伤组织诱导率为65.29， 增殖率为8.71， 分化率为达到88.35， 生根率达到 说 明 书 1/4 页 3 CN 105557515 B 3 91.21， 成活率达到95.3。 0013 本发明工艺流程简单， 以原叶体形式进行增殖， 可获得大量的原叶体， 通过增殖、 孢子体诱导、 生根、 移栽等过程， 获得大量可用于生产栽培的种苗， 且获得的种苗生理年龄 一致， 生长整齐， 适合工。
11、厂化育苗和规模化栽培。 附图说明 0014 图1为一种圆叶鸟巢蕨增殖培养效果图； 0015 图2为一种圆叶鸟巢蕨孢子体诱导培养效果图； 0016 图3为一种圆叶鸟巢蕨生根培养效果图； 0017 图4为一种圆叶鸟巢蕨炼苗移栽效果图。 具体实施方式 0018 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。 0019 本发明的MS基本培养基是实验室常用的培养基， MS改良培养基在基本培养基的基 础上改良， MS基本培养基包含1650mg/L NH4N03和1900mg/L KNO3， 1/2MS改良培养基包含 825mg/L NH4N03和950mg/L KNO3， 2/3MS改良培养基包含。
12、1100mg/L NH4N03和1266mg/L KNO3， 1/3MS改良培养基包含550mg/L NH4N03和633mg/L KNO3， 6-BA为6-苄氨基腺嘌呤， NAA为a-萘 乙酸。 0020 实施例一： 0021 1、 愈伤组织诱导培养： 以未展开的圆叶鸟巢蕨嫩叶为外植体材料， 用适量的洗洁 精清洗后， 在流水中冲洗0.5h， 在0.1氯化汞溶液中表面灭菌7min， 在无菌水中冲洗3次， 切成11cm大小接种于初始诱导培养基上， 诱导培养基成分为： 1/2MS改良培养基+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA， 处理接种30个外植体， 并重复3次。 45d诱导产生愈伤。
13、组织， 统计愈伤组 织诱导率。 0022 愈伤组织诱导率诱导出愈伤组织的外植体数/未污染外植体数100。 0023 2、 增殖培养： 愈伤组织接种于增殖培养基上， 成分为： MS基本培养基+1.0mg/L 6- BA+0.10mg/L NAA。 处理接种50个外植体， 并重复3次， 30d后观察， 统计其增殖率。 0024 增殖率愈伤组织鲜重/接种鲜重。 0025 3、 孢子体诱导培养： 愈伤组织接种于分化培养基中， 分化培养基成分为： MS基本培 养基+0.50mg/L 6-BA+0.20mg/L NAA。 处理接种50个外植体， 并重复3次， 30d后观察， 愈伤组 织分化出叶片， 形成丛。
14、生芽。 统计分化率， 分化率已分化植株总数/外植体总数100。 0026 4、 生根培养： 待孢子体的叶片长到2-3cm后接种于生根培养基上培养， 生根培养基 成分为： 1/2MS改良培养基+0.2mg/L NAA+蔗糖20g/L+活性炭0.5g/L， 处理接种30个外植体， 并重复3次。 30d后在苗的基部形成棕色的根， 根上有根毛和叉根， 统计其生根率， 平均根数 为3.740.03。 0027 生根率生根苗数/接种数100； 0028 平均根数生根条数/生根苗数。 0029 5、 炼苗移栽： 待无菌苗长有23条根， 高度在4cm以上时， 进行炼苗移栽， 揭开培养 瓶的瓶盖， 于室内自然光。
15、下炼苗5d后， 小心取出瓶苗， 洗净根部附着的培养基， 稍晾干， 种植 说 明 书 2/4 页 4 CN 105557515 B 4 于灭好菌的1:1:1的椰糠， 泥炭土， 火山岩的基质中。 温度控制在24-26， 湿度保持在90 左右， 统计其成活率。 施肥： 1520d后幼苗生新根， 晴天上午采用0.20.3尿素溶液喷 雾后， 并用清水淋洗， 每7d施肥1次。 病虫害防治： 利用500倍多菌灵(50)、 600倍甲霜灵复 合防病， 利用菊酯类杀虫剂除虫。 0030 实施例二： 0031 1、 愈伤组织诱导培养： 以未展开的圆叶鸟巢蕨嫩叶为外植体材料， 用适量的洗洁 精清洗后， 在流水中冲洗。
16、0.5h， 在0.1氯化汞溶液中表面灭菌10min， 在无菌水中冲洗3-5 次， 切成11cm大小接种于初始诱导培养基上， 诱导培养基成分为： 1/2MS改良培养基+ 1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA， 处理接种50个外植体， 并重复3次。 45d诱导产生愈伤组织， 统 计愈伤组织诱导率。 愈伤组织诱导率诱导出愈伤组织的外植体数/未污染外植体数 100。 0032 2、 增殖培养： 愈伤组织接种于增殖培养基上， 成分为： MS基本培养基+1.0mg/L 6- BA+0.1mg/L NAA。 处理接种50个外植体， 并重复3次， 30d后观察， 统计其增殖率。 圆叶鸟巢蕨 增殖培。
17、养的效果如图1所示。 0033 增殖率愈伤组织鲜重/接种鲜重。 0034 3、 孢子体诱导培养： 愈伤组织接种于分化培养基中， 分化培养基成分为： MS基本培 养基+0.40mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA。 处理接种50个外植体， 并重复3次， 30d后观察， 愈伤组 织分化出叶片， 形成丛生芽。 统计其分化率， 分化率已分化植株总数/外植体总数 100。 圆叶鸟巢蕨孢子体诱导培养效果如图2所示。 0035 4、 生根培养： 待孢子体的叶片长到2-3cm后接种于生根培养基上培养， 生根培养基 成分为： 1/2MS改良培养基+0.1mg/L NAA+蔗糖10g/L+活性炭0.8g/L。
18、， 处理接种30个外植体， 并重复3次。 30d后在苗的基部形成棕色的根， 根上有根毛和叉根， 统计其生根率， 平均根数 为3.740.03。 圆叶鸟巢蕨生根培养效果如图3所示。 0036 生根率生根苗数/接种数100； 0037 平均根数生根条数/生根苗数。 0038 5、 炼苗移栽： 待无菌苗长有23条根， 高度在4cm以上时， 进行炼苗移栽， 揭开培养 瓶的瓶盖， 于室内自然光下炼苗5-7d后， 小心取出瓶苗， 洗净根部附着的培养基， 稍晾干， 种 植于灭好菌的1:1:1的椰糠， 泥炭土， 火山岩的基质中。 温度控制在24-26， 湿度保持在 90左右， 统计其成活率。 施肥： 1520。
19、d后幼苗生新根， 晴天上午采用0.20.3尿素溶 液喷雾后， 并用清水淋洗， 每7d施肥1次。 病虫害防治： 利用500倍多菌灵(50)、 600倍甲霜 灵复合防病， 利用菊酯类杀虫剂除虫。 圆叶鸟巢蕨炼苗移栽效果如图4所示。 0039 实施例三： 0040 实施例三和实施例一的区别在于： 愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用1/ 3MS改良培养基； 生根培养步骤的生根培养基也选用1/3改良培养基。 0041 实施例四： 0042 实施例四和实施例一的区别在于： 愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用2/ 3MS改良培养基； 生根培养步骤的生根培养基也选用2/3改良培养基。 0043 对比例1：。
20、 0044 对比例1与实施例1的区别在于： 愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用MS基本 说 明 书 3/4 页 5 CN 105557515 B 5 培养基； 生根培养步骤的生根培养基也选用MS基本培养基。 0045 对比例2: 0046 对比例2与实施例1的区别在于： 愈伤组织诱导培养步骤的诱导培养基选用MS基本 培养基， 增殖培养步骤选用MS基本培养基+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L。 0047 将实施例1-4、 对比例1-2的生长情况记录， 结果汇总成表1. 0048 表1 0049 0050 本发明的一种圆叶鸟巢蕨的组培快繁方法， 通过培养基配方改进和培养条件的改 变，。
21、 愈伤组织诱导率为65.29， 增殖率为8.71， 分化率为达到88.35， 生根率达到 91.21， 成活率达到95.3。 0051 本发明工艺流程简单， 以原叶体形式进行增殖， 可获得大量的原叶体， 通过增殖、 孢子体诱导、 生根、 移栽等过程， 获得大量可用于生产栽培的种苗， 且获得的种苗生理年龄 一致， 生长整齐， 适合工厂化育苗和规模化栽培。 0052 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说， 在不脱 离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105557515 B 6 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 105557515 B 7 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 105557515 B 8 。