技术领域
本发明涉及一种大豆胜肽的制备方法，特别是，涉及一种大豆胜肽-钙螯 合物的制备方法。
背景技术
大豆的食用有悠久的历史，大豆的营养价值高，富含蛋白质、纤维，而 且存在许多功能性成份维护身体健康，包括植物固醇可以降低胆固醇，异黄 酮舒缓妇女更年期症状，维生素E和皂素提供抗氧化功能。对于素食者更是 获取营养很好的食物选择。近年来，西方社会也大力提倡大豆产品，大豆的 健康形象与日俱增。
在华人日常生活中豆浆是非常普遍的食品，但是与牛奶相比较，豆浆的 钙含量明显偏低，根据美国农业部资料，一般牛奶的钙含量为113毫克/100 公克，豆浆钙含量仅39毫克/100公克(USDA，2008)。如果在传统市场或早餐 店面的家庭式自制豆浆可能掺水疑虑增加，钙含量会更低，所获得钙更有限。 所以，对于经常食用豆浆产品的族群来说，摄取钙量需求特别大。
钙在人体生理、生化机能中扮演许多重要角色，包括组成骨骼的主要元 素、血液凝结、肌肉收缩、酸碱平衡、维护细胞膜的通透性、血压调控、参 与许多酶反应等，是一不可缺少的营养素。人体生长发育持续着吸取钙质， 储存”骨本”，一直到35至45岁达到最高峰，然后随着年龄增长骨钙渐渐 流失，女性更年期后流失速度更快(Bronner.et al.，1999)。因此，人终其一生 必须时时注意钙质的摄取，因为钙质必须从日常膳食中获取，无法自行制造。 根据居民营养调查显示，台湾地区男性平均摄取量为520mg，女性平均为542 mg，若以美国RDA(1200mg)或RDI(1300mg)的标准来衡量，是严重摄取不 足。基于国人钙质普遍缺乏，卫生署在2002年修订的「国人膳食营养素参考 摄取量」，就大幅修正钙质的摄取量，从原本的成人每天600毫克，提高到 800～1000毫克(http://www.doh.gov.tw)。而且，近年来老年人骨折的频率增 高，与钙质的摄取量不足，导致骨骼疏松有相当大的关联。据卫生署调查发 现，台湾地区六十五岁以上的人口，每九人即有一人罹患骨质疏松症，其中 女性更高达每四人就有一人(http://www.doh.gov.tw)。所以改善骨骼健康，首 要任务即是摄取足够的钙质。
一般较熟悉的钙来源是由乳制品提供，但许多人有乳醣不耐症，此外， 在台湾地区，乳制品的人均消费量较西方国家少很多，此也是降低钙摄取总 量的原因。
研究发现，乳制品中的酪蛋白(casein)在经过胃及肠的蛋白分解酶分解 后会产生抑制钙离子在碱性环境下沉淀的胜肽成分，称之为酪蛋白磷酸肽 (Caseinophosphopeptide，CPP)。钙离子在小肠的吸收，除了在少部份(15-20％ 重量百分比)在前端的十二指肠部分是需要维生素D的主动运输，大多数钙 离子进入人体循环系统，靠的是空肠和回肠段的被动运输(60-65％重量百分 比)(Bronner，F.1998.Calcium Absorption-A Paradigm for Mineral Absorption J.Nutr.128：917-920；Bronner，F.and Pansu，D.1999.Nutritional Aspects of Calcium Absorption.J.Nutr.129：9-12)。由于小肠后段的pH值为 弱碱性，因此在含有SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列的CPP胜肽片段存在时， 就可维持钙离子的溶解状态并进行穿透肠细胞间隙的被动运输(Ferraretto，A.. Signorile，A Gravaghi，C.Fiorilli，A.and Tettamanti，G.2001.Casein Phosphopeptides Influence Calcium Uptake by Cultured Human Intestinal HT-29 Tumor Cells J.Nutr.131：1655-1661)。为了避免缺乏钙导致骨质疏松等疾病 的发生，除了增加钙的摄取外，增加钙的吸收率也是一好方法，然而，乳醣 不耐症患者不适合利用乳制品中的酪蛋白来促进钙吸收。
因此，对豆浆产品补充钙源成为产品开发的重要商机。在技术层面上， 强化钙豆浆在制造时，添加钙存在加工障碍，因为豆浆中大豆蛋白会因添加 的钙离子引起疏水性聚集现象，进而使大豆蛋白沉淀。解决此种加工问题， 添加螯合剂与钙离子形成稳定结构，降低大豆蛋白沉淀是常用的方法。例如 六偏磷酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢钠等皆是常用豆浆化学添加物，提高产品稳 定性(Pathomrungsiyounggul，et al.，2010)。在健康意识的提高下，食品加工领 域中添加物的使用需格外留意，不必要的化学物添加物应避免，取而代之的 天然配料或添加物则是较安心的考量。
过去，已有学者提出以化学合成的方式产生单一种促钙吸收胜肽，然而 其成本相当高，较难实际运用(Galzigna，L.，Domergue，N.，Previero，A.1998.A synthetic calcium-chelating L-glutamyl-L-serine phosphate(Glu-Ser.P)enhances calcium absorption in the rat.J Pept Res.52(1)：15-18)。另外，尚有学者提出以 化学添加物做为螯合剂或稳定剂达成豆浆强化钙的目的 (Pathomrungsiyounggul，P.，Lewis，M.J.and Grandison，A.S.2010.Effects of calcium-chelating agents and pasteurization on certain properties of calcium-fortified soy milk.Food Chem.118：808-814；Luhadiya，A.P.C.，Yang， D.K.，Heisey，M.T.2006.Calcium fortified beverages.US Patent 6994877 B2)， 然而化学添加物仍有安全上的考量，不比天然螯合剂，且其中Luhadiya et al. 的产品最后的酸碱值为碱性8.25，较难实际饮用。此外，也有学者提出以化 学添加物柠檬酸钠做为螯合剂来制作加钙豆浆(目野和荒木，2005)。大陆 专利CN 101161114 B中揭露了利用商业蛋白分解酶水解大豆蛋白产生大豆 胜肽来制造大豆胜肽-钙混合物，但其成本较高。
综上所述，人们亟需一种低制造成本，并可以让乳醣不耐症患者食用的 增加钙的吸收率，符合实用性且无安全疑虑的豆浆饮品。
发明内容
本发明提供一种大豆胜肽-钙螯合物的制备方法，其步骤包括：将一含有 大豆蛋白的原料与水混合，以形成一含水量约45％-65％重量百分比的混合 物；将一曲菌菌群接种于上述混合物得到一培养物，其中，上述曲菌菌群包 括：米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)或它们混合 物，且上述曲菌菌群的接种量占上述大豆蛋白原料重量的约0.006％-0.05％； 将上述培养物进行固态发酵得到一发酵产物，其中，上述固态发酵的条件包 括：相对湿度约85％-95％和发酵温度介于约摄氏23～35度；将上述发酵产物 进行水解反应得到一大豆水解液；将上述大豆水解液依次进行澄清化处理和 固液分离后得到一大豆澄清水解液；以及于上述大豆澄清水解液直接加入钙 离子混合，其中，大豆胜肽和钙离子的摩尔数比为2∶1～0.5∶1，并调整含水 量至60～65％重量百分比，及pH值介于6.5～7，获得一含有大豆胜肽-钙螯合 物的液体。
本发明另提供一种大豆胜肽-钙螯合物的制备方法，其步骤包括：将一含 有大豆蛋白的原料与水混合，以形成一含水量约45％-65％重量百分比的混合 物；将一曲菌菌群接种于上述混合物得到一培养物，其中，上述曲菌菌群包 括：米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)或它们的混 合物，且上述曲菌菌群的接种量占上述大豆蛋白原料重量的约 0.006％-0.05％；将上述培养物进行固态发酵得到一发酵产物，其中，上述固 态发酵的条件包括：相对湿度约85％-95％和发酵温度介于约摄氏23～35度； 将上述发酵产物进行水解反应得到一大豆水解液；将上述大豆水解液依次进 行澄清化处理和固液分离后得到一大豆澄清水解液；将上述大豆澄清水解液 与大豆油和卵磷脂均匀混合，其中，大豆油的浓度为大豆水解液固形物的2～8 ％重量百分比，卵磷脂的浓度为大豆油的0.01～0.05％重量百分比，得到一混 合物；将上述混合物进行干燥得到一大豆胜肽粉末；将该大豆胜肽粉末和钙 离子溶于水中，其中，该大豆胜肽粉末中的大豆胜肽和钙离子的摩尔数比例 为2∶1～0.5∶1，并调整含水量至60～65％重量百分比，及pH值介于6.5～7， 获得一含有大豆胜肽-钙螯合物的液体。
本发明还提供一种钙强化豆浆的制备方法，其是将前述大豆胜肽-钙螯合 物添加于豆浆中。
本发明还提供一种钙强化豆浆，由前述钙强化豆浆的制备方法制造而得， 其中，上述钙强化豆浆的钙含量大于40mg/100mL。
附图说明
图1为比较大豆蛋白水解液与酪蛋白磷酸肽抑制碳酸钙结晶的效果。
图2为不同蛋白源物质抑制碳酸钙结晶的效果。
图3显示喂食促钙吸收胜肽与大豆蛋白饲料的老鼠的钙吸收率，平均值 ±95％信任区间，两者间具有显著差异(p＜0.05)。
具体实施方式
为了使本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特 举优选实施例，作详细说明如下。
本发明提供一种大豆胜肽-钙螯合物的制备方法。在一实施例中，将大豆 粉以曲菌进行固态发酵分解后，再进行水解反应，然后进行澄清步骤，得到 澄清的水解液，之后于上述大豆澄清水解液直接加入氯化钙加以混合，并调 整含水量及pH值，获得一含有大豆胜肽-钙螯合物的液体。在另一实施例中， 可将上述大豆澄清水解液进行一制粉步骤，再将上述大豆胜肽粉和钙离子加 水混合搅拌溶解，调整酸碱值，制成一含有大豆胜肽-钙螯合物的胜肽产物。
本发明是利用大豆来制造大豆胜肽，其原理是利用米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)或混合上述菌种而成的曲菌菌群来处 理含有大豆蛋白的原料，以进行固态发酵，其中，上述大豆蛋白的来源包括 但不限于大豆粉、脱脂大豆粉、脱脂大豆片、大豆分离蛋白、大豆粕、豆饼、 或它们的组合。在一实施例中，上述曲菌接种量占原料总重量的约 0.006％-0.05％，优选为约0.008％～0.02％，更优选为约0.013％。在上述固态 发酵中，可使用各种缓冲液，例如：柠檬酸-柠檬酸钠、乙酸-乙酸钠、 K2HPO4-KH2PO4、Na2HPO4-NaH2PO4、硼酸-氢氧化钠、三羟甲基甲氨基丙磺 酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙 酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、 3-(N-吗非啉)乙磺酸 哌嗪-N，N′-二(2-乙磺酸)、二甲基胂酸 柠檬酸钠、 2-吗啉乙磺酸等，调节固态发酵所需的水分，其所需的水分占原料与水混合 物总重的约45％-65％，优选为约50％～60％，更优选为约55％。在一实施例 中，上述固态发酵可在pH值约5～7；相对湿度约85％-95％；发酵温度介于 约摄氏23～35度；发酵的时间约2～5天的条件下进行。
接着，将上述发酵产物进行水解反应，以得到大豆水解液。在一实施例 中，上述水解反应的进行步骤包括：将上述发酵产物与水以重量比约1∶1～1∶3 的比例混合，优选为约1∶2；水解的时间为约3-24小时，优选为约6小时； 水解温度介于约摄氏30-65度，优选为约摄氏45度。之后，再提高反应温度 至约摄氏90-95度以抑制酶活性。
之后，再将上述大豆水解液进行固液分离等澄清化处理。例如，可先使 用压榨机，以油压方式使之固液分离。然后液体加热90℃、10分钟后产生的 沉淀，再以高速离心机去除沉淀，最后使用板框式压滤机或是使用微过滤膜 过滤水解液，并收集含有上述含有促进钙吸收的胜肽的水解液。
接着，将所得水解液与钙离子进行螯合，也可将所得水解液经过一制粉 步骤再与钙离子进行螯合，制备成各种形式的大豆胜肽-钙螯合物的胜肽产 物。应了解的是，本领域技术人员也可使用任何其它适当的固液分离方式， 以及其它适当的过滤手段。
在一实施例中，上述水解液与钙离子进行螯合的步骤，可包括：于上述 大豆澄清水解液直接加入钙离子混合，上述钙离子的来源可选自但不限于由 下列所组成的群组：无机钙(例如氯化钙、碳酸钙、磷酸钙)、有机钙(例 如乳酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙)以及它们的组合，其中，大豆胜肽和钙 离子混合的摩尔数比为2∶1～0.5∶1、优选为1∶1，并调整含水量至60～65 ％、优选为65％，及pH值介于6.5～7、优选为6.7，获得一含有大豆胜肽- 钙螯合物的液体。
在另一实施例中，上述水解液与钙离子进行螯合的步骤，可包括：将上 述澄清大豆水解液使用真空减压浓缩机处理以取得高浓度大豆水解液(固形 物40-60％重量百分比)，添加大豆油为2-8％，最优选为约5％重量百分比(以 大豆水解液固形物为100％重量百分比)和卵磷脂为0.01％-0.05％，最优选为 约0.02％重量百分比(以大豆油重为100％重量百分比)，使用超高速均质机 充分混合，接着以喷雾干燥机进行干燥，条件为入口温度145-160℃，优选为 150-155℃；出口温度85-110℃，优选为90-105℃；转速35-40Hz，优选为40Hz， 得到一大豆胜肽粉，接着将上述大豆胜肽粉和钙离子加水于温度25-50℃、优 选室温下混合搅拌溶解，上述钙离子的来源可选自由下列所组成的群组，但 不限于：无机钙(例如氯化钙、碳酸钙、磷酸钙)、有机钙(例如乳酸钙、 柠檬酸钙、葡萄糖酸钙)以及它们的组合，其中，胜肽螯合钙的大豆胜肽和 钙离子的摩尔数比例为2∶1～0.5∶1、优选为1∶1，并调整含水量至60～65％、 优选为65％，及调整酸碱值pH 6.5～7、优选为pH 6.7，制成大豆胜肽-钙螯合 物的胜肽产物。
在一实施例中，本发明钙强化豆浆的制备可包括：取不同量的由上述制 造方法所得到的大豆胜肽-钙螯合物添加至市售豆浆混合搅拌。采用本发明的 制备方法所得的钙强化豆浆的钙含量可大于约40mg/100ml，优选介于约 40～90mg/100ml。在一钙含量40mg/100ml的市售豆浆的实施例中，当添加钙 含量达60mg/100ml豆浆时，豆浆容易变稠，大豆蛋白因钙离子产生凝聚现象， 浓度愈高凝聚现象愈显著，且易有蛋白沉淀分层产生。优选可使添加钙含量 50mg/100ml豆浆以下，其外观、口感皆佳，且此时所得钙强化豆浆产品最高 钙含量约可达90mg/100ml，接近牛奶的钙含量(约113mg/100ml)。
本发明所提供的钙强化豆浆的制备方法采用的大豆蛋白原料取得容易且 成本低廉，并具有可以让乳醣不耐症患者食用的增加钙吸收率的优点，是符 合实用性且无安全疑虑的豆浆饮品，可提供消费者高于一般豆浆，甚至接近 于牛奶所含的钙含量。
【实施例】
实施例1.促进钙吸收大豆胜肽的制造
以脱脂大豆粉为原料，接种酱油曲霉(Aspergillus sojae)，其中曲菌接 种量为大豆原料总重量的0.013％，以重量百分浓度0.25％的CH3COONa/ 0.25％HNaSO3、pH＝5.8的缓冲液调节水分至55％，在25～30℃、相对湿度 95％以上的环境培养2天。
接着进行水解反应，将大豆曲加水混合，其中，大豆曲与水的比例为1∶ 2，水解时间为6小时，水解温度45℃，再提高温度至90-95℃，维持10分 钟，以抑制酶活性。
接着，进行水解液的澄清化处理，先使用压榨机，将大豆水解物置于滤 袋中，平铺于压榨槽，以油压方式使之固液分离。然后液体加热90℃、10 分钟后产生的沉淀，再以离心高速离心机(转速16000rpm，台中，泉泰公司 制造)去除沉淀，最后使用板框式压滤机过滤(Seitz Orion，德国制造)或是 使用微过滤膜(0.3μm)过滤水解液，得到澄清的大豆水解液。
实施例2.大豆水解液抑制碳酸钙沉淀的效果
根据Jin等人(J.Agnc.Food Chem.2000)碳酸钙结晶实验略加修改，将 1mL样品与1mL浓度40mM的氯化钙和1.2mL蒸馏水混合，然后加入0.8 mL浓度40mM碳酸氢钠后反应1小时，并使用0.1N氢氧化钠滴定维持 pH＝8.5。将结束反应的混合液进行离心(离心力为2000g)，取上清液并使 用测钙试剂组(台湾默克公司产物)测量钙浓度，此为可溶钙含量。
抑制碳酸钙结晶实验中，由实施例1所得的大豆蛋白水解液对于碳酸钙 结晶有抑制效果，此效果的评估是在碱性条件(pH＝8.5)下，完全抑制碳酸 钙结晶的最低样品浓度，如果发生碳酸钙沉淀，上清液的钙含量则降低；反 之，上清液的钙含量则不变。图1为比较大豆蛋白水解液与酪蛋白磷酸肽抑 制碳酸钙结晶的效果，其结果显示有助于钙吸收的酪蛋白磷酸肽蛋白(CPP) 最低抑制浓度为1.76×10-4％，而本发明的大豆蛋白水解液的蛋白最低抑制 浓度为2.16×10-3％。
实施例3.大豆水解液抑制的效果
在本实施例中，选择不同蛋白来源物质做比较，将1mL样品与1mL浓 度40mM的氯化钙和1.2mL蒸馏水混合，然后加入0.8mL浓度40mM碳酸 氢钠后反应1小时，并使用0.1N氢氧化钠滴定维持pH＝8.5。将结束反应的 混合液进行离心(离心力为2000g)，取上清液并使用测钙试剂组(台湾默 克公司产物)测量钙浓度，并在碱性条件(pH＝8.5)下，完全抑制碳酸钙结 晶的最低样品浓度作为可溶钙含量的评估标准。
图2为不同蛋白源物质抑制碳酸钙结晶的效果。其中，游离氨基酸如谷 氨酸钠盐(monosodium glutamate，MSG)、甘氨酸(glycine)的抑制效果较 差；接着是蛋白质如大豆分离蛋白(isolated soy protein，ISP)、酪蛋白(casein)， 鸡精(essence of chicken，市售产物，为鸡肉蛋白抽取物)，其抑制碳酸钙沉 淀的效果优于前两类；而本发明的大豆蛋白水解液(soy hydrolysate)最佳。 可见单一的游离氨基酸或者是完整蛋白质与钙离子螯合的情形不如蛋白质水 解物，蛋白质经过程度不同的水解后，它们具有较好的抑制钙沉淀效果。因 此，以胜肽型式的蛋白食材例如鸡精，还有本发明利用曲菌酶分解大豆蛋白 水解液皆是不错的抑钙沉淀辅剂。
实施例4.促钙吸收胜肽对动物钙吸收的效果
实验方式类似赖爱姬的论文(台湾营养学会杂志，第21卷2期，1996)， 但略做修改，采用成年雌性鼠(Bltw：SD；购自乐斯科生物科技股份有限公司) 饲养于各自独立的代谢笼中，室温维持在23±2℃，光照12小时，禁食 一天待体内食物排除后，分别提供添加大豆分离蛋白作为对照组和提供促钙 吸收胜肽作为实验组，每组样本数各为10只，令动物任意摄食，每日收取粪 便，6天后取走饲料，秤其所吃的总量，再等待一天排除吃的饲料后，收集 及分析其排出粪便中的钙含量。钙的分析法为以硝酸做硝化反应后，以原子 吸光仪测定。
钙的总摄取量以吃的饲料量乘饲料中钙的含量推估。钙的吸收率为(总 摄取量-粪便中的钙含量)/总摄取量。
图3显示喂食促钙吸收胜肽与大豆蛋白饲料的老鼠的钙吸收率。比较大 豆蛋白和促钙吸收胜肽的吸收率发现，促钙吸收胜肽的吸收率明显高于大豆 蛋白，平均值±95％信任区间，两者间具有显著差异(p＜0.05)。
表1、大豆分离蛋白(对照组)及促钙吸收胜肽(实验组)的饲料配方 (每2000克饲料中各成分的量，单位为克)。
实验组 对照组 蛋白质(Protein) 促进钙吸收的胜肽产物 500 0 大豆分离蛋白(ISP) 0 334 酪蛋白(Casein) 108 108 大豆油(Soy oil) 200 200 蔗糖(Sucrose) 1108 1108 羧甲基纤维素(CMC) 0 166 矿物质(Mineral) 60 60 维生素(Vitamin) 20 20 胆碱(Choline) 4 4 总合(Total) 2000 2000
实施例5.大豆胜肽粉末的制备方法
将实施例1中所得的澄清大豆水解液使用真空减压浓缩机处理取得高浓 度大豆水解液(固形物40％)，添加大豆油为大豆水解液固形物总重量的5％ 和卵磷脂为大豆油总重量的0.02％，使用超高速均质机充分混合，接着以喷 雾干燥机进行干燥，条件为入口温度150℃、出口温度90℃、转速40Hz，制 成大豆胜肽粉末。
实施例6.钙强化豆浆的制备
将实施例5所得的大豆胜肽粉39.42公克和9公克氯化钙加水90公克于 室温下混合搅拌溶解，由大豆胜肽粉、氯化钙、水形成的胜肽螯合钙的比例 为4.38∶1∶10(重量比)，调整酸碱值pH6.7，然后取不同量的螯合钙溶液添加至 市售豆浆(无糖豆浆，义美公司生产制造，台湾)混合搅拌。最后产品的感 官品评和钙含量如表所示(表2)，使用测钙试剂组(台湾默克公司产品)测量钙 浓度。在添加钙含量60mg/100ml豆浆时，明显感觉豆浆变稠，大豆蛋白因钙 离子产生凝聚现象，浓度愈高凝聚现象愈显著，且有蛋白沉淀分层产生。最 佳的产品品质是在添加钙含量50mg/100ml以下，它们的外观、口感皆佳，钙 强化豆浆产品最高钙含量接近牛奶(90mg/100ml；牛奶钙含量大约113 mg/100ml)。
表2、不同钙添加量至豆浆的感官品评
添加钙含量mg/100ml豆浆 外观 口感 30 均匀 平顺 40 均匀 平顺 50 均匀 浓郁 60 微颗粒状 粘稠感 70 微颗粒状 粘稠感 80 微颗粒状 粘稠感 100 分层(隔天) 豆腐泥感觉
义美公司无糖豆浆原始钙含量40mg/100ml
虽然本发明公开了如上所述的优选实施例，但这些实施例并非用以限定 本发明，本领域技术人员应该理解在不脱离本发明的精神和范围内，可作些 许的更动与润饰，因此，本发明的保护范围应当视权利要求书要求保护的范 围为准。