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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811483277.9 (22)申请日 2018.12.06 (71)申请人 曲靖师范学院 地址 655000 云南省曲靖市珠源西路 (72)发明人 吴丽芳 李应 魏晓梅 韩利红 王俊杰 田雪莲 张丽芳 (74)专利代理机构 云南省曲靖市专利事务所 53104 代理人 周厚明 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种利用天蓝苜蓿花药快速获得单倍体苗 的方法 (57)摘要 本发明属于植物组织培养技术领域， 具体涉 及一种利用天蓝苜蓿。
2、花药快速获得单倍体苗的 方法。 包括： 1、 通过双重表面杀菌， 获得无菌外植 体； 2、 获取能够快速形成愈伤组织的最佳发育期 的外植体； 3、 获得最适宜天蓝苜蓿花药愈伤组织 诱导培养； 4、 愈伤组织增殖培养； 5、 愈伤组织分 化培养； 6、 单倍体苗壮苗生根培养； 7、 单倍体苗 倍性鉴定最终快速获得基因成单的花培植株。 该 发明旨在建立天蓝苜蓿花药培养再生体系， 为规 模化繁育天蓝苜蓿单倍体苗， 提供快速高效获得 的方法。 采用不同培养基， 不同生长调节剂组合， 培养条件的调控， 避免了愈伤组织和分化幼苗的 污染、 褐化及玻璃化。 权利要求书1页 说明书2页 CN 10927557。
3、4 A 2019.01.29 CN 109275574 A 1.一种利用天蓝苜蓿花药快速获得单倍体苗的方法， 包括以下步骤： 步骤一 获得无菌外植体， 将花蕾用自来水冲洗30min， 洁净工作台上先用75%乙醇的浸 泡30s后， 转入0.1%的HgCl2溶液中并滴加2滴吐温80消毒10min， 无菌水冲洗4-6次后剥出花 药接种； 步骤二 获取能够快速形成愈伤组织的最佳发育期的外植体， 包括： 现蕾5d、 10d、 15d、 20d、 25d和30d的花药表面灭菌后， 接种于NB + 2,4-D 1.0 mgL-1 + NAA 0.5 mgL-1 + 6-BA 0.5 mgL-1 + TDZ 。
4、1.0 mgL-1+蔗糖 40 gL-1 +植物凝胶 3gL-1， pH5.8的培养基， 培养30d愈伤组织形成后， 比较愈伤组织诱导率， 培养条件为： 先暗 培养15d， 再在10mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251； 现蕾20d左右的花药， 经4低温分别处理0、 2、 4、 6、 8d后， 接种于NB + 2,4-D 1.0 mgL-1 + NAA 0.5 mgL-1 + 6-BA 0.5 mgL-1 + TDZ 1.0 mgL-1+蔗糖 40 gL-1 +植 物凝胶3gL-1， pH5.8的培养基， 培养30d愈伤组织形成后， 比较愈伤组织诱导率； 步骤三 愈。
5、伤组织诱导培养， 将获得的最佳发育期和最佳预处理的外植体接种于愈伤 组织诱导培养基上， 培养30d愈伤组织形成后， 比较愈伤组织诱导率， 培养条件为： 愈伤组织 诱导先暗培养15d， 再在10mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251， 培养基具 体参数： NB + 2,4-D 1.0 mgL-1 + NAA 0.5 mgL-1 + 6-BA 0.5 mgL-1 + TDZ 1.0 mgL-1+蔗糖 40 gL-1 +植物凝胶3gL-1， 灭菌前将pH调整为5.8-6.0； 步骤四 愈伤组织增殖培养， 将诱导得到的愈伤组织转入增殖培养基， 培养基参数为NB + 2,4-D。
6、 0.5 mgL-1 + NAA 1.0 mgL-1 + 6-BA 0.5 mgL-1 + TDZ 0.25 mgL-1 + PVP 2.O gL-1+ 蔗糖30gL-1 +植物凝胶3gL-1, pH5.8， 每20 d增殖培养1次， 共培养3次， 培 养条件为： 15mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251； 步骤五 愈伤组织分化培养， 将增殖良好的愈伤组织接种于分化培养基中， 培养基参数 分别为： NB、 MS、 B5为基本培养基， NAA 0.5、 1.0 mgL-1， 6-BA 0.5 、 1.0、 2.0、 3.0 mgL-1 ， 蔗糖30gL-1 ， 谷氨酰。
7、胺100 mgL-1， 植物凝胶3gL-1, pH5.8， 接种愈伤组织3-4块愈伤 组织， 培养条件为： 25 mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251； 步骤六 壮苗生根培养， 将分化得到的芽转入1/3MS 、 1/2MS和MS培养中， 添加 0-1.0 mgL-1的 NAA， 蔗糖30gL-1 ， 植物凝胶3gL-1, pH 5.8进行生根培养， 培养条件为： 30 mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251； 步骤七 单倍体苗倍性鉴定， 花培植株根长至2cm时， 用0.1 gL-1的秋水仙素进行低温 预处理4-6h， 放入卡诺固定液中固定2。
8、0-24h， 之后用1 molL-1 HCl 60水浴锅中解离至 根尖软化， 最后用改良苯酚品红染液染色压片镜鉴， 每个材料计数10个细胞， 鉴定再生植株 的染色体。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 109275574 A 2 一种利用天蓝苜蓿花药快速获得单倍体苗的方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养技术领域， 具体涉及一种利用天蓝苜蓿花药快速获得单 倍体苗的方法。 背景技术 0002 天蓝苜蓿(Medicago lupulina L. )为豆科苜蓿属一年生、 两年生或越年生草本， 在我国天然分布非常广泛， 遍及东北、 华北、 西北及西南等地区。 天蓝苜蓿耐旱、 耐寒、 。
9、耐瘠 薄、 耐酸性土壤， 主茎细长， 茎多、 分枝、 茎下部倾斜， 上部直立， 半匍匐生长， 可作为优良的 草坪绿地植物及冬季补偿绿肥植物， 粗蛋白含量高， 茎叶丰富， 草质柔软， 属于优质的饲草 饲料。 天蓝苜蓿根、 茎、 叶中均含有皂苷， 具有降血脂、 抗炎及抗癌作用。 0003 在离体培养中， 国外早在1982年Johnson等对它进行过原生质体培养， 但未得到再 生植株。 国内安利佳等利用子叶和胚轴诱导愈伤组织形成细胞系后， 采用改良K8p和Ay3培 养基,首次对天蓝苜蓿进行单细胞培养并得到再生植株。 张相岐等以悬浮系为材料， 首次经 过胚状体发生和器官发生两种途径获得天蓝苜蓿原生质体。
10、再生植株。 王海波等以野生天蓝 苜蓿种子无菌苗子叶、 下胚轴和种子苗叶片为外植体， 得到了再生植株。 而有关天蓝苜蓿花 药培养方面， 尚未见报道。 发明内容 0004 本发明提供一种利用天蓝苜蓿花药快速获得单倍体苗的方法， 旨在建立天蓝苜蓿 花药培养再生体系， 为规模化繁育天蓝苜蓿单倍体苗， 提供快速高效获得的方法。 0005 一种利用天蓝苜蓿花药快速获得单倍体苗的方法， 包括： 1、 通过双重表面杀菌， 获 得无菌外植体； 2、 根据天蓝苜蓿花药发育的不同时间， 获取能够快速形成愈伤组织的最佳 发育期的外植体； 3、 外植体小孢子经不同时间低温预处理及不同浓度生长调节剂的组合使 用， 获得最。
11、适宜天蓝苜蓿花药愈伤组织诱导培养、 愈伤组织增殖培养、 愈伤组织分化培养； 4、 单倍体苗壮苗生根培养； 5、 单倍体苗倍性鉴定最终快速获得基因成单的花培植株。 0006 本发明的有益效果： 1、 利用不同的消毒剂双重处理获得无菌的外植体， 减小了污 染。 2、 比较小孢子发育时期， 获得最佳发育期的花药。 3、 不同时间低温预处理， 大大提高了 花药脱分化形成愈伤组织的效率。 4、 正交设计四种激素组合， 获得了愈伤组织最佳的诱导 培养基， 有效提高了愈伤组织诱导率。 5、 愈伤组织继代1次， 获得大量增殖的愈伤组织， 避免 盲目增加继代次数。 6、 利用不同基本培养及激素组合分化培养和生根。
12、培养， 避免愈伤组织 褐化、 玻璃花及畸形苗， 建立了良好、 高效的培养体系， 最终获得了单倍体苗。 具体实施方式 0007 一种利用天蓝苜蓿花药快速获得单倍体苗的方法， 包括以下步骤。 0008 步骤一 获得无菌外植体： 将花蕾用自来水冲洗30min， 洁净工作台上先用75%乙醇 的浸泡30s后， 转入0.1%的HgCl2溶液中并滴加2滴吐温80消毒10min， 无菌水冲洗4-6次后剥 说 明 书 1/2 页 3 CN 109275574 A 3 出花药接种。 0009 步骤二 获取能够快速形成愈伤组织的最佳发育期的外植体， 包括： 现蕾5d、 10d、 15d、 20d、 25d和30d的。
13、花药表面灭菌后， 接种于NB + 2,4-D 1.0 mgL -1 + NAA 0.5 mgL-1 + 6-BA 0.5 mgL-1 + TDZ 1.0 mgL-1+蔗糖 40 gL-1 +植物凝 胶3gL-1， pH5.8的培养基， 每种组合接种24瓶， 每瓶接种花药8-10枚， 培养30d愈伤组织形 成后， 比较愈伤组织诱导率。 培养条件为： 先暗培养15d， 再在10mmolm-2s-1光下培养， 光 照16 hd-1， 温度251； 现蕾20d左右的花药， 经4低温分别处理0、 2、 4、 6、 8d后， 接种于NB + 2,4-D 1.0 mgL-1 + NAA 0.5 mgL-1 。
14、+ 6-BA 0.5 mgL-1 + TDZ 1.0 mgL-1+蔗糖 40 gL-1 +植 物凝胶3gL-1， pH5.8的培养基， 每种组合接种24瓶， 每瓶接种花药8-10枚， 培养30d愈伤组 织形成后， 比较愈伤组织诱导率。 0010 步骤三 愈伤组织诱导培养： 将获得的最佳发育期和最佳预处理的外植体接种于 愈伤组织诱导培养基上， 每瓶接种花药8-10枚， 培养30d愈伤组织形成后， 比较愈伤组织诱 导率。 培养条件为： 愈伤组织诱导先暗培养15d， 再在10mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251。 培养基具体参数： NB + 2,4-D 1.0 mgL-1。
15、 + NAA 0.5 mgL-1 + 6- BA 0.5 mgL-1 + TDZ 1.0 mgL-1+蔗糖 40 gL-1 +植物凝胶3gL-1， 灭菌前将pH调整 为5.8-6.0。 获得生长旺盛， 浅黄绿色， 松软黏稠， 部分愈伤上已有芽的分化的愈伤组织。 0011 步骤四 愈伤组织增殖培养： 将诱导得到的愈伤组织转入增殖培养基， 培养基参数 为NB + 2,4-D 0.5 mgL-1 + NAA 1.0 mgL-1 + 6-BA 0.5 mgL-1 + TDZ 0.25 mgL-1 + PVP 2.O gL-1+ 蔗糖30gL-1 +植物凝胶3gL-1, pH5.8， 每20 d增殖培养。
16、1次， 共培养 3次。 培养条件为： 15mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251。 获得愈伤组织 为浅黄白色、 夹杂浅绿色、 松散、 黏稠状且带有不定芽， 培养基中加PVP防止愈伤组织褐化。 0012 步骤五 愈伤组织分化培养： 将增殖良好的愈伤组织接种于分化培养基中， 培养基 参数分别设计为： NB、 MS、 B5为基本培养基， NAA 0.5、 1.0 mgL-1， 6-BA 0.5 、 1.0、 2.0、 3.0 mgL-1 ， 蔗糖30gL-1 ， 谷氨酰胺100 mgL-1， 植物凝胶3gL-1, pH5.8， 每瓶接种愈伤组 织3-4块愈伤组织。 培养条件。
17、为： 25 mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251。 获得的愈伤组织明显增大且黏性， 松散水浸状， 能分化出许多芽。 0013 步骤六 壮苗生根培养： 将分化得到的芽转入1/3MS 、 1/2MS和MS培养中， 添加 0- 1.0 mgL-1的 NAA， 蔗糖30gL-1 ， 植物凝胶3gL-1, pH 5.8进行生根培养。 培养条件为： 30 mmolm-2s-1光下培养， 光照16 hd-1， 温度251。 获得根系生长快， 根相对粗、 长、 分支多的健康植株小苗。 0014 步骤七 单倍体苗倍性鉴定： 花培植株根长至2cm时， 用0.1 gL-1的秋水仙素进行 低温预处理4-6h， 放入卡诺固定液中固定20-24h， 之后用1 molL-1 HCl 60水浴锅中解 离至根尖软化， 最后用改良苯酚品红染液染色压片镜鉴， 每个材料计数10个细胞， 鉴定再生 植株的染色体。 获得单倍体植株。 0015 上述具体实施方式中天蓝苜蓿现蕾15-25d 的花药愈伤组织诱导效果最好， 4低 温预处理2-4d有利于愈伤组织形成， 天蓝苜蓿花药愈伤组织诱导率高达78.5%， NB培养基上 愈伤组织分化率为66.3%， 1/3MS培养基生根率最高86.55%。 说 明 书 2/2 页 4 CN 109275574 A 4 。